Сложные белки это какие продукты: Сложные белки — это… Что такое Сложные белки?

Содержание

8 Простые и сложные белки

Простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.

Сложные белки – это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого про-стетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада.

Простые белки в свою очередь делятся на основании некоторых условно выбранных критериев на ряд подгрупп: протамины, гистоны, альбуминыглобулиныпроламины, глютелины и др. Классификация сложных белков (см. главу 2) основана на химической природе входящего в их состав небелкового компонента. В соответствии с этим различают фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту), хромопротеины (в состав их входят пигменты), нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты), 

гликопротеины (содержат углеводы),липопротеины (содержат липиды) и металлопротеины (содержат металлы).

Простые:

Протамин (protamine) — Низкомолекулярный (4-12 кД) основный ядерный белок. У многих животных протамин наряду с гистонамисодержится в сперматозоидах, а у некоторых (например, у рыб) полностью замещает гистоны. Присутствие протамина защищает ДНКот действия нуклеаз и придает хроматину компактную форму.

ГИСТОНЫ

 (от греч. histos-ткань), группа сильноосновных простых белков (р/ 9,5-12,0), содержащихся в ядрах клеток животных и растений. Предполагают, что Г. участвуют в переводе чрезвычайно длинных молекул хромосомной ДНК в форму, удобную для пространств. разъединения отдельных хромосом и их перемещения в ходе деления клетки. Полагают также, что Г. участвуют в механизмахтранскрипции и репликации.

АЛЬБУМИНЫ (от лат. albumen, род. падеж albuminis- белок), водорастворимые глобулярные белки, входящие в составсыворотки крови, цитоплазмы клеток животных и растений, молока. наиб. известны сывороточный и яичный А., а также лактальбумин (гл. компоненты соотв. сыворотки крови, яичного белка и молока).

Глобулин (globulin) — Глобулины – семейство глобулярных белков, растворимых в растворах солей, кислот и щелочей (полипептидные цепи свернуты в сферические или эллипсоидные структуры – глобулы). Глобулины участвуют в иммунных реакциях (иммуноглобулины), в свертывании крови (протромбин, фибриноген) и т.п.

ПРОЛАМИНЫ, запасные белки семян злаков (у пшеницы эти белки наз. птиалинами, у кукурузы-зеинами, у ячменя-гордеинами, у ржи-секалинами, у овса-авснинами). П. делятся на две группы-серосодержащие (S-богатые) и серо-несодержащие (S-бедные). Все эти белкикодируются семействами родственных генов, имеющих общего предшественника. Часто к П. относят также родственные им белки-глютенины (глутелины, или HMW). Все эти группы белков различаются по аминокислотному составу, содержат много остатковглутамина и пролина, мало остатков основных аминокислот (см. табл.).

Сложные:

ГЛИКОПРОТЕИНЫ (гликопротеиды), соед., в молекулах к-рых остатки олиго- или полисахаридов ковалентно связаны (О- или N-гликозидными связями) с полипептидными цепями белка. Г. широко распространены в природе. К ним относятся важные компонентысыворотки крови (иммуноглобулины, трансферины и др.), групповые в-ва крови, определяющие групповую принадлежность крови человека и животных, антигены мн. вирусов (гриппа, кори, энцефалита и др.), нек-рые гормоны, лектины, ферменты.

ИПОПРОТЕИНЫ (липопротеиды), комплексы, состоящие из белков (аполипопротеинов; сокращенно — апо-Л.) и липидов, связь между к-рыми осуществляется посредством гидрофобных и электростатич. взаимодействий. Л. подразделяют на свободные, или р-римые в воде (Л. плазмы крови, молока, желтка яиц и др.), и нерастворимые, т. наз. структурные (Л.мембран клетки, миелиновой оболочки нервных волокон, хлоропластов растений). Нековалентная связь в Л. между белкамии липидами имеет важное биол. значение. Она обусловливает возможность своб. обмена липидов и модуляцию св-в Л. ворганизме. Среди своб. Л. (они занимают ключевое положение в транспорте и метаболизме липидов) наиб. изучены Л.плазмы крови, к-рые классифицируют по их плотности. 

Простые и сложные белки — Справочник химика 21

    Строение белка. Различают простые и сложные белки. В настоящее время достигнут значительный прогресс в области изучения строения белка. Простой белок рассматривают как продукт поликонденсации аминокислот, т. е. как специфический природный полимер. Сложные белки состоят из простого белка и небелковых компонентов — углеводов, нуклеиновых кислот, липидов или других соединений. [c.175]
    Различают простые и сложные белки. Простой белок рассматривают как продукт поликонденсации аминокислот, т. е. как специфический природный полимер. Сложные белки состоят из простого белка и небелковых компонентов — углеводов, нуклеиновых кислот, липидов и других соединений. 
[c.199]

    Простые и сложные белки [c.47]

    В чем различие между простыми и сложными белками  [c.428]

    Учитывая необходимость для студента-медика основательного знакомства с отдельными группами белков, которые могут служить предметом изучения в его будущей профессиональной деятельности (например, белки крови), приводим старую классификацию белков с краткой характеристикой новых данных о структуре, составе и свойствах отдельных представителей. Согласно этой классификации, обширный класс белковых веществ в зависимости от химического состава делят на простые и сложные белки .  

[c.72]

    ФЕРМЕНТЫ — ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ [c.121]

    Какова роль печени в обмене углеводов, жиров, простых и сложных белков, в обмене минеральных веществ и воды  [c.256]

    Какие простые и сложные белки содержатся в мозговой ткани  [c.256]

    Глютелины — белки, нерастворимые в воде, солевых растворах и этиловом спирте, но растворяющиеся в слабых растворах щелочей (0,2—2,07о). Содержание этих белков в семенах различных растений достигает 1—3% веса семян. Глютелины изучены очень слабо, и некоторые исследователи считают, что эта фракция — смесь различных простых и сложных белков. 

[c.221]

    Перейдем к ознакомлению со свойствами важнейших представителей отдельных наиболее изученных групп простых и сложных белков. [c.50]

    Важнейшими конечными продуктами обмена простых и сложных белков, образующимися в тканях и органах, являются мочевина, мочевая кислота, креатин, креатинин, аммонийные соли, б и л и р у б и н и ряд других соединений. Эти конечные продукты азотистого обмена поступают в кровь из тканей и с током крови доставляются к почкам, откуда выводятся с мочой наружу. 

[c.442]

    Глютелины. Это белки, нерастворимые в воде и солевых растворах, но растворимые в слабых растворах щелочей. Изучены очень слабо, считают, что эта фракция является смесью различных простых и сложных белков. [c.36]

    В настоящей книге подробно не описываются отдельные типы белковых веществ, основное внимание здесь уделено ферментным белкам. О двух главных группах — растворимых (очень часто простых) и сложных белках — упоминается очень коротко. По своим свойствам и функциям растворимые белки очень разнообразны, иногда это просто питательные вещества для растущих тканей. Значительная часть этих белков наделена специфической биологической активностью — ферменты, антитела, гормоны и др. Важнейшие группы белков, относящиеся к растворимым,— это белки сыворотки крови, белки молока, яиц, растительные протеины, а также протамины и гистоны. 

[c.37]


    Азот — один из основных элементов в составе живого вещества. Азот входит во все простые и сложные белки, которые являются главной составной частью протоплазмы растительных клеток. Азот также находится в составе нуклеиновых кислот, которым принадлежит важная роль в обмене веществ. Азот содержится в хлорофилле, фосфатидах, алкалоидах и многих других веществах растительных клеток. Содержание азота в растениях колеблется от 0,1% (стволы хвойных пород) до 3,5% (водоросли), а среднее содержание в зеленых частях растений — 1—2%. 
[c.48]

    Как известно из курса органической химии, различают простые и сложные белки. [c.227]

    ИЛИ ИЗМЕНЕНИИ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ [c.286]

    Несмотря на существенные различия в химическом строении разных белков, им присущ ряд одинаковых или близких свойств, которые используются для целей анализа. Большая часть простых и сложных белков совсем или почти нерастворима в чистой воде присутствие небольших количеств солей или других веществ в растворе способствует их растворению в довольно значительных количествах. С другой стороны, высокие концентрации некоторых солей вызывают высаливание белков из растворов. 

[c.355]

    Основное содержание книги составляет химия наиболее важных природных биополимеров — простых и сложных белков, из которых формируются структурные элементы клетки. Сведения, касающиеся биологических функций этих соединений и морфологии клетки, даны в минимальном объеме. [c.6]

    Чем обусловлены изменения структурно-функционального состояния простых и сложных белков под влиянием УФ-излучения  [c.200]

    В различного типа мембранах обнаружено много простых и сложных белков, различающихся по структуре, химическим и физико-химическим свойствам. Установлена также значительная вариабельность в составе липидов мембран. Ферментативные свойства отдельных типов мембран несколько различны, отдельные ферменты используют как маркеры в процессах выделения и очистки мембран. [c.22]

    Содержание небелкового азота в цельной крови и плазме почти одинаково и составляет в крови 15—25 ммоль/л. Небелковый азот крови включает азот мочевины (50% от общего количества небелкового азота), аминокислот (25%), эрготионеина (8%), мочевой кислоты (4%), креатина (5%), креатинина (2,5%), аммиака и индикана (0,5%) и других небелковых веществ, содержащих азот (полипептиды, нуклеотиды, нуклеозиды, глутатион, билирубин, холин, гистамин и др.). Таким образом, в состав небелкового азота входит главным образом азот конечных продуктов обмена простых и сложных белков. [c.580]

    Важнейшими конечными продуктами обмена простых и сложных белков, образуюш,имися в тканях и органах, являются мочевина, мочевая кислота, креатин, креатинин, аммонийные соли, билирубин, эрготионеин и ряд других соединений. [c.479]

    Деятельная протоплазма растений — сложнейшее соединение многочисленных простых и сложных белков, в состав которых входят и ферменты с разнообразными небелковыми веществами, водой и солями. Белки протоплазмы обладают особо высокой чувствительностью ко всем внешним воздействиям и способностью вступать в реакции с самыми разнообразными веществамй, но сохранять при этом свои основные качественные свойства, присущие природе данного организма. Лишь при особых условиях можно изменить эту прочную качественную основу живых белков. [c.15]

    Строение ферментов. По строению ферменты бывают простыми и сложными белками. Для сложных белков-ферментов используют следующие обозначения апофермент — полипептидная часть молекулы фермента холофермент — прочный природный комплекс апо-фермента и небелковой части кофактор — небелковая часть сложного белка-фермента простетическая группа — прочно связанный с апоферментбм кофактор (металлы, гем и др.) кофермент — легко отделяемый от апофермента, например диализом, кофактор (витамины, нуклеотиды и др.) Алофермент всегда синтезируется в организме, кофакторы (витамины, металлы и др.) должны поступать с пищей. [c.63]

    Простые и сложные белки. В зависимости от химического состава белки делятся на простые и сложные. Простые белки состоят только из аминокислот, среди которых есть растворимые в воде (гистоны, альбумины, фибриноген) и не растворимые (глобулины, миозин, коллаген, осеин, кератин). Сложные белки состоят из белковой и небелковой частей. Небелковая часть может быть представлена углеводами, нуклеиновыми кислотами, липидами, фосфорной кислотой, окрашенными (хромо-) веществами. В зависимости от природы небелковой части сложные белки делятся на гликопротеиды, нуклеопротеиды, липопротеиды, фосфопротеиды, хромопротеиды. Все они выполняют разнообразные функции в организме. [c.229]

    В заключение следует отметить, что ввиду уникальных свойств белков, особенно в нервной ткани, их трудно классифицировать по единому принципу. Белки нервной системы характеризуются а) по химическому составу (простые и сложные белки) б) по физико-химическим свойствам (растворимые и нерастворимые белки, кислые и основные и т. д.) в) по локализации в различных отделах ЦНС и ПНС и в субкле-ючных структурах нейронов г) по метаболической активности д) по их функциональной роли. [c.132]


    В настоящее время многочисленные исследования по изучению интенсивности метаболизма белков нервной ткани при разнообразных функциональных состояниях организма человека и животных проводятся в различных направлениях 1) исследуется интенсивность обмена белко в нервной системе в онто- и филогенезе 2) изучается особенность метаболизма простых и сложных белков головного мозга, ЦНС и ПНС при различных i функциональных состояниях организма, вызываемых физическими и особенно разнообразными химическими воздействиями. Помимо экзогенных факторов, влияющих на функциональное состояние организма, широко используются эндогенные факторы— гормоны, нейромед иаторы и др. [c.179]

    Все разнообразие функционального состояния нервной системы кодируется в виде нервной импульсации. Физиологи обстоятельно изучили такие состояния нервной системы, как торможение и возбуждение. Одной из актуальных задач функциональной нейрохимии является изучение биохимических процессов, происходящих при торможении нлн возбуждении нервной системы. Так, например, установлена корреляция в изменениях интенсивности обмена белков нервной ткани п степени торможения или стимуляции функционального состояния нервной системы. Нервная ткань является исключительно сложной морфологической структурой, а в биохимическом отношении чрезвычайно гетерогенной системой, состоящей из разнообразных простых и сложных белков и небелковых компонентов. Этим в значительной мере и определяется исключительная трудность обнаружения количественных и качественных изменений белков и белковых комплексов в разных отделах ЦНС и ПНС как в норме, так и при различных функциональных состояниях нервной системы. Только метод радиоактивной индикации позволил значительно расширить возможности биохимических исследований в опытах ш vivo и 1п vitro. Исследовалась интенсивность обмена суммарных белков головного мозга при различных воздействиях, начиная от различных форм гипоксии, гипотермии, глубокого наркоза и кончая естественным сном. В частности, в нашей лаборатории были i проведены многочисленные исследования, касающиеся измене- [c.179]

    Столь же несовершенна и классификация белков. В зависимости от положенного в основу классификации признака среди белков выделяют те или иные узкие или широкие группы. Так, характеризуя белки по степени сложности, среди них вьщеляют две большие группы простые и сложные белки. К простым белкам, или протеинам, относят белки, дающие при гидролизе только аминокислоты. Сложными белками называют вещества, состоящие из протеина (простого белка) и добавочной группы небелковой природы. Поэтому ранее было принято называть сложные белки протеидами, т. е. подобными протеинам. Однако сейчас от этого термина отказались, и в зависимости от химической природы добавочной группы эти белки называют хромопротеинами, липопротеинами, гликопротеинами, нуклеопротеинами, металлопротеинами и т. п. Простые белки часто обозначают как однокомпонентные, а сложные— как двухкомпонентные. [c.80]


Андрей Ветров, специалист технической поддержки по КРС «Кемин Индастриз»

Не так давно в России были введены новые стандарты на молоко и молочные продукты. Эти стандарты контролируют качественные показатели — содержание жира и белка в молоке, его жирнокислотный состав и другие параметры. На сегодняшний день стандарт качества молока в России не подразумевает контроль показателя уровня казеина в молоке, но на практике все больше переработчиков учитывает данный параметр при приемке молока, а генетические компании ведут свою работу в направлении увеличения уровня казеина в молоке. О важности казеина и способах его увеличения, а также от чего зависит вкус кисломолочных продуктов, как улучшить сыропригодность молока с помощью кормления коров и синергетическом эффекте двух аминокислот рассказывает Андрей Ветров, специалист технической поддержки по КРС в России и СНГ компании «Кемин Индастриз».

Данный материал подготовлен на основе выпуска «Способы увеличения казеина в молоке», вышедшего в видеолекотории «Диалоги о технологиях» — цикла образовательных программ для специалистов АПК.

Почему казеин настолько важен?

Прежде всего это экономический вопрос. В молоке присутствует сывороточный белок (альбумины, глобулины), казеиновые мицеллы, лецитино-белковые оболочки жировых шариков и другие сложные белки, количество которых незначительно. 99% истинного молочного белка представлены сывороточными белками количество альбуминов 0,2–0,6%, глобулины 0,05–0,2%, и казеина 2,0–4,0% в зависимости, как вы понимаете, от породы. При этом количество казеина может варьироваться от 78 до 82% от общего количества белка.

В пищевых целях, для переработки важен не просто уровень сырого протеина молока, а именно казеин. Это связано с тем, что его в молоке, содержится больше, но он еще и более стабилен. При поступлении сырого молока на переработку, перед тем, как произвести какой-либо молочный продукт, молоко термически обрабатывается. Нагревание производится по типу пастеризации, с температурой ниже 100 °С, той температуры которая позволяет убить болезнетворные бактерии или по типу стерилизации с температурой свыше 100 °С, при которой уничтожаются все бактерии в том числе и споробразующие.

Так вот Альбумин выпадает в осадок при тепловой обработке молока при длительной пастеризации (уже при температуре 6З—65°С, экспозиции 30 мин). При нагревании молока выше 80°С альбумин денатурирует и теряет свою способность растворяться в воде, выпадает в осадок. При тепловой обработке (так же пастеризации) глобулин осаждается вместе с альбумином. Что же касается казеина, то он не денатурирует при пастеризации и является термостабильным. То есть после пастеризации и стерилизации в качестве основного источника белка в молочной продукции остается казеин.

Свертывание казеина происходит под действием сычужного фермента, кисломолочных бактерий, грибков, которые вырабатывают различные кислоты, отсюда и название — кисломолочные продукты. Перерабатывающие заводы производят более 50% кисломолочных продуктов, на качество и количество которых влияет именно казеин. Чем выше концентрация казеина, тем больше и качественнее кисломолочного продукта можно получить, а, следовательно, и получить больше прибыли.

Видеоверсия интервью

В магазинах представлены различные виды творога, кисломолочной продукции разных производителей, но по вкусу они очень часто сильно различаются. От чего зависят вкусовые качества кисломолочной продукции и что может влиять на это? 

Если говорить о качестве кисломолочной продукции, естественно, имеет место способ переработки молока, качество специализированных ингредиентов, но если говорить со стороны животноводства, то существуют факторы, воздействующие на колебания концентраций составных частей молока, которые приводят к нарушению синтеза молочного протеина. Прежде всего, важное значение имеет порода. Например, в советское время была выведена костромская порода молочного скота, которая давала молоко с высоким уровнем сыропригодности.

Следующая группа факторов физиологические — это стадия лактации.   Первотелки, приблизительно до 100 дней, дают несформировавшееся молоко. А уровень молочного протеина и молочного жира у коров двух и более лактации выше. По здоровью — пониженный иммунитет, заболевания маститом и различные виды гепатозов негативно влияют на процесс синтеза молока и его компонентов.

Третья группа факторов — внешние. К ним относятся уход и содержание. Сейчас большинство молочных ферм обращают внимание на комфорт и снижение стрессов. Процесс доения, правильно выбранное оборудование — это еще не все необходимое для получения качественного молока, очень важно наладить рутину доения и наладить систему очистки доильного оборудования.

Ну и еще один, наиболее важный для меня фактор, — это рацион кормления.

Как тогда по вашему мнению можно улучшить сыропригодность молока с помощью кормления?

Рацион коров состоит из привычных нам элементов — клетчатки, углеводов, жиров и сырого протеина. Однако уже длительное время балансирование рационов по такому показателю как, например, клетчатка дифференцировали на нейтрально детергентную, кислотно детергентную и отдельно лигнин, углеводы и протеин разбили на фракции, по степени расщепления в рубце и уровню транзитного крахмала и протеина. И вот здесь начинается самое интересное, протеин прежде всего состоит из аминокислот и вне зависимости от степени расщепления протеина он усваивается организмом в виде аминокислот.

Поступившие аминокислоты идут на синтез протеина молока. Синтез аминокислот молока представляет собой последовательное соединение аминокислот в одной молекуле. α – лактальбумин состоит из 123 α – аминокислот. Если в организм поступило недостаточное количество необходимых аминокислот, то синтез молочного белка будет лимитирован по принципу знаменитой бочки Либиха.

Как я уже говорил в предыдущем интервью, существуют заменимые и незаменимые аминокислоты. В незаменимых аминокислотах выделяют группу предельные аминокислоты и для коров с продуктивностью 35-50 л предельными являются лизин и метионин.

Что же касается казеина, то в составе казеина содержатся все аминокислоты пищевой цепочки, но, что интересно, давайте сравним уровень метионина в сывороточном белке и казеине. Вы видите, на синтез казеина метионин оказывает максимальное влияние и при его недостатке концентрация казеина в молоке будет на минимальном уровне. В отличие, например, от лизина, вы видите, что для синтеза казеина необходимо в два раза меньше лизина, чем на синтез сывороточных белков.

Поэтому принято считать, что метионин влияет на качество молока — увеличивает истинный белок и казеин молока, а лизин положительно влияет на количество молока. Не забываем про синергетический эффект при использовании обеих аминокислот. 

Вы считаете, что простое внесение недостающего лизина и метионина позволит улучшить не только качество, но и количество молока?

Не совсем так. Существуют несколько правил при балансировании аминокислот. Прежде всего, соотношение аминокислот к обменной энергии, например, на 1 мкал обменной энергии должно приходиться 1,1–1,14  г метионина. Так же при балансировании аминокислот важно учитывать уровень обменного лизина и метионина к обменному протеину. При простом балансировании аминокислот мы выдерживаем средние значения параметров рационов по аминокислотному питанию при одновременном ступенчатом снижении уровня сырого протеина до уровня 15-16% (показатель зависит от качества основных кормов, к слову сказать при нынешних ценах на протеиновые корма это позволяет существенно удешевить рацион).

Далее, если необходимо увеличить продуктивность, мы увеличиваем концентрацию лизина, а если необходимо увеличить сырой протеин и казеин, то мы увеличиваем количество метионина. Как я уже говорил, именно метионин является основной предельной аминокислотой при синтезе казеина. 

При этом надо понимать, что внесение метионина реализовывает генетический потенциал животных. Соотношение же лизина и метионина тоже регламентируемый показатель: если необходимо увеличить казеин молока, то соотношение лизин к метионину должно быть равно 2 к 4, если специалистов на ферме интересует увеличение продуктивности, то 2 к 8, средний же показатель равен 2 к 6. Все параметры по балансу аминокислот вы можете найти на сайте компании «Кемин Индастриз».

Так же аминокислоты, скармливаемые жвачным животным, должны быть защищены от разрушения микрофлорой рубца и при этом обладать высокой биодоступностью.

Значит вы рекомендуете использование только защищенных аминокислот, но как обычному специалисту проверить защищу и биодоступность аминокислот?

Это очень сложный вопрос. Эту информацию необходимо получать от производителя. Процесс защиты — инкапсуляции — это сложный технологический процесс и на сегодняшний день в России капсуляты не производятся, а зарубежные производители, прежде чем зарегистрировать продукт, обязаны изучить его свойства всесторонне, в том числе и заявленные свойства — защита от разрушения в рубце и биодоступность аминокислоты. Данные исследования производятся в нескольких институтах мира по специально разработанным методикам. Наша компания в этом направлении плотно сотрудничает с Барселонским институтом.

Оценку уровня биодоступности производят методами in vivo, in vitro, in situ. Научно-исследовательские институты регулярно публикуют подобные исследования в том числе и сравнительной характеристики различных защищенных продуктов. Например, уровень свободных аминокислот в крови увеличивается линейно с увеличением всасывания аминокислот в кишечнике, это является одним из способов оценки эффективности продукта и степени его защиты и биодоступности. Важный параметр этой оценки — показатель уровня аминокислот в крови при различных дозировках продукта и дальнейшее сравнение результата со стандартными параметрами.

Мы постоянно проводим исследования и сравниваем результаты изменения концентрации метионина в плазме крови. При сравнении новых технологий производства инкапсулированного метионина, с продуктами производства старых технологий мы постоянно получаем одинаково хороший результат, более высокая концентрация метионина в плазме в абсолютных величинах и от общего количества аминокислот.

Если же хозяйство хочет самостоятельно проверить уровень биодоступности, то возможно проведение анализа крови после трех недель с момента начала скармливания аминокислот.  В норме уровень метионина в плазме крови высокопродуктивных животных после скармливания защищенных аминокислот должен быть 4 мг/мл, стандартная концентрация метионина в плазме 3,5 мг/мл. 

То есть исследование аминокислот в крови — это дорогостоящий и трудоемкий анализ, который не могут позволить средние молочно-товарные фермы. Что вы посоветуете для них, как оценить эффективность применения аминокислот и их влияние на уровень и концентрацию казеина в молоке?

Если в хозяйстве есть возможность проведения контрольных доек, то оценить можно по изменению количества сырого протеина, казеина, а так же мочевины в молоке.

Поступление в организм достаточного количества предельных аминокислот способствует увеличению использования других, находящихся в избытке аминокислот и снижению их вынужденного выведения из организма. Применение защищенного метионина нового поколения позволяет снизить количество сырого протеина рациона в данном опыте с 17,5% до 17,0% без потери продуктивности, уровень молочного протеина так же увеличился с 3,19 до 3,3%, что самое интересное, вот это увеличение молочного протеина произошло посредством увеличения концентрации казеина с 2,77 до 2,89 %. Эти факты позволяют сделать вывод, что высокая биодоступность метионина в продукте нового поколения способствует увеличению концентрации метионина в крови и удовлетворению потребности организма животного.

И в заключении скажите, что влияет на снижение эффективности преобразования азота протеина в молочный протеин и увеличивает стоимость рациона?

Прежде всего на это влияет нарушение соотношения фракций углеводов и протеина в рационе кормления, так же качество и переваримость основных и протеиновых кормов. Очень важно понимать, что чем выше температура обработки протеиновых кормов, тем больше протеина пройдет транзитом не только рубец, но и кишечник.

Второе — это высокая концентрация сырого протеина в рационе (более 16,5%) так же снижает эффективность усвоения азота и преобразование в молочный белок и казеин. 

Высокое содержание транзитного протеина (более 36%), надо учитывать, что аммиак образуется не только в рубце, но и в клетках организма, так называемые катаболитические реакции, поэтому высокий уровень транзитного протеина не гарантирует синтез молочного протеина.

Ну и дисбаланс аминокислот – недостаток одних аминокислот приводит к избытку других, которые не трансформируются в молоко, а утилизируются через мочевину, синтезируемую в печени, тем самым вызывая зашлакованность печени.

что это? Отвечаем на вопрос. Список продуктов с высоким содержанием белка

Сегодня все больше людей страдает от дефицита белков в рационе, но при этом многие даже не догадываются, чем именно вызвана подобная ситуация и как можно ее исправить. В действительности, белки — это основной строительный материал нашего организма и их недостаток ухудшает не только работу внутренних органов, но и внешний вид человека. При этом запастись протеинами невозможно и для полноценного здоровья необходимо регулярно потреблять их с пищей. В статье будет подробно описано, что же представляют собой белки, какие функции выполняют и в каких продуктах содержатся.

Определение

Протеины или, проще говоря, белки – это сложные химические соединения из аминокислот. Часть их может синтезироваться организмом самостоятельно, но есть и незаменимые, которые человек может получить только из пищи, причем в большей степени животной.

Впервые белки были обнаружены еще в 18 веке французским ученым, после чего разговоры об их пользе не умолкают. Интересно, что молекулы белка могут выполнять разные функции и не имеют четкого разделения на виды, но при этом часто определяются конкретными функциями.

Функции белков

Основной задачей протеинов в организме является ускорение различных процессов и реакций. Кроме этого, о пользе белков наслышаны все, кто хоть раз посещал тренировки, ведь именно эти молекулы являются основным строительным материалом мышечной ткани, и никакие нагрузки без правильного питания не помогут получить идеальную рельефную фигуру. Невозможно не упомянуть об известных всем красавицам кератине и коллагене – это белки. Именно они обеспечивают красоту наших кожи, волос и ногтей.

Кроме этого, протеины отвечают за свертываемость крови, активизацию иммунитета, детоксикацию организма, движение лейкоцитов и доставку питательных веществ к клеткам организма. К белкам относят и некоторые гормоны, самым известным из которых является инсулин. Ну и в завершение, белок – это самый полезный источник энергии.

Потребность человека

В зависимости от образа жизни и наличия стрессовых ситуаций, для организма необходимое количество белков может постоянно меняться. Чтобы не получить дефицит вещества за короткий срок, необходимо регулярно потреблять протеины с пищей, а при необходимости и в виде диетических добавок. Нужное количество белка для каждого человека определяется индивидуально его полу, возрасту, образу жизни и региону обитания. Когда вещество только было обнаружено, считалось, что достаточно потреблять в сутки всего 0,3 г чистого белка на каждый килограмм веса. Сегодня нормы значительно отличаются и в среднем составляют уже 0,8 г/кг. Белки должны составлять минимум 15% от суточного рациона и при наличии определенных условий этот показатель увеличивается. Так, содержание белка в пище следует повысить при:

  • тяжелой физической работе;
  • регулярных занятиях спортом;
  • во время болезни и выздоровления;
  • в холодное время года.

При этом нужно помнить, что избыток белка в организме ведет к ожирению, мочекаменной болезни и проблемам с пищеварительной системой.

Недостаток же протеинов не менее опасен и провоцирует упадок сил, снижение защитных функций организма, ухудшение внешнего вида и анемию. Именно поэтому перед корректировкой своего рациона нужно тщательно все рассчитать. В пожилом возрасте, в жаркую погоду или при некоторых болезнях, характеризующихся трудностями в усвоении белков, их количество требуется, наоборот, сократить.

Нормы потребления белков

Сегодня диетологи вывели средние показатели потребности в протеинах. Для новорожденных и детей до 3-х лет это 2,2 г/кг. Детям дошкольного возраста требуется приблизительно 20 г в сутки, а школьникам уже 35 г. В подростковом возрасте с 14 лет разделение в потребностях идет уже и по половому признаку. Так, молодым девушкам необходимо в день 45 г белка, а парням – 52 г. Женщинам и мужчинам с 19 лет и старше дозу определяют аналогично подросткам, но с возрастом постепенно уменьшая из-за замедления метаболизма.

Растительные белки

Протеины человек получает из многих продуктов питания, в числе которых есть и растительные. Наибольшее содержание белков при этом содержится в бобовых, грибах, орехах и семечках. Среди овощей следует выделить все виды капусты.

Кроме этого, в незначительных количествах растительные протеины имеются в муке и всех мучных изделиях, крупах, фруктах, сухофруктах и овощах. Несмотря на такой широкий список, обеспечить организму полноценное насыщение только растительными продуктами невозможно. Дело в том, что ни одно растение не содержит всех незаменимых аминокислот, необходимых для человека.

Животные белки

Продукты с большим содержанием белка не обязательно могут быть животного происхождения, но при этом только они могут обеспечить организм полным списком незаменимых аминокислот. В их числе мясо, рыба, яйца и молочные продукты.

Интересно, что многие ученые при этом не спешат называть их самыми полезными, ведь на переваривание животной пищи тратится очень много сил, а чрезмерное употребление таких продуктов ведет к подагре, болезни суставов и другим заболеваниям. Растительный белок не имеет таких последствий и усваивается организмом намного быстрее, улучшая при этом пищеварение.

В связи с такой спорной ситуацией для здорового питания, нужно правильно определять меру продуктов и научиться их сочетать между собой, чтобы не навредить организму.

Сочетание белковой пищи

Важно запомнить, что продукты с высоким содержанием белков животного происхождения сильно нагружают пищеварительную систему, поэтому лучше всего употреблять их вместе с зеленью и некрахмалистыми овощами. Это усилит выделение желудочного сока и поможет быстрее переварить тяжелую пищу.

Усложняет процесс пищеварения сочетание белков с противоположными жирами. То есть растительные белки можно употреблять только с растительными, а животные – с животными. Лучше всего запекать, тушить или варить мясо, а не жарить на растительном масле, так же как и заправлять овощной салат растительным жиром, а не сметаной. И, кстати, еще одно правило – не смешивать белки разного происхождения. То есть, рыбу не есть вместе с мясом, а сыр с овощами.

Усложняет процесс усвоения протеинов сладкая и кислая среда.

Особое место занимают бобовые – соя, чечевица, горох, нут, бобы и фасоль. Содержание белков в них не самое высокое, но по составу они отличаются от всего, поэтому сочетать их нельзя ни с растительными, ни с животными протеинами.

Учитывая эти правила, необходимо составлять рацион так, чтобы каждый прием пищи содержал треть от суточной нормы белков, а перекусы — еще по 3-5%.

Белки для похудения

Продукты с большим содержанием белка всегда требуют больших энергозатрат для своего расщепления, поэтому при попадании их в организм калорий тратится больше, чем поступает. Также протеины способствуют длительному чувству насыщения и помогают организму нормализовать многие важные процессы. Все это определяет белковую пищу как одну из наиболее полезных при диетах, конечно, только при соблюдении правил приготовления – варке, тушении или запекании.

Для желающих похудеть следует ознакомиться со списком продуктов с низким содержанием белка:

  • нежирные кисломолочные продукты;
  • молоко;
  • крупы – овсянка, рис и гречка;
  • некрахмалистые овощи и зелень;
  • постное мясо, приготовленное без жира;
  • мясные субпродукты, лучше всего язык;
  • рыба и морепродукты всех сортов;
  • бобовые;
  • нежирные твердые сыры;
  • отварные яйца.

Продукты с большим количеством протеина. Мясо

Для тех, кто старается нарастить мышечную массу или просто восполнить дефицит вещества в организме, необходимо ознакомиться со списком продуктов, имеющих повышенное содержание белков.

На первом месте стоит мясо. В свою очередь оно подразделяется на сорта, от которых зависит и количество ферментов:

  1. Больше всего чистого протеина содержится в говядине – 25%. Кроме этого, продукт оказывает организму огромную пользу, обогащая его железом, витаминами группы В и практически полным списком необходимых человеку аминокислот. Лучше всего говядину варить или тушить несколько часов, чтобы сделать структуру мяса более мягкой.
  2. Телятина стоит на втором месте. Это мясо усваивается намного легче и подразделяется на категории. Первые две имеют 20% чистого белка, а жира не более 2%.
  3. Конина. В ней имеется высокое содержание белков – 21%. Несмотря на нераспространенность такого вида мяса, его регулярное употребление способно быстро восполнить нужды организма в «строительном материале». Кроме этого, конина богата железом и калием.
  4. Крольчатина. По достоинству считается диетическим продуктом, ведь практически не содержит в себе жира. Его нежный вкус дарит человеку не только приятные ощущения, а и пользу от железа, фосфора, калия и множества витаминов в составе. Чистого протеина в мясе кролика – 21%.
  5. Диетическим считается и мясо птицы. Легкого и чистого белка в нем приблизительно 20%, а его низкая калорийность и большой список витаминов, аминокислот и минеральных веществ делают продукт идеальным источником энергии во время диет.
  6. Повышенное содержание белков имеется и в свинине, но определенных сортов. Самые жирные части могут содержать до 50% жира и всего 12% протеина. Выбирать источником протеина следует нежирные части, такие как вырезка или корейка. В них белка имеется 20%, а жира в три раза меньше.

Яйца

После мяса следует выделить куриные и перепелиные яйца.

Утиные также содержат в себе белок, но в минимальном количестве – всего 3% от общей массы. В куриных же протеина может быть 7-17% в зависимости от того, насколько качественно питалась птица. Кроме белков, в яйцах имеются жирные кислоты, сера, цинк, фосфор, железо и жирорастворимые витамины. Отрицательное действие жиров из желтка при употреблении полностью перекрывается лизином в составе, поэтому кушать яйца рекомендуется полностью. Лучшим способом приготовления при этом является варка, поскольку скорлупа сохраняет все полезные свойства.

Кисломолочные продукты

Вся пища животного происхождения имеет высокое содержание белка. В каких продуктах из молока его больше всего? Основным кисломолочным источником полноценного чистого протеина является творог.

В зависимости от жирности, белка в нем может быть 14-18%. Для облегчения переваривания творог следует смешивать с кефиром или йогуртом, но помните, что такое сочетание может повысить и калорийность блюда. Специалисты рекомендуют кушать творог на ужин, поскольку в его составе имеется вещество, которое усваивается организмом дольше всего, – казеин.

Кроме творога, много белка имеется и в твердом сыре, но при этом продукт очень калорийный. Чтобы не навредить своей фигуре, его рекомендуется употреблять перед физическими нагрузками или отдавать предпочтение легким разновидностям. Например, сыр фета имеет в составе 16% белка, а камамбер – 19%. Наименьшая концентрация протеина в плавленом сыре – всего 4%.

Дары моря

Больше всего белка и других полезных веществ имеется именно в морской рыбе, поэтому речная не входит в перечень. Итак, протеинов в ней не менее 16%, при этом усваивается рыба намного быстрее мяса из-за низкого содержания соединительных волокон. Лучшим выбором будет форель, треска, камбала, анчоусы, сардины, лосось или тунец, поскольку эти сорта не имеют избытка жира. Кроме белка и жирных кислот, в рыбе имеется йод, магний, фосфор, калий, фтор, витамины А, D, Е и группы В.

Естественно, максимальный положительный эффект принесут блюда, приготовленные тушением или варкой, копченая рыба не принесет организму пользы.

Фрукты, овощи и орехи

Содержание белков в продуктах растительного происхождения нельзя назвать высоким в сравнении с животными, но все же вычеркивать их из своего рациона нельзя. Растительный белок в наибольшей концентрации сосредоточен в твердых фруктах, ягодах с косточками, бобовых и капусте. Так, ежедневно нужно употреблять яблоки, персики, вишни, абрикосы, груши, манго и другие плоды.

Орехи по количеству белка смело можно сравнивать даже с мясом, но стоит помнить, что в них содержится и большое количество растительного жира, поэтому при диетах такие продукты исключают. Наибольшая концентрация протеина имеется в арахисе, семенах подсолнечника и миндале – 20-25%. Грецкий, кедровый орех, фисташки и фундук имеют всего 7-10% белка.

Заключение

После ознакомления со списком наиболее богатых белком продуктов и важностью этого элемента для организма, многим все еще не понятно, почему возникает дефицит протеина? С такой проблемой может столкнуться даже человек, регулярно употребляющий в пищу мясо, рыбу и молочные продукты, не говоря уже о тех, кто добровольно ограничивает себя в питании.

Все дело в том, что регулярное питание может просто не обеспечивать организм нужным ему количеством веществ для функционирования. Именно поэтому при коррекции своего рациона следует особое внимание уделять не средним нормам, а индивидуальным потребностям, которые будут учитывать уровень физических нагрузок, возраст и пол человека. Кроме этого, потребность в белках определяется и целями человека. Если протеины нужны ему просто для поддержания работоспособности организма, то их рассчитанную норму нужно строго соблюдать. Если же белки нужны спортсмену для увеличения соей мышечной массы, то любой средний показатель нужно увеличивать на 10-15%.

Кроме этого, всегда нужно помнить о том, что организм не способен накапливать в себе белки, также как и обходиться без незаменимых аминокислот, которые синтезируются только из него. Именно поэтому необходимо потреблять протеины регулярно. Если у человека нет возможности ежедневно составлять свое меню согласно всем требованиям, потребность в белках легко можно восполнить пищевыми добавками.

Как облегчить приготовление блюд с редкими яичными продуктами Ясенсвит

Мы знаем и готовы раскрыть вам все секреты того, как успевать позавтракать идеально пышным вкусным омлетом, даже когда опаздываете, как меньше возиться с белками во время приготовления безе, и наконец — как правильно делать бисквитное тесто, чтобы оно получилось нежным и воздушным. Итак, поехали!

Сделать омлет для многих кажется нехитрым делом. Но если мы говорим о настоящем омлете, нежном, пышном, идеальной консистенции — то есть несколько секретов приготовления.

Секреты правильного омлета:
  • Следование рецепту
  • Сковородка с толстым дном
  • Сливочное масло, равномерно распределенное на поверхности сковороды
  • Качественные яйца. Говорим, конечно же, о ЯСЕНСВІТ 🙂

Рецепт классического омлета на сковороде:
  1. Разбейте яйца в емкость, добавьте щепотку соли. Перемешайте венчиком или вилкой до образования однородной консистенции (до образования пены доводить не нужно).
  2. Добавьте молоко или сливки (с ними он будет более пышный) в соотношении 30 мл на одно яйцо. Опять перемешайте.
  3. Разогрейте сковороду на среднем огне, добавьте кусочек сливочного масла.
  4. Когда масло начнет образовывать первые пузырьки — вылейте смесь на сковороду.
  5. Лопаткой слегка поднимайте участки с застывшим яйцом, чтобы туда попала жидкая смесь (так текстура омлета будет нежной).
  6. Когда ⅔ смеси загустела — оставьте омлет в покое на 30-60 секунд.
  7. Сверните омлет пополам. Можно насладиться классикой, а можно добавить внутрь начинку на ваш вкус: зелень, сыр, бекон и даже клубнику.
Вывод

Итак, мы видим, что настоящий омлет требует внимательности, заботливости, навыков и ВРЕМЕНИ! Поэтому вряд ли такой получится утром, когда очень хочешь омлет, но спешишь на работу. В таком случае рискуешь получить яичный блин на сковородке. Но что когда утром у тебя в холодильнике уже будет яичная заготовка для омлета с идеальными пропорциями? ..

Омлет «Фирменный» от ЯСЕНСВІТ — это удобная заготовка для вашего эталонного омлета из свежих яиц, молока, сливок и соли — пастеризованных, перемешанных и удобно упакованных. С ней вы успеете позавтракать вкусным омлетом, даже если уже опаздываете!

  • Все ингредиенты сразу готовы к тому, чтобы превратиться в вкусный омлет.
  • Идеально подобранные пропорции ингредиентов — так вы каждый раз будете получать правильную консистенцию и любимый вкус.
  • Сделать омлет быстрее, чем сварить кофе — у вас всегда будет время на полноценный полезный и вкусный завтрак.
  • Удобная картонная упаковка Pure Pak, которую хватит на 3-4 порции омлета. А еще она занимает мало места в холодильнике.
  • Упаковка поддается вторичной переработке.
Интересные факты об омлете

Омлет — это одно из самых древних блюд в истории человечества. Оно относится к блюдам французской кухни, но есть данные, что первые омлеты готовили еще в Древней Персии.

Существует легенда, что когда Наполеон Бонапарт и его армия путешествовали по Южной Франции, они решили переночевать недалеко от города Бессьер. Наполеон ел омлет, приготовленный местным поваром, и был потрясен этим кулинарным произведением. Затем он приказал горожанам собрать все яйца в селе и на следующий день приготовить огромный омлет для своей армии.

Правильное приготовление омлета является критерием принятия повара на работу во многих французских ресторанах.

Омлет по первоначальному классическому рецепту готовится без добавления молочных продуктов, только из взбитых яиц. Но впоследствии появился вариант с молоком или сливками, который тоже уже стал классикой.

Омлет может быть совершенно разным в зависимости от добавленных ингредиентов — в этом его прелесть. Многие страны мира имеют свои вариации омлета. Например, итальянский омлет — сытная фриттата, в которую могут добавляться грибы, овощи и сыр. В японском тамагояки к яйцам добавляются пряности, соевый соус, сушеный копченый тунец кацуобуси, а омлет сворачивается в рулет. На Ближнем Востоке готовят куку — омлет с черным перцем, тертым грецким орехом и иногда — молодым шафраном.

Легкое и хрустящее французское пирожное безе (другое название — меренги) — это один из самых популярных десертов, который может быть вполне самодостаточным или быть ярким украшением для других вкусностей.

Два способа, как легко отделить белок от желтка

Приготовление безе очень простое, если уметь отделить белок от желтка. Для многих это — самый сложный этап, небольшая ошибка в котором портит весь процесс. Даже если к белку попадет хоть капля желтка, он не собьется достаточно хорошо. Поэтому делимся с вами различными популярными методами, как отделить белок от желтка просто и эффективно.

  • С помощью пластиковой бутылки
  1. Осторожно разбить и вылить яйца на большую плоскую тарелку.
  2. Чистую пластиковую бутылку нужно слегка сжать и поднести горлышко к желтку.
  3. Отпустить бутылку — при разжатии она втянет в себя желток.
  4. Выжать желток на другую тарелку — при легком сжатии бутылки он выскочит сам. Готово!
  • Классика: с помощью скорлупы
  1. Разбиваем ножом яйцо сбоку примерно посередине.
  2. Раскрываем половинки скорлупы так, чтобы желток оказался целым в одной из них.
  3. Аккуратно перемещаем его в другую половинку, одновременно сливая белок в подставленную миску.
  4. Повторяем эту операцию до тех пор, пока белок полностью не окажется в миске.

Теперь, когда мы выяснили, как можно самостоятельно отделить желток от белков, время приготовить безе.

Пошаговый рецепт безе в духовке

4 яйца

200 г сахара

1 щепотка лимонной кислоты

  1. Отделите белки от желтков.
  2. Смешайте сахар с лимонной кислотой и всыпьте в белки. Взбивайте смесь миксером около 15 секунд на средней скорости.
  3. Теперь сделайте водяную баню, после закипания воды нужно уменьшить огонь и поставить сверху миску с белковой массой. В таком положении нужно сбивать ее еще в течение 10 минут.
  4. Снимите белки с огня и взбивайте их еще 2-4 минуты.
  5. Наполняем белками кондитерский мешок и аккуратно сцеживаем пирожные на противень, застеленный пергаментной бумагой (можно это сделать с помощью чайной ложки).
  6. Духовку разогреваем до 80-90 градусов и выпекаем безе течение 30 минут. Чтобы они были белее, можно использовать более низкую температуру — 50-60 градусов, и выпекать в течение 40-45 минут.
Вывод

В среднем на отделение белка от желтка расходуется несколько нервных клеток, пачкается сразу несколько тарелок, портится настроение, если это не получается, а еще возникает проблема — куда девать желтки?

С ЯСЕНСВІТ не нужно лишних беспокойств! Мы поделились с вами проверенными способами отделения желтка от белка, однако можете забыть их прямо сейчас. Ведь на самом деле мы уже давно сделали это за вас!

О яичном белке ЯСЕНСВІТ

Если вы часто покупаете яйца только для белка — этот продукт для вас. В нем — белки свежих куриных яиц из собственных птицефабрик компании «ЯСЕНСВІТ»: ценный источник аминокислот и протеина без жира и холестерина. Теперь готовить и следить за балансом в питании еще удобнее!

  • Больше не нужно покупать целое яйцо ради белков и думать, как использовать желтки. Жизнь проще, когда можешь выбрать только нужный ингредиент!
  • Гарантировано легкое приготовление безе и других блюд (белковых омлетов, спортивного питания).
  • Удобный способ поддерживать сбалансированное питание, ведь яичный белок — это ценный источник аминокислот и протеина без жира и холестерина.
  • Удобная картонная упаковка Pure Pak, которая занимает мало места в холодильнике. Количество белков ~ с 15 яиц.
  • Упаковка поддается вторичной переработке.
Интересные факты о безе

Самая ранняя известная запись слова «безе» находится в кулинарной книге 1692, написанной шеф-поваром Франсуа Массиало из Франции, хотя считается, что эта сладость возникла в 1500-х годах.

Если при приготовлении безе к нему попадет хоть капля жира, взбить белки не удастся, поэтому позаботьтесь об идеальной чистоте посуды, в которой готовите меренги.

По технологии приготовления различают: французскую меренгу — взбитые белки с сахаром; швейцарскую меренгу, которую готовят на водяной бане; итальянскую меренгу — в белковую массу тонкой струйкой добавляют сахарный сироп.


Бисквит — популярное кондитерское тесто, которое готовится из муки, сахара и яиц. Воздушное, легкое, сладкое. Минимум ингредиентов и бесконечное количество вкусных произведений, которые с ним можно сделать. Но прежде чем отдаваться в объятия кулинарной фантазии — потренируемся на классике, ведь приготовление пышного бисквита не так просто, как может показаться.

Рецепт приготовления бисквита:

3 яйца

150 г сахара

110 г муки

  1. Взбейте яйца миксером до плотной пышной пены.
  2. Добавьте сахар и продолжайте взбивать на средних оборотах.
  3. Быстро просейте муку, добавьте в смесь. Перемешивать ее лучше вручную или на низких оборотах, осторожно, чтоб яичная пена не осела.
  4. Духовку разогрейте до 180 С, форму для выпекания застелите пергаментом, равномерно распределите в ней тесто.
  5. Выпекайте бисквит в течение 30-35 минут, следите, чтоб он поднялся и приобрел золотистый оттенок. Духовку лучше не открывать, иначе тесто опадет.
  6. Когда бисквит испечется, достаньте его из духовки и дайте остыть в форме. А вот вам идея, что вкусненькое можно сделать с этим бисквитом дальше — рецепт бостонского кремового пирога.
Вывод

Как видим, приготовления бисквита — это достаточно сложная и ответственная задача. И чтобы терпения и старания не были напрасными, важно не пренебрегать пропорциями. Базой для определения соотношения ингредиентов в бисквите есть яйца: от их количества зависит количество других ингредиентов.

Когда для бисквита рекомендуют определенное количество яиц, то представляют, что они среднестатистического веса — 60 граммов, а без скорлупы — это примерно 54 грамма. Поэтому если в лотке яйца существенно разные — большие и маленькие, есть риск взять недостаточно для бисквита или наоборот слишком много. И в пропорциях произойдет сбой.

Но есть выход! Перемешанное жидкое яйцо из упаковки ЯСЕНСВІТ позволит отлить четкое количество. Если для бисквита нужно 6 яиц, то это 324 грамма жидкого яйца.

Жидкое яйцо ЯСЕНСВІТ — это уже освобожденное от скорлупы яйцо, которое мы бережно перемешали и получили идеальный ингредиент для выпечки!

О жидком яйце ЯСЕНСВІТ

  • Не нужно разбивать и перемешивать яйца, а потом мыть посуду — подготовленная однородная смесь уже ждет, когда попадет в ваши любимые блюда!
  • Взбитое яйцо — универсальный продукт, который позволит вам приготовить много любимых блюд.
  • Удобная картонная упаковка Pure Pak, которая занимает мало места в холодильнике. Количество перемешанных яиц ~ 10
  • Упаковка поддается вторичной переработке.
Интересные факты о бисквите

Бисквит — одна из старейших известных сладостей. Современный бисквит появился в Европе в начале 19 века. Однако его предшественники были популярны гораздо раньше. Первое зарегистрированное упоминание о бисквите относится к итальянской выпечки эпохи Возрождения. Итальянские повара пекли «печенье», которое распространилось в Италии, Англии и Франции. Часто тесто выливали в сложные формы, но также использовали два жестяных обруча, которые ставились на противень, застеленный пергаментной бумагой.

В кухнях разных стран есть свои традиционные бисквиты. Например, на Филиппинах популярен мамон — бисквит в форме пирожного, который покрывается маслом, посыпается сахаром и тертым сыром. «Ангельский бисквит» появился в США в 19 веке и имеет легкую воздушную текстуру, как облако — за счет того, что готовится исключительно из яичных белков. Пао где Ло — португальский бисквит, в который помимо классических ингредиентов добавляется оливковое масло и соль.


Итак, мы рассмотрели классические способы и поделились лайфхаками приготовления трех популярных блюд — омлета, безе и бисквита, основой для которых являются яйца или яичные продукты ЯСЕНСВІТ. И насчет последних — рекомендуем попробовать их в ваших ежедневных кулинарных творениях, если вы хотите сэкономить свое время и усилия. Напомним, что жидкие пастеризованные яичные продукты ЯСЕНСВІТ имеют удобную, компактную и экологическую упаковку, сделанные из вкусных и безопасных яиц ЯСЕНСВІТ, и главное — позволяют добиться идеальных результатов даже в сложных рецептах!

Как поститься без вреда для здоровья

Великий Пост, который в этом году начался 15 марта, самый строгий и продолжительный из всех православных постов. Предлагаем ознакомиться с некоторыми советами, как правильно питаться во время поста, чтобы не навредить здоровью.

Соблюдение Великого поста подразумевает отказ от продуктов животного происхождения, а в какие-то дни и от растительного масла.

Если раньше Пост соблюдали только люди верующие, то сегодня придерживаться ограничений в еде начали и те, кто далек от церковных обычаев и обрядов.

Несмотря на моральную готовность соблюдать Великий пост, многие сомневаются, сможет ли их семья в этот период питаться без вреда для здоровья.

Предлагаем ознакомиться с некоторыми советами, как правильно питаться во время поста, чтобы не навредить здоровью.

 Совет N°1: не рассматривайте пост как способ похудеть 

Да, это воздержание от излишеств, в том числе пищевых. Но с точки зрения диетологии пост — это очень нерациональное питание, несбалансированное по основным микро- и макронутриентам. Поэтому если вы хотите соблюдать пост, можете это делать, и здорово, что у вас есть сила воли. Но нужно к этому подходить разумно и не пытаться похудеть за счёт поста!

 Совет N°2: максимально разнообразьте рацион 

В такие периоды, как пост, очень легко свести свой рацион к минимальному количеству продуктов и есть, например, в основном пасту и хлеб.

В периоды серьёзных ограничений важно получать все необходимые микро- и макроэлементы из разрешённых продуктов. Поэтому чем разнообразнее будет рацион, тем больше шансов, что не возникнет нехватки важных веществ. Кроме того, однообразный рацион может наскучить человеку. Из-за этого соблюдать пост от начала до конца ему будет сложнее.

Необходимо получать белки, жиры, углеводы, витамины, микроэлементы. Во время поста полезные жиры — это растительные масла, белки — это растительные белки (бобовые, грибы, орехи), сложные углеводы, обеспечивающие энергией, — крупы, паста из твердых сортов злаковых, хлеб, хлебцы.

 Совет N°3: восполняйте нехватку животного белка 

Одна из основных проблем постного рациона — это нехватка животного белка. Белок, особенно животный, очень хорошо насыщает, так как достаточно долго усваивается организмом, кроме того белок — это строительный материал для мышц.

Когда человек существенно ограничивает белок в своём рационе, он теряет вес, и в первую очередь за счёт мышц. А этого категорически нельзя допускать!

В свой рацион во время поста стоит включать продукты, содержащие растительный белок — соевые продукты, бобовые (чечевицу, нут, горох, фасоль (зерновую и стручковую)). Также растительный белок содержат грибы (достаточно тяжёлая для переваривания пища, поэтому лучше их не употреблять каждый день, а пару раз в неделю).

Орехи и крупы тоже содержат белок — их нужно обязательно включать в свой рацион во время поста.

 Совет N°4: используйте несколько видов растительных масел: оливковое, кунжутное, кукурузное, конопляное, льняное 

Так вы обеспечите максимальным количеством разных полезных жиров. Ведь в одном виде масла содержатся одни полезные жиры, в другом виде масла — другие. Масло можно добавлять и в крупу, и в овощные блюда. Это будет и вкусно, и полезно.

 Совет N°5: обеспечьте полезные перекусы 

Важно, чтобы на виду были полезные перекусы, например, овощные чипсы, фрукты, несолёные орехи, тыквенные семечки, хлебцы. То есть то, к чему может потянуться рука, когда хочется не обильно поесть, а просто что-то перекусить, не навредив здоровью.


Выход из поста должен быть плавным. При выходе из поста будьте умеренными при употреблении мясной и жирной пищи. Постепенно и аккуратно возвращайтесь в свой ежедневный рацион. Правильное питание во время Поста — залог хорошего самочувствия!

Белки и здоровье сердечно-сосудистой системы

Белки (иначе — протеины) входят в состав всех органов и тканей нашего тела. Мышцы — основной строительный материал для мышц. Миокард (сердечная мышца) — самый важный потребитель белка, потому что работает без перерыва.

Белки — это источник энергии. При интенсивных нагрузках организм извлекает из белка мышц глюкозу для питания мозга. Протеины входят в состав ферментов, гормонов, антител.

Недостаток белка приводит к нарушению водно-солевого обмена, потере веса за счет мышечной ткани, ослаблению иммунитета, сбоям сердечного ритма, воспалению миокарда и его оболочек.

Интересный факт. Протеин — источник энергии, но его расщепление требует много энергии. Исследования показали, что энергозатраты на переваривание белка составляют около 30 % от его собственной калорийности. Поэтому после плотной белковой пищи многим хочется сладкого («быстрых» углеводов для восполнения энергии).

Продукты, богатые белком

  • 1

    Бобовые: фасоль, горох, нут, чечевица, соя. Содержат растительный белок, который легко усваивается, сложные углеводы, клетчатку, макро- и микроэлементы.

  • 2

    Крупы: гречневая, перловая, ячневая, овсяная. Источники растительного белка, витаминов, минералов, «медленных» углеводов.

  • 3

    Рыба и морепродукты. Из употребление улучшает состояние сердечной мышцы и стенок сосудов, нормализует давление и снижает уровень «плохого» холестерина.

  • 4

    Яйца. Вы могли слышать, что яйца вредны для сосудов, так как содержат холестерин. Современные исследования показали, что употребление яиц почти не влияет на уровень холестерина в крови.

  • 5

    Курица, индейка. В куриной грудке белка больше, чем в бедрах или крыльях, а жира меньше.

  • 6

    Орехи содержат белок, много витаминов и минералов.

  • 7

    Молочные продукты, сыр. Содержат белок и животный жир.

Красное мясо и сердце

Много протеина содержится в красном мясе (говядина, свинина, баранина, конина).

Долгое время считалось, что красное мясо вредно для сердца, потому что в нем содержится много насыщенных жиров. Исследования последних лет доказали, что в процессе переваривания красного мяса образуется N-оксид триметиламин — вредное для почек, сердца и сосудов вещество. Но, несмотря на это, не стоит отказываться от красного мяса. Главное, как и везде, мера. Отдавайте предпочтение говядине или нежирной свинине, не ешьте их каждый день.

Важно! Переработанное мясо (колбаса, сосиски) вредны при заболеваниях сердца — это источники насыщенных жиров и лишней соли, а не белка.

Нормы белка

Американский центр по контролю и профилактике заболеваний рекомендует отводить белкам от 10 до 35 % дневной нормы калорий (в граммах это примерно 1,5–2,5 г белка на кг массы тела).

Список литературы

Идентификация белкового комплекса и количественный комплексом с помощью CN-PAGE

Дизайн эксперимента и воспроизводимость данных

Количественные протеомные исследования на основе ЖХ-МС / МС дают большие и информативные наборы данных, но подвержены большим вариациям, что отрицательно влияет на статистический анализ. Поэтому настоятельно рекомендуется обезопасить себя от технических изменений, разработав строгие и строгие рабочие процессы 14 . Следует проявлять особую осторожность при выборе подходящих методов, используемых для экстракции белковых комплексов, фракционирования и пробоподготовки для масс-спектрометрии, любой из которых или все они могут служить источником технических вариаций.Имея это в виду, мы разработали рабочий процесс, позволяющий обрабатывать экстракты природного белка для сравнительного анализа комплексома растений в различные суточные моменты времени. В этом подходе выделенные белковые экстракты разделяют с помощью нативного PAGE-фракционирования, после чего следует модифицированная процедура расщепления в геле и анализ тандемной масс-спектрометрией (рис. 1). Native-PAGE был выбран для разделения белков по сравнению с обычно используемым SEC, потому что он обеспечивает простое, эффективное и экономичное решение для фракционирования белка 10,12,15,16 .Это также позволяет создать экспериментальный план, при котором можно приготовить несколько копий образцов и запустить их параллельно на одном геле. Это, в свою очередь, снижает риск внесения дополнительных технических изменений, которые обычно связаны с подготовкой и разделением проб.

Рисунок 1

Визуальное представление экспериментального рабочего процесса, используемого для изучения комплексных изменений. Схематическое изображение рабочего процесса, используемого для изучения изменений в белковом комплексоме. Белковые экстракты получали из полностью разросшихся листьев Arabidopsis thaliana в нативных условиях и разделяли с помощью нативного PAGE.Затем белки переваривали с использованием модифицированной процедуры расщепления в геле, а пептиды обессоливали с использованием колонок C18. Полученные пептиды анализировали с помощью ЖХ-МС / МС, а необработанную спектральную информацию экспортировали в MaxQuant для идентификации белков и количественного определения без метки на основе пиков. Все последующие анализы данных были выполнены с использованием статистического программного обеспечения R.

В качестве доказательства концепции исследования мы решили проанализировать Arabidopsis thaliana Col-0 растений, собранных в конце светового периода (ED), когда растения являются фотосинтетически активными, и в конце ночи (EN), когда рост растений зависит от внутренних запасов углерода.Нативные белки и интактные белковые комплексы экстрагировали из четырех биологических повторностей при 4 ° C в буфере, не содержащем детергента, и разделяли с использованием 1D нативного PAGE. Нативный гель, приготовленный для этого исследования, показал высокую воспроизводимость разделения белков для всех дорожек. Это было необходимо для получения 20 фракций для каждого из восьми биологических образцов путем разрезания геля по всей ширине (дополнительный рис. 1). Чтобы свести к минимуму технические вариации и загрязнение, фракции образцов были подготовлены для масс-спектрометрического анализа с использованием HiT-Gel, недавно разработанного высокопроизводительного метода разложения в геле 17 .Необработанные спектральные данные 160 фракций образца были обработаны с помощью MaxQuant. Мы идентифицировали 2338 белков на основе уникальных пептидов в ED и 2469 в EN с перекрытием 88,3% между двумя условиями (рис. 2). Высокая степень перекрытия является предпосылкой для точного сравнения изменений комплексома при ED и EN. Перекрытие между биологическими повторами при ED и EN было представлено в виде диаграммы Венна (рис. 2) с перекрытием 92,5% (ED) и 87,6% (EN). Мы рассчитали коэффициент вариации (CV), используя относительное содержание белков всех идентифицированных белков в четырех биологических повторностях в обеих временных точках.Результат был представлен в виде гистограммы с нормальной кривой (дополнительный рис. 2A, B). Мы также использовали относительное содержание белков для всех идентифицированных белков в качестве входных данных для корреляционного анализа Пирсона между всеми возможными парами биологических реплик одного и того же состояния (рис. 2D). В каждом из парных сравнений мы обнаружили корреляцию выше 0,9. Таким образом, мы можем сделать вывод, что наш экспериментальный рабочий процесс приводит к воспроизводимым протеомным данным с большим количеством совпадений в идентифицированных белках и низкой вариабельностью от образца к образцу.Чтобы определить, не является ли высокая воспроизводимость между нашими экспериментами следствием горизонтального переноса, мы проводим дополнительный эксперимент. Такое же количество белкового экстракта (300 мкг) обрабатывали на двух центральных дорожках геля для электрофореза в ПААГ. Десять случайно выбранных гелевых фракций вырезали, обрабатывали и анализировали с помощью ЖХ-МС / МС (дополнительный рис. 2С). Всего было идентифицировано 20 белков, что предполагает минимальный горизонтальный перенос между полосами геля. Большинство идентифицированных белков аннотировано одним пептидом (дополнительный рис.2D).

Рисунок 2

Оценка идентификации и воспроизводимости белков в наборах данных. Количественная оценка необработанной спектральной информации без метки была выполнена в MaxQuant для создания наборов данных по белкам в ED и EN. ( A ) Перекрытие между всеми идентифицированными белками в ED и EN было представлено в виде диаграммы Венна. ( B ) В качестве меры воспроизводимости было рассчитано перекрытие 4 биологических повторов в ( B ) ED и ( C ) EN и отображено в виде диаграммы Венна.( D ) Корреляционную матрицу Пирсона использовали в качестве дополнительной меры воспроизводимости на уровне белка. Коэффициенты корреляции рассчитывались для белков попарно по всей матрице для каждой фракции каждой биологической реплики по сравнению с другой.

Профилирование белков и деконволюция профилей

Основной целью нашего исследования было создание эффективного метода сравнительного анализа белковых комплексов. После идентификации и количественной оценки белков были рассчитаны профили миграции всех белков по градиенту молекулярной массы, чтобы позволить дальнейший анализ данных, такой как кластеризация, идентификация белковых комплексов и статистический анализ изменений в содержании белковых комплексов между ED и EN.

В основе нашего конвейера обработки данных лежит статистическое программное обеспечение R. Наш конвейер анализа данных начинается с реконструкции профилей миграции белка путем объединения соседних фракций, вырезанных из геля. На следующем этапе мы идентифицировали локальные максимумы (пики) вдоль градиента молекулярной массы для каждого белка, используя функцию точек поворота (пакет pastecs) в R (рис. 3). Локальные максимумы были отфильтрованы, чтобы удалить максимумы ниже 20% от наивысшего относительного содержания вдоль профиля белка.

Рисунок 3

Схематическое изображение деконволюции профиля белка. Один белок из эксперимента ED был выбран в качестве примера, чтобы проиллюстрировать процедуру деконволюции профиля белка. В этом случае профиль элюции выбранного белка можно упростить до четырех отдельных пиков. На первом этапе алгоритм определяет локальные максимумы в сложном профиле элюирования. После определения локальных максимумов выполняется строгий процесс фильтрации для выявления отдельных пиков, которые, скорее всего, скрыты в сложном профиле.На этом этапе вновь идентифицированные пики сравниваются с локальными максимумами, и генерируются деконволютированные пики, где наблюдается четкое перекрытие.

Затем мы отделили кажущиеся массы для всех идентифицированных белковых пиков от их мономерных масс, которые мы получили из базы данных TAIR10 18 . Это предоставило нам обзор состояния олигомеризации (R app ) всех пиков белка, идентифицированных в наших экспериментах. Распределение видимых масс идентифицированных белков визуально суммировали с помощью диаграмм рассеяния (дополнительный рис.3). Мы применили двукратное отсечение мономерной массы к нашим данным, потому что ранее было показано, что это хороший порог для идентификации белков в олигомерных сборках 10,15 . Большинство идентифицированных белков (89%) в наших данных приходилось на фракции, соответствующие диапазонам размеров, превышающим их мономерную массу. Менее 11% пиков были идентифицированы в мономерном диапазоне, и белки испытали минимальную деградацию, на что указывает небольшое количество пиков с R app менее 0.5. Эти данные показывают, что большинство белков находится в комплексах. В качестве дополнительного доказательства белковых комплексов в наборе данных мы использовали гистограмму, чтобы суммировать распределение мономерных масс по сравнению с наблюдаемыми диапазонами размеров каждого локального максимума (дополнительный рис. 4). Гистограмма показала, что мономерные массы в основном наблюдались в узком и более низком окне диапазона масс, чем у кажущихся масс. Это еще раз подтверждает, что белковые комплексы фиксируются в нашем наборе данных.

Впоследствии каждую из хроматограмм белка деконволютировали на отдельные пики, которые представляют независимые гомо- или гетеромерные состояния олигомеризации белка. В случае взаимодействия белков белки, которые взаимодействуют с образованием сборки, также будут иметь общий пик. Из-за гетерогенного состава белковых комплексов не ожидается, что все возможные взаимодействующие элементы будут демонстрировать идентичные профили элюирования белка. Партнеры по взаимодействию могут скорее разделять одну вершину, но иметь общий очень отдаленный профиль.Следовательно, сложные белковые профили проблематичны в подходах к кластеризации, которые полагаются на евклидово расстояние между целыми профилями. После деконволюции каждый пик можно рассматривать как отдельный объект, независимый от других пиков в исходном профиле (рис. 3). Хотя деконволюция профиля была успешно реализована в анализе белковых комплексов млекопитающих на основе SEC, насколько нам известно, она не проводилась в исследованиях на растениях и в подходах, основанных на PAGE.

Мы использовали набор из 4 параметров для деконволюции профилей обилия белков. на изолированные пики.Вкратце, профиль анализировали, переходя от фракции к фракции и начиная с самой низкой молекулярной массы. В каждой позиции использовалось дерево решений. Только относительное содержание белка, превышающее 5% от максимального содержания в общем профиле, считалось частью деконволютированного пика (минимальный рассматриваемый сигнал). Если содержание фракции превышает содержание предыдущей, то профиль считается повышающимся к пику, а следующие фракции анализируются. Если численность снижается до <70% максимальной численности в текущем пике, сценарий считает, что профиль переходит на нисходящий уклон, и доля пика фиксирована.Пик считается завершенным, когда сигнал пересекает минимальный рассматриваемый сигнал или относительное содержание в следующей фракции увеличивается на> 30% по сравнению с предыдущей. Наконец, предполагаемый пик должен соответствовать еще двум критериям, чтобы его принял сценарий деконволюции: во-первых, записанная доля пика должна быть аннотирована в виде локальных максимумов (см. Выше), а во-вторых, относительное содержание в месте пика должно быть > 20% от максимальной численности в общем профиле.Затем мы удалили деконволютированные пики, представляющие мономерное состояние, сравнив размер каждого пика с мономерной молекулярной массой соответствующего белка согласно базе данных TAIR10.

Недавние подходы к изучению комплексома у растений не смогли преодолеть проблему, представленную сложными профилями белков в экспериментах по нативному фракционированию 10,15,16 . Чтобы обойти проблему формы пика и множественных пиков на профиль белка, исследователи сосредоточили свой анализ на положении максимального содержания белка в профиле и рассмотрели белки с аналогичными максимумами в качестве предполагаемых партнеров по взаимодействию.Это решение действительно дает представление об образовании белковых комплексов, но исключает возможность идентификации совместно элюируемых белковых комплексов в остальных фракциях. Ранее сообщалось, что деконволюция профилей элюирования является возможным решением, и мы применили наш собственный метод деконволюции для решения проблемы 12 . Используя двукратное отсечение молекулярной массы, чтобы исключить деконволютированные пики, представляющие мономерные белки, мы обнаружили 1768 (ED) и 1758 (EN) белков в диапазоне размеров, указывающих на образование белкового комплекса (рис.4A – C) с перекрытием 1798 белков между ED и EN. Большинство (приблизительно 74%) белков показывают только один пик, указывающий на образование комплекса, в то время как приблизительно 16% имеют два пика, 7% 3 и 2% 4 пика (фиг. 4D). Пять пиков наблюдались только примерно в 1% белков. Следовательно, большинство белков обнаруживается только в одном белковом комплексе в нашем собственном анализе PAGE.

Рисунок 4

Оценка идентификации белкового комплекса между ED и EN.Перекрытие между белковыми комплексами, идентифицированными в каждом из биологических повторений в ( A ) ED и ( B ) EN, было рассчитано и визуализировано в виде диаграмм Венна. ( C ) Также была составлена ​​диаграмма Венна, чтобы показать перекрытие между общим количеством белка в комплексах, идентифицированных в ED и EN. ( D ) Белки, которые участвуют в образовании комплекса, должны иметь по крайней мере один пик в дополнение к их мономерному пику. Чтобы проиллюстрировать вероятность образования комплекса, количество пиков, продуцируемых каждым белком, было визуализировано в виде столбчатой ​​диаграммы.

Влияние деконволюции профиля на анализ данных

Чтобы продемонстрировать значение деконволюции, мы использовали профиль элюции аспартат-полуальдегиддегидрогеназы (AT1G14810) в качестве примера (рис. 5A). После деконволюции исходного профиля распределения по размерам мы получили три различных пика. Затем все пики после деконволюции были сгруппированы на основе их евклидова расстояния. Три пика аспартат-полуальдегиддегидрогеназы были идентифицированы в трех независимых кластерах. Далее мы проанализировали кластеры с использованием аннотаций GO 19 для идентификации функционально связанных белков.В каждом из кластеров были идентифицированы функционально связанные белки, которые потенциально могут образовывать комплекс с аспартат-полуальдегиддегидрогеназой (рис. 5А). Предполагаемые партнеры по взаимодействию уникальны для каждого кластера. Мы предполагаем, что аспартат-полуальдегиддегидрогеназа образует различные олигомерные комплексы в разных диапазонах размеров. Идентификация этих кластеров не была возможна с использованием исходного и сложного белкового профиля аспартат-полуальдегиддегидрогеназы. Этот подход также можно использовать для эффективной идентификации более крупных комплексов с множеством субъединиц (рис.5Б). Однако он ограничен сложностью данных и не предназначен для однозначного прогнозирования новых взаимодействий. Тем не менее, данные могут быть полезны для подтверждения предсказанных взаимодействий или образования метаболонов в конкретном метаболическом пути. Кроме того, это может также помочь в подтверждении присутствия известных белковых партнеров в пути или предложить новые предполагаемые взаимодействия, которые будут руководить будущими исследованиями взаимодействия белков в меньшем масштабе.

Рисунок 5

Важность деконволюции белкового профиля для идентификации белковых комплексов.Профиль миграции аспартат-полуальдегиддегидрогеназы деконволюционировал до трех отдельных пиков. ( A ) Каждый из деконволютированных пиков был обнаружен в отдельном кластере после анализа иерархической кластеризации. Визуально были представлены профили белков, обнаруженных в одном кластере, которые также функционируют в том же клеточном процессе, что и аспартат-полуальдегиддегидрогеназа. Слева: окислительно-восстановительный процесс (AT1G14810_1), процесс биосинтеза метионина (AT1G14810_2), процесс биосинтеза лизина через диаминопимелат (AT1G14810_3).( B ) Чтобы определить влияние деконволюции на очень сложные профили белков, показан профиль элюции ряда белков пентозофосфатного пути. На верхней панели деконволюция не применяется, и в результате иерархическая кластеризация не может использоваться для идентификации белков как находящихся в комплексе. На нижней панели была выполнена деконволюция, которая дала четко определенные пики, которые можно было использовать в том же подходе иерархической кластеризации для идентификации комплекса из 16 белков.

Было обнаружено, что большинство белков в наборах данных существуют как белковые сборки (рис. 4, дополнительные рис. 3 и 4). Поскольку эти сборки должны быть стабильными в естественных условиях, субъединицы этих белковых комплексов должны оставаться собранными во время разделения и давать сопоставимые профили миграции. Мы решили рассчитать евклидово расстояние между всеми возможными парами деконволютированных пиков как меру сходства. Чтобы определить евклидово расстояние отсечения, которое отделяет прогнозы взаимодействия от пар невзаимодействующих белков, был проведен анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC).Кривые ROC требуют набора данных истинно положительных и истинно отрицательных пар белков (TP и TN). Набор данных TP был создан с использованием белковых комплексов Arabidopsis, аннотированных в категории TAIR GO «белковый комплекс» (GO: 0043234). Набор данных TN состоит из пар белков, причем один белок является частью набора TP, а второй выбирается случайным образом из оставшегося набора данных. Кривые ROC были построены для данных ED и EN с использованием как исходного, так и деконволютированного профиля белка (дополнительный рисунок 5). Каждая точка на кривой ROC представляет собой истинно положительный показатель (TPR), также называемый чувствительностью, и ложноположительный показатель (FPR), или 1-специфичность, в парах белков, которые считаются взаимодействующими на определенном пороговом евклидовом расстоянии.Мы наблюдали крутой подъем наших кривых ROC с сильным отклонением от линии отсутствия дискриминации. Это показывает, что по мере постепенного увеличения отсечения Евклидова расстояния истинно положительные взаимодействия обнаруживаются быстрее, чем ложноположительные взаимодействия (дополнительный рис. 5). Более того, кривые ROC, рассчитанные на основе профилей деконволюции белков, показали немного лучшую кривую, указывающую на то, что деконволюция способствовала повышению специфичности и чувствительности. Наши кривые ROC также показали более высокую чувствительность и специфичность, чем сообщалось ранее для аналогичных исследований, что подтверждает качество сгенерированных наборов данных 12,20 .

Реконструкция биологически значимых путей

Чтобы оценить качество нашего набора данных, мы выбрали белки из биологически значимых путей и реконструировали белковые комплексы, используя деконволюцию пиков.

Первый белковый комплекс, протеасома, также является предпочтительным эталонным комплексом для оценки качества набора данных в других исследованиях 10,15,16 . Этот комплекс присутствует во всех эукариотических клетках и отвечает за деградацию белков в цитозоле.Протеасома состоит из каталитической 20S ядерной частицы (CP) и 19S регуляторной субъединицы (RP) 21 . Визуально представленная в виде тепловой карты, мы смогли обнаружить как CP, так и RP в легко различимых кластерах (рис. 6). Центральная субъединица также была идентифицирована в меньшем диапазоне размеров, чем регуляторная субъединица, что соответствует литературным данным 22 . Однако нам не удалось обнаружить полностью собранную протеасому. Этого и следовало ожидать, поскольку полностью собранная протеасома A.thaliana имеет молекулярную массу приблизительно 2MDa и не может быть эффективно захвачен с помощью нативного метода PAGE.

Рисунок 6

Перемещение профилей протеасомных субъединиц белка. Белковые профили субъединиц, составляющих протеасомный комплекс, исследовали в ( A ) ED и ( B ) EN. Показанные тепловые карты представляют собой профили элюирования деконволютированных белков, которые принадлежат регуляторным и коровым субъединицам протеасомного комплекса.Профили белков были нормализованы до максимального значения. Зеленые области указывают фракцию, в которой наблюдалось наибольшее содержание белка. Коммиграция наблюдалась для составляющих регуляторных и основных субъединиц протеасомного комплекса. Справа от тепловых карт показаны профили элюирования белка, используемые для создания соответствующих тепловых карт. ( C ) Сравнение содержания протеасомных белков проводили в ED и EN. Общее содержание каждого из белков, принадлежащих основной (слева) и регуляторной (справа) субъединицам протеасомы, сравнивали между двумя временными точками.Содержание каждого из белков было суммировано по фракциям и представлено желтыми и синими кружками для ED и EN, соответственно.

На основании аннотаций в базе данных KEGG CP должен присутствовать в виде гетеромерной сборки из 23 α- и β-субъединиц, в то время как RP состоит из 32 белков 23 . Использование SEC-подхода для изучения белковых комплексов Arabidopsis Aryal et al . 10 восстановило 16 (70%) белков ЦП и 3 белка (9.3%) от РП. Мы идентифицировали 20 (87%) и 22 (95%) совместно мигрирующих белков CP в ED и EN, соответственно (рис. 6). Для RP удалось обнаружить 24 (75%) совместно мигрирующих белка в ED и EN (фиг. 6). Этот анализ показывает, что наш подход является высоко воспроизводимым и обеспечивает улучшенное покрытие протеасомы по сравнению с предыдущими исследованиями 10,16 . Мы также расширили этот анализ, чтобы сравнить относительные количества белков, которые образуют субъединицы протеасомы в ED и EN (рис.6). Наблюдалось, что распределение белковых соотношений является стабильным, что указывает на воспроизводимость измерений в оба момента времени.

В качестве второго анализа мы намеревались исследовать состояния олигомеризации определенных ферментов в хорошо известном метаболическом пути. С этой целью мы выбрали цикл трикарбоновой кислоты (ТСА). Цикл TCA присутствует в митохондриях и управляет клеточным дыханием в окислительных условиях. Было высказано предположение, что ферменты в цикле TCA способны образовывать супрамолекулярные комплексы со слабыми и временными взаимодействиями 24,25 .

Чтобы проверить эту теорию, мы применили наш метод для исследования 63 ферментов из базы данных KEGG, которые участвуют в реакциях цикла TCA и обратного цикла TCA (рис. 7A). Из этих 63 назначенных белков мы смогли обнаружить 40 (63,5%). Почти все обнаруженные ферменты имели состояние олигомеризации (R примерно ) более двух, что указывает на образование комплекса (дополнительная таблица 1). Чтобы определить, какие из ферментов могут взаимодействовать друг с другом, мы выбрали ферменты, которые участвуют в восьми основных реакциях пути, и сравнили их профили элюирования.Почти на всех каталитических стадиях мы могли наблюдать, что ферменты имели очень похожие профили элюирования по градиенту размера, что позволяет предположить, что они могли образовывать белковый комплекс (рис. 7B).

Рисунок 7

Использование цикла TCA в качестве основы для тестирования идентификации белковых комплексов. Используя базу данных KEGG в качестве справочной, была составлена ​​блок-схема цикла TCA. На этой диаграмме ферменты, катализирующие индивидуальные реакции превращения субстрата, отмечены узлами.Эта блок-схема служила каркасом, на котором было выполнено сравнение узлов с набором данных ED. Удалось проверить почти все реакции превращения, за исключением сукцинил-КоА в сукцинат. Ферменты, участвующие в этом этапе, не были обнаружены ни в одной из экспериментальных повторностей. Впоследствии профили белков всех обнаруженных ферментов в каждом отдельном узле были объединены, чтобы наглядно проиллюстрировать возможности нашего метода для обнаружения взаимодействий между белками и белками. ( B ) Графический обзор сети взаимодействия PPI, спрогнозированный для цикла TCA с использованием набора данных ED.( C ) Показано совпадение между ИЦП, обнаруженными в наборе данных ED, и ИЦП, определенными Чжаном и его коллегами26. ( D ) Взаимодействия, выявленные между ферментами, которые катализируют последовательные реакции в цикле TCA, о которых не сообщалось Zhang и соавторами26 ( E ) Прогнозируемые белковые взаимодействия внутри ферментных белковых комплексов аконитазы (слева) и цитратлиазы АТФ (справа) . Прогнозируемые взаимодействия наблюдались с использованием отсечки Евклидова расстояния, как было заранее определено с помощью анализа кривой ROC (10% FDR).Ферменты и их изоформы представлены узлами, а соединяющие их ребра показывают потенциальные взаимодействия.

Другой важный метод регуляции метаболизма зависит от микрокомпартментации ферментов, также известных как образование метаболонов 26,27,28 . Недавно Zhang и соавторы показали каналирование субарет во взаимодействии цикла TCA и выявили сам интерактом 29 . Используя эти данные PPI в качестве эталона, мы провели анализ белковых комплексов в отделении неотложной помощи.Чтобы идентифицировать потенциальные ИПП, в нашем анализе CN-PAGE мы вычислили евклидово расстояние между деконволютивными пиками всех ферментов, связанных с циклом TCA. Используя наш анализ кривой ROC, мы установили порог евклидова расстояния на основе 10% отсечки FDR. Если рассчитанное евклидово расстояние между двумя пиками после деконволюции было меньше порогового значения, мы считали, что белковая пара взаимодействует. Мы идентифицировали 27 ферментов, связанных с циклом TCA, с сетью из 74 взаимодействий (рис. 7B).Сеть взаимодействия, описанная Zhang et al . состоит из 158 взаимодействий между 38 белками, аннотированными в цикле TCA 29 . Сравнивая два исследования, было обнаружено, что перекрываются только 11 белков. Эти белки производили 14 взаимодействий в исследовании Zhang et al . Из этих 14 PPI только два (ACO2 | ACO3 и ACO3 | IDH6) также наблюдались в нашем анализе взаимодействий между ферментами цикла TCA 29 (рис. 7C).

В то время как исследование Zhang и соавторов сообщило о существовании метаболонов в цикле TCA, небольшое совпадение между данными их взаимодействия с белками и нашим подходом CN-PAGE указывает на то, что PPI и образование метаболонов в цикле TCA еще не полностью решены. .Метаболоны определяются как взаимодействия последовательных ферментов метаболического пути, которые позволяют эффективно направлять метаболиты 26,28,30 . Поэтому мы проанализировали 74 PPI, предсказанные анализом кривой ROC для взаимодействий между последовательными ферментами цикла TCA, о которых не сообщалось Zhang et al . Мы наблюдали взаимодействие субъединицы аконитазы ACO2 с субъединицей изоцитратдегидрогеназы IDH6. Кроме того, в нашем наборе данных предполагалось, что две оставшиеся субъединицы изоцитратдегидрогеназы (IDh2 и IDH5) и кетоглутаратдегидрогеназа (ODC1-1) будут взаимодействовать.Наконец, мы предсказали взаимодействие между субъединицей цитратсинтазы (CSY4) с ACO1 (рис. 7D). Об этом конкретном взаимодействии не сообщили Чжан и его сотрудники 29 . Однако образование метаболона между MDH, CYS и ACO было описано до 31 .

Кроме того, наши данные предполагают взаимодействия между известными белковыми комплексами, аконитазой (ACO) и тремя субъединицами цитратлиазы АТФ (ACL), которые играют важную роль в восстановительном цикле TCA 32 (рис.7E). Хотя для подтверждения этого предполагаемого взаимодействия требуются дальнейшие эксперименты, интересно предположить, что может происходить образование метаболона между ACO и ACL и поддерживать передачу субстратов от изоцитрата через цитрат к оксалоацетату.

Мы также предположили, что состояние олигомеризации ферментов может зависеть от факторов окружающей среды, таких как свет и температура. Поскольку цикл TCA работает в разных режимах при свете и в темноте, мы использовали наши наборы данных ED и EN для проверки этой гипотезы 33 .Однако мы не смогли наблюдать никаких изменений в состоянии олигомеризации ферментов, связанных с циклом TCA, между двумя временными точками (дополнительная таблица 1). Было показано, что перестройки взаимодействия между комплексами цикла TCA играют роль в ответе растительных клеток на окислительный стресс 34 . Отсутствие значительных изменений между ED и EN может указывать на то, что в нормальных условиях роста растения регулируют активность ферментов цикла TCA независимо от состояния олигомеризации — потенциально с помощью посттрансляционных модификаций 35,36,37 .Также возможно, что перестройки в белковых комплексах цикла TCA между ED и EN незначительны и не могут быть разрешены с помощью нашего экспериментального подхода. Более того, изменения в сложном составе или содержании между ED и EN могут происходить в основном в нестабильных ИЦП, которые, как правило, недостаточно представлены в нашем наборе данных.

В будущих экспериментах установленный конвейер обработки проб и анализа данных может быть применен для изучения изменений в содержании и составе белковых комплексов в ответ на изменения в окружающей среде или вслед за восприятием биотического или абиотического стресса.

Количественный анализ комплексомов в ED и EN

Мы продолжили развитие нашего подхода к количественному сравнению белковых комплексов и применили его для изучения комплексома A. thaliana в ED и EN. Высокая воспроизводимость данных позволила нам сравнить изменения относительного содержания белковых комплексов между двумя временными точками. Площадь под кривой (AUC) была рассчитана для всех идентифицированных белков на основании профилей миграции после деконволюции.Используя отсечение Евклидова расстояния, полученное анализом кривой ROC (дополнительный рис. 5), были идентифицированы профили, предположительно представляющие белки одного и того же белкового комплекса. Затем данные были отфильтрованы для белков, которые присутствовали как в наборе данных ED, так и в EN. Это позволило нам специально исследовать изменения численности в отдельные моменты времени и в то же время исключить изменения, вносимые составом белка. Затем вычисляли среднее значение AUC для каждого из белковых комплексов и сравнивали между временными точками.Рассчитанные таким образом отношения показаны в виде горизонтальной гистограммы (фиг. 8A). Парный t-критерий использовался для проверки значимости наблюдаемых изменений. В то время как большинство белковых комплексов, которые мы идентифицировали, не показали значительных изменений в содержании между ED и EN, скопления пластидных рибосом показали более высокое содержание в EN, чем в ED (рис. 8B). На первый взгляд это наблюдение кажется противоречащим предыдущим исследованиям, которые показали, что количество рибосомных белков стабильно в течение всего суточного цикла у растений 38 .Однако было показано, что трансляционная активность рибосом днем ​​выше, чем ночью 39 . Сборки рибосом, разрешенные в нашем собственном анализе PAGE, имеют размер менее 1MD и, следовательно, представляют собой не полностью собранные рибосомы, необходимые для трансляции, а отдельные субъединицы. Это можно объяснить молекулярной массой полностью собранной пластидной рибосомы, которая составляет приблизительно 2 МДа и превышает диапазон размеров прозрачного геля нативного ПААГ, использованного в этом исследовании.Однако малая субъединица имеет молекулярную массу около 650 кДа и может растворяться в геле. Большая субъединица составляет примерно 1300 кДа и соответствует верхнему пределу диапазона размеров геля 40,41 . Следовательно, более высокое количество сборок рибосомных белков, которые мы наблюдали, показывает, что неактивные рибосомы разбираются в течение ночи, и их субъединицы могут быть разделены в нашем собственном PAGE. Это объяснение также подчеркивает способность нашего метода точно определять, когда происходят изменения относительного содержания белка в белковых комплексах.

Рисунок 8

Комплексом Arabidopsis в ED и EN. Относительное содержание белковых комплексов из базы данных GO-Slim сравнивали в ED и EN. Были рассчитаны отношения AUC для субъединиц белкового комплекса, идентифицированные в ED и EN, и усреднены для белков, принадлежащих к одному и тому же комплексу. ( A ) Количество белков, из которых состоит комплекс. ( B ) Гистограмма общего содержания рибосомных белков, обнаруженных в каждой фракции геля.Анализ проводился для всех перекрывающихся рибосомных белков, которые присутствовали в обоих экспериментах.

Характеристика белкового комплекса, содержащего сплайсосомные белки SAPs 49, 130, 145 и 155

Mol Cell Biol. 1999 Oct; 19 (10): 6796–6802.

Отделение клеточной биологии Гарвардской медицинской школы, Бостон, Массачусетс

* Автор, ответственный за переписку. Почтовый адрес: Департамент клеточной биологии Гарвардской медицинской школы, 240 Longwood Ave., Boston, MA 02115.Телефон: (617) 432-2844. Факс: (617) 432-3091. Электронная почта: [email protected]

Поступила в редакцию 11 мая 1999 г .; Изменения запрошены 23 июня 1999 г .; Принято 9 июля 1999 г.

Copyright © 1999, Американское общество микробиологов. Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

SF3b представляет собой U2 snRNP-ассоциированный белковый комплекс, необходимый для сборки сплайсосом. Хотя доказательства того, что SF3b содержит сплайсосомные белки SAPs 49, 130, 145 и 155, накопились, опосредованная белками ассоциация между всеми этими белками еще не была продемонстрирована напрямую.Здесь мы сообщаем о выделении кДНК, кодирующей SAP 130, которая завершает клонирование предполагаемых сложных белков SF3b. Используя антитела к SAP 130 и другим предполагаемым компонентам SF3b, мы показали, что SAP 130, 145 и 155 присутствуют в белковом комплексе в ядерных экстрактах и ​​что эти белки связываются друг с другом в очищенном U2 snRNP. Более того, SAP 155 и 130 взаимодействуют друг с другом (прямо или косвенно) внутри этого комплекса, а SAP 49 и 145, как известно, взаимодействуют друг с другом напрямую.Таким образом, вместе с предыдущей работой, наши исследования показывают, что SAP 49, 130, 145 и 155 действительно являются компонентами SF3b. Гомологи Saccharomyces cerevisiae SAP 49 и 145 кодируются основными генами. Мы показываем здесь, что гомологи S. cerevisiae SAP 130 и 155 (scSAP 130 / RSE1 и scSAP 155, соответственно) также важны. Недавно белки SF3b были обнаружены в очищенном snRNP U12, который функционально замещает snRNP U2 в минорной сплайсосоме. Этот высокий уровень консервативности вместе с предыдущим наблюдением, что белки SF3b взаимодействуют с пре-мРНК очень близко к сайту разветвления, позволяют предположить, что комплекс SF3b играет критическую роль вблизи или на каталитическом ядре сплайсосомы.

Было идентифицировано множество белков, необходимых для сборки и сплайсинга сплайсосом, и теперь известны многочисленные человеческие гомологи основных факторов сплайсинга дрожжей (обзоры см. Ссылки 19, 20, 24 и 29). К числу наиболее охарактеризованных из них относятся компоненты мяРНП U2 (обзоры см. В ссылках 19, 20 и 29). У млекопитающих функциональный 17S U2 snRNP может быть собран из 12S U2 snRNP и двух основных факторов сплайсинга, SF3a и SF3b (5, 6). SF3a очищен до гомогенности и содержит три белка (SF3a60, SF3a66 и SF3a120) (5, 6).SF3b был очищен с помощью нескольких хроматографических стадий, но не был очищен до гомогенности (5, 6). Компоненты, которые, как считается, составляют SF3b, были идентифицированы путем сравнения очищенного 17S U2 snRNP и сплайсосомного комплекса A (обзоры см. В ссылках 14 и 19). Обильные белки, общие для обоих этих комплексов, обозначаются как SF3b 53, 120, 150 и 160 в 17S U2 snRNP и SAP 49, 130, 145 и 155, соответственно, в сплайсосоме (здесь мы используем последнюю номенклатуру) ( 2, 6, 19).Дальнейшие доказательства того, что по крайней мере два из этих белков являются компонентами SF3b, получены из наблюдения, что SAP 49 и 145 взаимодействуют напрямую друг с другом (7). Кроме того, SAP 49, 145 и 155, а также все три субъединицы SF3a могут быть УФ-сшиты с областью, окружающей сайт разветвления в сплайсосомном комплексе A (11, 12). Таким образом, все эти белки расположены рядом друг с другом в функциональных сплайсосомных комплексах, что согласуется с представлением о том, что они присутствуют в комплексе. Несмотря на все косвенные доказательства того, что SAP 49, 130, 145 и 155 соответствуют SF3b, остается установить, действительно ли какие-либо из этих белков или все они являются компонентами единого белкового комплекса.

Все компоненты SF3a млекопитающих и три предполагаемых компонента SF3b (SAP 49, 145 и 155) были клонированы (19). Кроме того, были идентифицированы дрожжевые аналоги SF3a, которые, как было показано, необходимы для жизнеспособности (обзор см. В ссылке 19). В отличие от SF3a, ни один из предполагаемых компонентов SF3b не был идентифицирован на ранних генетических скринингах факторов сплайсинга дрожжей. Однако вероятные гомологи Saccharomyces cerevisiae SAP 145 и 155, scSAP 145 и scSAP 155 были идентифицированы в базе данных GenBank на основании их сходства с соответствующими белками млекопитающих (7, 12, 26).Один из этих белков, scSAP 145, впоследствии оказался таким же, как CUS1, белок, идентифицированный как супрессор мутации мяРНК U2 (27). scSAP 145 необходим для сборки комплекса у дрожжей (27). scSAP 49 / HSh59 также был идентифицирован в базе данных и, как было показано, важен для жизнеспособности дрожжей (15). Дрожжевые SAP 49 и 145, как и их аналоги у млекопитающих, напрямую взаимодействуют друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий и, таким образом, считаются компонентами дрожжевого комплекса SF3b (10, 15).Пока не известно, важен ли scSAP 155 для дрожжей или существует дрожжевой аналог SAP 130.

Здесь мы сообщаем об выделении кДНК, кодирующей SAP 130. Используя антитела к этому белку, а также антитела к другим предполагаемым компонентам SF3b, мы показали, что SAP 130, 145 и 155 присутствуют в белковом комплексе и что SAP 130 и 155 взаимодействуют (прямо или косвенно) друг с другом в этом комплексе. Вместе с предыдущей работой наши данные убедительно свидетельствуют о том, что SAP 49, 130, 145 и 155 являются компонентами SF3b.Мы также завершили описание дрожжевых аналогов SF3b, идентифицировав гомолог S. cerevisiae SAP 130 и продемонстрировав, что он и scSAP 155 важны для дрожжей. Таким образом, вместе данные показывают, что сплайсосомные белки SAPs 49, 130, 145 и 155 являются компонентами высококонсервативного белкового комплекса, необходимого для сплайсинга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение кДНК SAP 130.

Сплайсосомный комплекс A3 ‘был продуцирован в больших количествах путем инкубации биотинилированной пре-мРНК AD3’ENH (которая не имеет 5’-сайта сплайсинга, но содержит экзонный энхансер) в крупномасштабных реакциях сплайсинга (11 мл) (3, 9).Комплекс A3 ‘выделяли гель-фильтрацией с последующим связыванием с авидиновой агарозой. Общий белок из очищенного комплекса A3 ‘затем фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), и полосу SAP 130 вырезали из геля, окрашенного кумасси бриллиантовым синим. Две последовательности (NVSEELDRTPPEVSK и KLEDIRTRYAF) были получены с помощью микросеквенирования (W. Lane, Microchemistry Facility, Гарвардский университет). Эти последовательности кодируются частичной кДНК в базе данных GenBank (номер доступа.{«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «T92977», «term_id»: «724890», «term_text»: «T92977»}} T92977). На основе этой последовательности были сконструированы олигонуклеотидные зонды для скрининга библиотек кДНК бактериофага λ человека. Частичная кДНК, кодирующая 718 аминокислот от карбоксильного конца SAP 130, была выделена из этого скрининга. Чтобы выделить 5′-конец кДНК SAP 130, мы использовали быструю амплификацию концов кДНК и амплификацию ПЦР (кДНК Marathon Ready; Clontech). Полноразмерную кДНК SAP 130 получали путем соединения клонов 5′- и 3’-кДНК.

Вестерн-анализ и иммунопреципитация.

Кроличьи поликлональные антитела были индуцированы против карбоксиконцевой пептидной последовательности SAP 130, VSKKLEDIRTRYAF (HRP Inc). Были описаны моноклональные антитела cap (4) и B «(13) и кроличьи поликлональные антитела SAP 155 (26), SAP 145 (23) и hPrp17 (31). Поликлональные антитела кролика SF3a будут описаны в другом месте (9a). Для вестерн-блоттинга сплайсосомные комплексы выделяли гель-фильтрацией с последующей аффинной очисткой биотин-авидин (2, 21).Суммарные белки фракционировали на SDS – 6% полиакриламидных гелях, а затем иммобилизовали на поливинилидендифторидных мембранах. Поликлональные антитела использовали в разведении 1/1000, а вторичные козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, использовали при 1/5000. Блоты блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,1% твин 20. Белки определяли с помощью набора ECL (Amersham). Иммунопреципитацию U2 snRNP с кэпом или B «антителом проводили путем связывания антитела с протеином G-сефарозой и затем вращения с ядерным экстрактом в течение 4 часов.После обширной промывки 250 мМ NaCl – 20 мМ Трис (pH 7,8) белки элюировали SDS, РНКазой A или 1 М мочевиной, как указано ниже.

Иммунопреципитацию элюатов РНКазы и мочевины проводили путем вращения с указанными антителами с последующей промывкой 250 мМ NaCl – 20 мМ Трис (pH 7,8).

Нарушение scSAP 130 и 155 в
S. cerevisiae.

Разрушение scSAP 130 проводили с использованием стандартных процедур гомологичной рекомбинации (22).Вкратце, примерно 0,5 т.п.н. 5′-фланкирующей области и примерно 0,5 т.п.н. 3′-фланкирующей области гена SAP 130 амплифицировали из общей геномной ДНК дрожжей с помощью ПЦР с соответствующими праймерами. Эти фланкирующие области затем клонировали по обе стороны от гена LEU для получения плазмиды pscSAP 130Δ :: LEU . Эту плазмиду расщепляли с помощью Alw NI на 5′-конце и Stu I на 3′-конце фланкирующих SAP 130 областей, и ДНК использовали для трансформации диплоидного штамма дрожжей дикого типа.Для разрушения scSAP 155 1,229 т.п.н. 5′-фланкирующей области и 761 п.н. 3′-фланкирующей области гена SAP 155 амплифицировали из общей геномной ДНК дрожжей с использованием ПЦР и соответствующих праймеров. Эти фланкирующие области затем клонировали по обе стороны от гена LEU для создания плазмиды pscSAP 155Δ :: LEU . Эту плазмиду расщепляли Apa I на 5′-конце и Xba I на 3′-конце фланкирующих областей SAP 155, и ДНК использовали для трансформации диплоидного штамма дрожжей дикого типа.Трансформанты отбирали на чашках без лейцина, и правильную интеграцию гена LEU в локус SAP 130 проверяли анализом по Саузерну. Трансформанты спорулировали и тетрады препарировали стандартными процедурами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение кДНК человеческого SAP 130.

Для выделения кДНК, кодирующей SAP 130, мы очистили сплайсосомный комплекс A в больших количествах (3). Белки в этом комплексе фракционировали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле, и пептидные последовательности получали из продуктов триптического расщепления SAP 130.Эти последовательности использовали для выделения полноразмерной кДНК (см. Материалы и методы). Предполагается, что кДНК SAP 130 кодирует белок из 1217 аминокислот с молекулярной массой 130 кДа и изоэлектрической точкой 5,10 (рис.). Инициатору метионина предшествует хорошо законсервированная последовательность Козака, и рамка считывания закрыта перед этим метионином, что указывает на то, что кДНК кодирует полноразмерный белок SAP 130 (18) (данные не показаны).

Прогнозируемая аминокислотная последовательность кДНК SAP 130.Показана аминокислотная последовательность, предсказанная на основе последовательности кДНК SAP 130 человека. Две пептидные последовательности, полученные в результате микросеквенирования, подчеркнуты один или два раза, а пептид, используемый для получения антител, заключен в рамку.

Для дальнейшей характеристики кДНК SAP 130 мы подняли кроличьи поликлональные антитела к С-концевому пептиду (рис.). Это антитело является высокоспецифичным для SAP 130, поскольку оно обнаруживает только одну полосу 130 кДа в общих экстрактах ядер клеток HeLa (рис. A). Белок, продуцируемый in vitro трансляцией кДНК SAP 130, совпадает с белком, обнаруженным на Вестерн-блоттинге антителами к SAP 130 (рис.А). Антитела SAP 130 также обнаруживают белок SAP 130 в аффинно-очищенных сплайсосомных комплексах (рис. B и C). Этот белок связывается со сплайсосомами через 10 минут сборки и остается связанным на протяжении всего времени сплайсинга (рис. B и C). Антитело SAP 130 также специфически иммунопреципитирует продукт трансляции кДНК SAP 130 in vitro (данные не показаны). Вместе эти наблюдения показывают, что мы выделили полноразмерную кДНК, кодирующую сплайсосомный белок SAP 130. Антитела SAP 130 не иммунопреципитируют сплайсосому или U2 snRNP из экстрактов сплайсинга, что указывает на то, что эпитоп (14 остатков на С-конце [фиг. .]) недоступен в этих комплексах (данные не показаны).

Антитела SAP 130 обнаруживают одну полосу ~ 130 кДа в ядерном экстракте и сплайсосомных комплексах. (A) Продукт трансляции кДНК SAP 130 in vitro сочетается с белком в ядерном экстракте, который обнаруживается антителами к SAP 130. (B) 32 Р-меченая большая поздняя пре-мРНК аденовируса инкубировали в условиях сплайсинга в течение указанного времени, а затем общую РНК фракционировали на 15% денатурирующем геле.Указаны промежуточные продукты и продукты сращивания. (C) Антитела SAP 130 использовали для зондирования вестерн-блоттинга очищенных сплайсосомных комплексов, собранных в течение указанного времени в условиях сплайсинга. IVT, перевод in vitro.

SAP 130, 145 и 155 существуют в белковых комплексах в ядерных экстрактах и ​​в U2 snRNP.

Как упоминалось во введении, SAP 49, 130, 145 и 155 являются компонентами 17S U2 snRNP и предполагаемыми компонентами важного фактора сплайсинга SF3b (5, 6).Чтобы определить, связаны ли эти белки друг с другом в экстрактах сплайсинга и, таким образом, могут ли они соответствовать комплексу SF3b, мы провели анализы коиммунопреципитации. Используемые антитела были направлены против snRNP-специфического триметильного кэпа, U2 snRNP-специфического белка B «, SAP 130, 145 и 155 и hPrp17 (см. Материалы и методы). Как показано на фиг. A, все сплайсосомные snRNP были иммунопреципитированы антикап-антителами, а один U2 snRNP иммунопреципитировался анти-B «, анти-SAP 145 и анти-SAP 155.Ни один из snRNP не подвергался иммунопреципитации под действием антител против SAP 130 (см. Выше) или отрицательного контроля против hPrp17.

SAP 130, 145 и 155 являются частью белкового комплекса в ядерных экстрактах. (A) Указанные антитела использовали для иммунопреципитации из общих ядерных экстрактов (NE). Тотальную РНК фракционировали на 8% денатурирующем геле. Указаны мяРНК и тРНК. (B) Аликвоту каждого иммунопреципитата фракционировали на SDS – 6% полиакриламидном геле, а затем вестерн-блоты зондировали указанными антителами (α).(C) То же, что и панель B, за исключением того, что ядерный экстракт инкубировали с 2 мкл РНКазы A (10 мг / мл) перед иммунопреципитацией.

Вестерн-анализ показал, что SAP 155, 145 и 130 присутствовали во всех иммунопреципитатах, которые содержали мяРНК U2 (рис. B). Таким образом, как и ожидалось, эти белки являются компонентами мяРНП U2. Чтобы определить, существуют ли эти белки в составе белкового комплекса независимо от мяРНК U2, мы предварительно инкубировали ядерные экстракты в РНКазе А, которая полностью переваривала мяРНК (данные не показаны).Затем проводили иммунопреципитацию с антителами, описанными выше. Как показано на фиг. C, SAP 155, 145 и 130 больше не обнаруживаются в иммунопреципитатах anti-cap или anti-B «. Напротив, все три белка обнаруживаются в иммунопреципитатах anti-SAP 145 и anti-SAP 155. данные показывают, что SAP 130, 145 и 155 существуют в белковом комплексе независимо от мяРНК U2.

Чтобы определить, взаимодействуют ли SAP 130, 145 и 155 друг с другом в дискретном белковом комплексе внутри очищенной частицы мяРНП U2, мы провели иммуноочистку 17S U2 snRNP из ядерных экстрактов с использованием иммобилизованного анти-B «антитела.Белки элюировали из антитела путем инкубации с РНКазой A (фиг. A). Основные белки в элюате соответствуют SF3a и предполагаемым белкам SF3b (см. Ниже; также данные не показаны). Когда элюат использовали для иммунопреципитации с антителами против SAP 155 (фиг. B, дорожки 2 и 6) или против SAP 145 (данные не показаны), SAP 145, 155 и 130 были обнаружены на Вестерн-блоттинге иммунопреципитатов. Эти три белка не были обнаружены при иммунопреципитации элюата антителами к SF3a (рис.B, дорожки 3 и 7) или антитело отрицательного контроля, анти-hPrp17 (фиг. B, дорожки 4 и 8). Таким образом, SAP 130, 145 и 155 присутствуют в специфическом белковом комплексе, который связан с U2 snRNP. Белковый комплекс не связывается с SF3a в отсутствие мяРНК U2.

SAP 130 и 155 взаимодействуют друг с другом в белковом комплексе. (A) Антитела к U2 snRNP протеину B «использовали для иммунопреципитации U2 snRNP из ядерного экстракта. Общие белки элюировали РНКазой A и фракционировали на SDS – 9% полиакриламидном геле.Обильные SAP указаны и были идентифицированы на двумерных гелях и на вестерн-блотах (панель B и данные не показаны). Звездочка обозначает полосу неизвестного происхождения. Однако маловероятно, что он является компонентом SF3b, поскольку он не коиммунопреципитирует с антителами SF3b (данные не показаны). (B) Элюат из панели A использовали для иммунопреципитации с антителами (α), указанными в верхней части каждой дорожки, и вестерн-блоттинг зондировали антителами, указанными слева от каждого блоттинга.(C) То же, что и панель A, за исключением того, что белки элюировали 1 М мочевиной. (D) Элюат мочевины использовали для иммунопреципитации с антителами SAP 155 и SAP 145. Связанные (IP) и несвязанные (FT) белки фракционировали на SDS – 6% полиакриламидном геле, и вестерн-блоты зондировали указанными антителами.

Для дальнейшего определения взаимодействий между белками SF3b внутри U2 snRNP, мы иммуноочистили U2 snRNP с использованием антитела B, а затем элюировали белки 1 М. мочевиной. Этот элюат содержал набор белков, обнаруженных в элюате РНКазы (сравните фиг.А и С). Когда элюат мочевины использовали для иммунопреципитации с анти-SAP 155, мы обнаружили, что SAP 155 и 130 коиммунопреципитируются (фиг. D, дорожка 1). Напротив, SAP 130 и 155 были обнаружены в проточном потоке, когда анти-SAP 145 использовали для иммунопреципитации (фиг. D, дорожки 3 и 4). В соответствии с этими данными, SAP 145 был обнаружен в потоке, когда антитела против SAP 155 использовались для иммунопреципитации (фиг. D, дорожки 5 и 6), тогда как SAP 145 был обнаружен в иммунопреципитате при использовании антител против SAP 145 (фиг.D, дорожки 7 и 8). Мы пришли к выводу, что SAP 130 и 155 более тесно взаимодействуют друг с другом, чем с SAP 145.

Вместе данные, представленные выше, показывают, что SAP 130, 145 и 155 связываются друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий. Эти белки присутствуют в виде белкового комплекса в очищенном snRNP U2, и SAP 130 и 155 более тесно взаимодействуют друг с другом, чем с SAP 145 в этом комплексе. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, является ли взаимодействие между SAP 130 и 155 прямым или косвенным (см. Обсуждение).

scSAP 130 и 155 необходимы для жизнеспособности дрожжей.

Ранее было показано, что гомологи S. cerevisiae SAP 145 / CUS1 (YMR240c) и SAP 49 / HSh59 (YOR319w) важны для дрожжей (15, 27). Эти и другие данные (см. Введение) указывают на то, что дрожжи также содержат комплекс SF3b (15, 27). Чтобы получить дополнительные доказательства того, что это так, мы спросили, содержат ли дрожжи гомолог SAP 130. Наибольшее сходство с геном SAP 130 человека в базе данных было у S.cerevisiae открытая рамка считывания, которую мы обозначили как scSAP 130. В ходе нашего исследования Чен и его коллеги (8) независимо идентифицировали scSAP 130 как белок RSE1 (YML049c) в скрининге чувствительных к температуре мутантов, дефектных в эндоплазматическом ретикулуме. транспорт до Гольджи. Характеристика термочувствительного гена RSE1 показала, что он является фактором сплайсинга (8). Взятые вместе, эти данные показывают, что scSAP 130 / RSE1 является ортологом SAP 130.

SAP 130 также напоминает большую субъединицу гетеродимера человека, называемого специфическим для повреждений ДНК-связывающим белком (DDB), который участвует в ДНК. ремонт (8, 16, 17).Человеческий SAP 130 на 27% идентичен и на 40% подобен scSAP 130 и на 20% идентичен и 29% подобен DDB127 (рис.). Размер трех белков сохранен, а сходство распределено по их длине. SAP 130 дрожжей больше связан с SAP 130 человека, чем с DDB (рис.). Таким образом, вероятно, что дрожжевой SAP 130 является функциональным гомологом человеческого SAP 130, а не DDB. В соответствии с этим выводом Чен с соавторами (8) показали, что мутанты RSE1 имеют нормальную репарацию ДНК после обработки УФ-светом.Используя антитела к DDB, мы обнаружили этот белок в ядерных экстрактах, но не в очищенных сплайсосомах или очищенном комплексе hnRNP H (данные не показаны). Таким образом, DDB, по-видимому, не является обычным сплайсосомным белком. Возможно, что сходство между этими белками связано с общей функцией, которую еще предстоит определить.

Согласование SAP 130 с scSAP 130 и DDB человека. Выравнивание проводили методом Clustal (DNASTAR Inc.). Остатки, которые идентичны в hsSAP 130 и двух других белках, показаны белым на черном.Общая идентичность scSAP 130 и hsDDB с hsSAP 130 составляет 27 и 20% соответственно.

Недавно мы идентифицировали вероятный гомолог SAP 155 (YMR288w) в дрожжах (26). Чтобы определить, являются ли scSAP 130 и 155 важными для жизнеспособности дрожжей, мы сконструировали диплоидные штаммы дрожжей, в которых одна копия генов была нарушена путем замены селектируемым маркером leu2 (22). Саузерн-анализ тотальной геномной ДНК дрожжей подтвердил замену одного аллеля геном Leu2 (рис.A и B [панели I и II]). Тетрадный анализ продемонстрировал разделение нежизнеспособных и жизнеспособных спор 2: 2 (рис. C [панели I и II]), и жизнеспособные споры не росли на чашках без лейцина (рис. D [панели I и II]). Вместе эти данные указывают на то, что гены scSAP 130 и SAP 155 необходимы для жизнеспособности дрожжей.

Гены scSAP 130 и scSAP 155 необходимы для S. cerevisiae . (Панель I) (A) Структура аллелей scSAP 130 и scSAP 130Δ :: LEU .Указаны размеры рестрикционных фрагментов Alw NI и Stu I. Зонд показан под областью, с которой он гибридизуется. (B) Саузерн-анализ общей геномной ДНК нормального диплоидного штамма (WT) и диплоидных штаммов, трансформированных аллелем scSAP 130Δ :: LEU (дорожки 1 и 2). Показаны размеры (в килобазах) маркеров и рестрикционных фрагментов. (C) Тетрадный анализ. Штамм scSAP 130Δ :: LEU спорулировали и рассекали 13 индивидуальных тетрад.(D) Жизнеспособные споры — Leu . Пятнадцать жизнеспособных спор накладывали на чашку без лейцина. Диплоидный штамм был залатан в качестве контроля. (Панель II) (A) Структура аллелей SAP 155 и scSAP 155Δ :: LEU . Указаны размеры рестрикционных фрагментов Stu I и Xho I, используемых для идентификации каждого аллеля. (B) Саузерн-анализ общей геномной ДНК нормального диплоидного штамма дрожжей (wt) и диплоидных штаммов, трансформированных аллелем scSAP 155Δ :: LEU (дорожки с 1 по 5).Показаны размеры (в килобазах) маркеров и рестрикционных фрагментов. Различия в интенсивности полос между дорожками, скорее всего, связаны с разными уровнями ДНК, загруженными в гель. (C) Тетрадный анализ. Штамм scSAP 155Δ :: LEU спорулировали и рассекали 15 индивидуальных тетрад. (D) Жизнеспособные споры — Leu . Восемнадцать жизнеспособных спор помещали на чашку без лейцина. Диплоидный штамм был залатан в качестве контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы сообщаем об выделении кДНК, кодирующей человеческий сплайсосомный белок SAP 130, который завершает клонирование основных белков U2 snRNP у человека.Наши данные показывают, что SAP 130 вместе с SAP 145 и 155 существует в составе белкового комплекса в ядерных экстрактах. У нас нет антител к белку U2 snRNP SAP 49. Однако этот белок очень тесно взаимодействует с SAP 145 (7). Таким образом, простейшая интерпретация данных состоит в том, что SAP 49, 130, 145 и 155 присутствуют в одном и том же белковом комплексе. Хотя функциональные исследования необходимы, чтобы доказать, что этот белковый комплекс соответствует важному фактору сплайсинга SF3b, весьма вероятно, что это так.Это утверждение основано на нескольких наблюдениях. Функциональный snRNP 17S U2 состоит из snRNP 12S U2 вместе с SF3a и SF3b (5). Очищенный 17S U2 snRNP содержит SAP 61, 62 и 114, которые, как известно, являются компонентами SF3a (5, 6). 17S U2 snRNP также содержит SAP 49, 130, 145 и 155 в равной стехиометрии (1). Наши данные показывают, что эти белки присутствуют в составе белкового комплекса в очищенном U2 snRNP. Таким образом, весьма вероятно, что этот белковый комплекс соответствует комплексу SF3b, ассоциированному с U2 snRNP.

Предыдущая работа показала, что очищенный 17S U2 snRNP содержит два дополнительных белка (35 и 92 кДа) (1), но эти белки присутствуют на более низких уровнях, чем другие белки SF3a и SF3b. Действительно, белки с молекулярной массой 35 и 92 кДа не обнаруживаются в очищенном иммуноочисткой U2 snRNP (рис. A и C). Таким образом, еще предстоит определить, являются ли они важными компонентами U2 snRNP или SF3b.

Предыдущие исследования показали, что SAP 145 и 49 взаимодействуют друг с другом посредством прямых белок-белковых взаимодействий (7).Наши данные показывают, что SAP 130 и 155 взаимодействуют друг с другом (прямо или косвенно). Однако неизвестно, как эти два белковых комплекса (SAP 145-SAP 49 и SAP 155-SAP 130) связываются. Одна из возможностей состоит в том, что эти комплексы напрямую взаимодействуют с образованием SF3b. Однако мы не можем исключить альтернативную возможность того, что еще не обнаруженный белок опосредует взаимодействие, или что упомянутый выше белок 35 или 92 кДа задействован. Мы отмечаем, что мы не смогли обнаружить прямые взаимодействия между SAP 155 и 130 или между SAP 155-SAP 130 и любым из других белков U2 snRNP с помощью анализа Дальнего Запада.Таким образом, необходима дальнейшая работа, чтобы определить, как белки SF3b взаимодействуют друг с другом.

Наше исследование также предоставляет новые доказательства того, что аналог SF3b человека присутствует в S. cerevisiae . Предыдущая работа идентифицировала scSAPs 145 и 49 и показала, что они взаимодействуют напрямую и важны для дрожжей (12, 15, 27). Мы показали здесь, что scSAP 130 и 155 также важны для дрожжей, а недавняя работа показала, что scSAP 130 является фактором сплайсинга (8). Исследования на дрожжах показали, что scSAP 145 подавляет летальные мутации в U2 мяРНК вблизи области, которая спаривает основания с сайтом ветвления (30).Аналогично, у млекопитающих все субъединицы SF3a и -b взаимодействуют с 5′-концом U2 мяРНК рядом с областью, которая спаривается с последовательностью точки ветвления (1). Все субъединицы SF3a и -b млекопитающих, за исключением SAP 130, также подвергаются УФ-перекрестному связыванию с пре-мРНК вокруг этого сайта разветвления до обеих каталитических стадий I и II. Одна из функций этих взаимодействий, по-видимому, заключается в том, чтобы прочно закрепить U2 snRNP на пре-мРНК (12). Белки SF3b также являются частью мяРНП U12, который является эквивалентом мяРНП U2 в сплайсосоме человека с незначительным содержанием (28).Эта сплайсосома предназначена для сплайсинга редкого класса интронов (25). Таким образом, высокая степень консервативности SF3b, вместе с его расположением рядом с каталитическим центром сплайсосомы, указывает на то, что этот комплекс, вероятно, будет играть ключевую роль в установлении и / или функционировании каталитического центра сплайсосомы на обоих этапах реакция сращивания. Доступность рекомбинантных субъединиц SF3b как у дрожжей, так и у млекопитающих теперь должна позволить напрямую проверить эти возможности.

ССЫЛКИ

1. Behrens S E, Tyc K, Kastner B, Reichelt J, Luhrmann R. Малый ядерный рибонуклеопротеин (RNP) U2 содержит множество дополнительных белков и имеет двудольную структуру RNP в условиях сплайсинга. Mol Cell Biol. 1993. 13: 307–319. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 2. Беннетт М., Мишо С., Кингстон Дж., Рид Р. Белковые компоненты, специфически связанные с пресплицеосомными и сплайсосомными комплексами. Genes Dev. 1992; 6: 1986–2000. [PubMed] [Google Scholar] 3. Беннетт М., Рид Р.Соответствие между компонентом сплайсосомы млекопитающих и важным фактором сплайсинга дрожжей. Наука. 1993. 262: 105–108. [PubMed] [Google Scholar] 4. Бохниг П., Ройтер Р., Брингманн П., Лурманн Р. Моноклональное антитело против 2,2,7-триметилгуанозина, которое взаимодействует с интактными малыми ядерными рибонуклеопротеидами класса U, а также с 7-метилгуанозин-кэпированными РНК. Eur J Biochem. 1987. 168: 461–467. [PubMed] [Google Scholar] 5. Brosi R, Groning K, Behrens S.E, Luhrmann R, Kramer A. Взаимодействие фактора сплайсинга SF3a млекопитающих с U2 snRNP и связь его субъединицы 60 кДа с дрожжевым PRP9.Наука. 1993. 262: 102–105. [PubMed] [Google Scholar] 6. Brosi R, Hauri H.P, Kramer A. Разделение фактора сплайсинга SF3 на два компонента и очистка активности SF3a. J Biol Chem. 1993; 268: 17640–17646. [PubMed] [Google Scholar] 7. Champion-Arnaud P, Reed R. Пресплицеосомные компоненты SAP 49 и SAP 145 взаимодействуют в комплексе, участвующем в привязке U2 snRNP к сайту ветвления. Genes Dev. 1994; 8: 1974–1983. [PubMed] [Google Scholar] 8. Чен Е. Дж., Франд А. Р., Хитурас Е., Кайзер С. А. Связь между секрецией и дефектами процессинга пре-мРНК в Saccharomyces cerevisiae и идентификация нового гена сплайсинга, RSE1.Mol Cell Biol. 1998. 18: 7139–7146. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Кьяра М. Д., Рид Р. Двухступенчатый механизм для образования пар 5 ‘и 3’ сайтов сплайсинга. Природа. 1995; 375: 510–513. [PubMed] [Google Scholar]

9a. Дас Р. и Р. Рид. Неопубликованные данные.

10. Фромонт-Расин М., Рейн Дж. С., Легрен П. К функциональному анализу генома дрожжей с помощью исчерпывающих двухгибридных скринингов. Нат Жене. 1997. 16: 277–282. [PubMed] [Google Scholar] 11. Гозани О., Поташкин Дж., Рид Р. Потенциальная роль взаимодействий U2AF-SAP 155 в привлечении U2 snRNP к сайту ответвления.Mol Cell Biol. 1998. 18: 4752–4760. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Gozani O, Feld R, Reed R. Доказательства того, что независимое от последовательности связывание высококонсервативных белков snRNP U2 перед сайтом ветвления необходимо для сборки сплайсосомного комплекса A. Genes Dev. 1996; 10: 233–243. [PubMed] [Google Scholar] 13. Хабетс В. Дж., Хоет М. Х., Де Йонг Б. А., Ван дер Кемп А., Ван Венроой В. Дж. Картирование эпитопов В-клеток на малых ядерных рибонуклеопротеинах, которые реагируют с человеческими аутоантителами, а также с экспериментально индуцированными мышиными моноклональными антителами.J Immunol. 1989; 143: 2560–2566. [PubMed] [Google Scholar] 14. Ходжес П. Э., Беггс Дж. Сплайсинг РНК. U2 выполняет обязательство. Curr Biol. 1994; 4: 264–267. [PubMed] [Google Scholar] 15. Igel H, Wells S, Perriman R, Ares M., Jr. Сохранение структуры и взаимодействий субъединиц в дрожжевых гомологах субъединиц фактора сплайсинга 3b (SF3b). РНК. 1998; 4: 1–10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Казанцев А., Мю Д., Николс А. Ф., Чжао X, Линн С., Санкар А. Функциональная комплементация группы E комплементации xeroderma pigmentosum путем репликации белка A в системе in vitro.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 5014–5018. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Кини С., Чанг Дж. Дж., Линн С. Характеристика белка, связывающего повреждение ДНК человека, участвующего в пигментной ксеродерме E. J Biol Chem. 1993; 268: 21293–21300. [PubMed] [Google Scholar] 18. Козак М. Точечные мутации определяют последовательность, фланкирующую кодон инициатора AUG, который модулирует трансляцию эукариотическими рибосомами. Клетка. 1986; 44: 283–292. [PubMed] [Google Scholar] 19. Крамер А. Структура и функция белков, участвующих в сплайсинге пре-мРНК млекопитающих.Анну Рев Биохим. 1996; 65: 367-409. [PubMed] [Google Scholar] 20. Рид Р. Первоначальное распознавание сайтов сплайсинга и спаривание во время сплайсинга пре-мРНК. Curr Opin Genet Dev. 1996; 6: 215–220. [PubMed] [Google Scholar] 22. Ротштейн Р. Таргетинг, разрушение, замена и спасение аллелей: интегративная трансформация ДНК в дрожжах. Методы Энзимол. 1991; 194: 281–230. [PubMed] [Google Scholar] 23. Seghezzi W, Chua K, Shanahan F, Gozani O, Reed R, Lees E. Cyclin E ассоциируется с компонентами аппарата сплайсинга пре-мРНК в клетках млекопитающих.Mol Cell Biol. 1998. 18: 4526–4536. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Стейли Дж. П., Гатри С. Механические устройства сплайсосомы: двигатели, часы, пружины и тому подобное. Клетка. 1998. 92: 315–326. [PubMed] [Google Scholar] 25. Tarn W. Y, Steitz J A. Сплайсинг пре-мРНК: открытие новой сплайсосомы удваивает задачу. Trends Biochem Sci. 1997. 22: 132–137. [PubMed] [Google Scholar] 26. Ван С., Чуа К., Сегеззи В., Лис Е., Гозани О., Рид Р. Фосфорилирование сплайсосомного белка SAP 155 в сочетании с катализом сплайсинга.Genes Dev. 1998; 12: 1409–1414. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 27. Wells S E, Neville M, Haynes M, Wang J, Igel H, Ares M., Jr CUS1, супрессор мутаций чувствительной к холоду U2 snRNA, представляет собой новый дрожжевой фактор сплайсинга, гомологичный человеческому SAP 145. Genes Dev. 1996. 10: 220–232. [PubMed] [Google Scholar] 28. Will C, Schneider C, Reed R, Luhrmann R. Идентификация как общих, так и отдельных белков в основных и второстепенных сплайсосомах. Наука. 1999; 284: 2003–2005. [PubMed] [Google Scholar] 29.Will C L, Luhrmann R. Функции белка в сплайсинге пре-мРНК. Curr Opin Cell Biol. 1997. 9: 320–328. [PubMed] [Google Scholar] 30. Yan D, Ares M., Jr. Инвариантные последовательности РНК U2, граничащие с областью распознавания точки ветвления, важны для взаимодействия с дрожжевыми субъединицами SF3a и SF3b. Mol Cell Biol. 1996; 16: 818–828. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 31. Zhou Z, Reed R. Человеческие гомологи дрожжевых prp16 и prp17 обнаруживают сохранение механизма каталитического этапа II сплайсинга пре-мРНК.EMBO J. 1998; 17: 2095–2106. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

TotalSeq ™ -A0465 Anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody, Nuclear Pore Complex Proteins, MAb414

Что такое реагенты TotalSeq ™ и как они работают с установленными рабочими процессами (CITE-seq и REAP-seq)?

TotalSeq ™ — это бренд BioLegend конъюгатов антитело-олигонуклеотид, позволяющий проводить одновременный анализ белков и мРНК в отдельных клетках.CITE-seq и REAP-seq — это два похожих рабочих процесса для одновременного анализа белков и мРНК, и конъюгаты TotalSeq ™ легко интегрируются в эти установленные протоколы.

В чем разница между TotalSeq ™ -A, -B и -C?

Основное различие между 3 форматами связано с последовательностями олиго-тегов и их совместимостью с платформами одноклеточного секвенирования.

  • Реагенты TotalSeq ™ -A используют метод захвата поли-А, который не зависит от прибора и включает набор для экспрессии 10x Genomics 3 ’Single Cell Gene.
  • TotalSeq ™ -B использует технологию штрих-кода для набора экспрессии 10x Genomics 3 ’Single Cell Gene.
  • TotalSeq ™ -C также использует технологию штрих-кодов, но для экспрессионного набора 10x Genomics 5 ’V (D) J.


Каждый из них использует разные праймеры для амплификации библиотеки.Вы можете прочитать немного больше о различиях на нашей веб-странице TotalSeq ™.

Могу ли я использовать TotalSeq ™ -A и -B вместе?

В настоящее время мы не можем поддерживать смешивание реагентов TotalSeq ™ -A и TotalSeq ™ -B в одном эксперименте. Эти две линейки продуктов требуют разных протоколов для подготовки библиотек, и разные методы захвата могут вызвать расхождения в эффективности захвата.Кроме того, это часто может вызывать проблемы в части биоинформатики при анализе ваших данных из-за различий в последовательностях и длинах индексов. Теоретически они должны работать вместе, но на практике это может быть довольно сложно, и мы не советуем делать это, когда это возможно.

Могу ли я использовать TotalSeq ™ -A на платформе 10x Genomics 3 ’Single Cell Gene или мне нужен TotalSeq ™ -B?

Либо будет работать нормально.

Что такое «особенности»?

При обсуждении данных отдельной ячейки, характеристиками является любой аспект измеряемой ячейки. Общие черты — мРНК, белок, sgRNA и т. Д.

Поддерживается ли 10x Genomics TotalSeq ™ -A, B и C?
Продукты

TotalSeq ™ -A / B / C полностью поддерживаются BioLegend и прошли внутренние испытания BioLegend на платформе 10x Genomics.TotalSeq ™ -B и C полностью поддерживаются 10x Genomics. 10x Genomics предоставляет ограниченную поддержку TotalSeq ™ -A.

Если вы не уверены, к какой группе технической поддержки обращаться, если у вас есть вопросы или проблемы, не стесняйтесь обращаться к BioLegend, и мы будем работать с нашими партнерами, чтобы решить вашу проблему или ответить на ваши технические вопросы.

Что такое «хэштеги»?
Реагенты

Hashtag предназначены для использования для штрих-кодирования образцов, что позволяет пользователям объединять несколько образцов в одну дорожку, а затем демультиплексировать во время анализа.Вместо выбора антиген-специфических антител хэштеги разработаны так, чтобы они были специфичными для клеток человека или мыши и охватывали как можно больше клеток. Для образцов человека хэштеги состоят из двух антител, которые распознают повсеместно распространенные поверхностные маркеры, CD298 и β2-микроглобулин, каждый из которых конъюгирован с одним и тем же олигонуклеотидом, содержащим последовательность штрих-кода. Для образцов мышей поверхностными маркерами являются CD45 и H-2 MHC класса I. Конъюгаты уже предварительно смешаны и готовы к использованию.

В чем преимущество хеширования ячеек?

Hashing позволяет клиентам запускать несколько образцов на одной дорожке прибора 10x Genomics Chromium или его эквивалента, что оптимизирует количество клеток или образцов, которые можно анализировать одновременно.Это может уменьшить вариабельность из-за эффектов партии или обработки образцов. Это также может помочь более эффективно идентифицировать дублеты. Кроме того, он также может повысить выход и помочь с вводом ячеек при низком количестве ячеек, тем самым оптимизируя использование платформы и вашего рабочего процесса или протокола.

Что такое «сверхнагрузка»?

Как правило, при использовании платформы с одной ячейкой, когда вы увеличиваете количество входных ячеек, скорость дублетов (две ячейки, захваченные как одна точка данных) увеличивается.Это приводит к неприемлемому проценту точек данных, содержащих более одной ячейки. Хештеги позволяют «перегружать» количество ячеек. Для этого несколько аликвот одного и того же образца можно окрасить таким количеством хэштегов, сколько аликвот вы хотите смешать. Количество аликвот и количество клеток на аликвоту может варьироваться, но после промывки и смешивания клеток, в соответствии с протоколом окрашивания и анализа, если в «событии» с одной ячейкой обнаружено более одного хэштега, это событие можно безопасно отбросить. как дублет.Это не исключает дублетов, содержащих один и тот же хэштег, но скорость обнаружения дублетов значительно увеличивается. Тем не менее, «сверхнагрузка» должна тщательно контролироваться, поскольку чем больше ячеек вы загружаете, тем больше происходит дублетов, что в целом приводит к снижению отдачи. Должен быть баланс между оптимизацией нескольких выборок, выходом данных по одной ячейке и оптимальной производительностью прибора / платформы.

Что такое ядерные хэштеги?

Ядерные хэштеги используются для образцов одноядерной последовательности РНК (snRNA-seq).snRNA-seq захватывает РНК, которые изолированы с ядром. Это делается потому, что целые неповрежденные клетки может быть трудно изолировать из-за конкретных условий эксперимента или образца, а также из-за ответа на конкретный научный вопрос. См. Пример применения ядерного хэштега в этом документе: https://www.nature.com/articles/s41467-019-10756-2

Могу ли я использовать ядерные хэштеги для одиночной ячейки ATAC-seq?

К сожалению, в настоящее время наши реагенты TotalSeq ™ не совместимы напрямую с отдельными наборами ATAC-seq.Тем не менее, NYGC впервые разработал метод связывания ATAC с профилем выбора антигена путем секвенирования (ASAP-seq), который может связывать антитела TotalSeq ™ с другими платформами захвата, такими как scATAC-seq. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.08.286914v1

Наши продукты с ядерными хэштегами доступны в готовом виде, но в настоящее время у нас нет рекомендованного протокола для этого приложения.
Единственные рекомендации, которые мы можем предоставить, — это ссылки на литературу, например, эту:
https: // www.nature.com/articles/s41467-019-10756-2

Могу ли я получить техническую поддержку при использовании хэштегов?

Hashtags могут абсолютно использоваться на любой платформе с одной ячейкой, включая платформу 10x Genomics. BioLegend полностью поддерживает использование хэштегов. Пожалуйста, свяжитесь с нашей группой технического обслуживания для получения дополнительной информации.

Помешает ли совместное окрашивание FACS и TotalSeq ™ рабочему процессу?

Мы не тестировали это, но нет оснований полагать, что неконкурирующие клоны для одной и той же цели будут проблематичными.Точно так же клетка / методика должна допускать субнасыщающую концентрацию обоих реагентов по отношению к одной и той же мишени. Исходная статья CITE-seq Stoeckius et al. (Рис. 2) продемонстрировала, что клетки можно совместно окрашивать для последующих анализов. Хотя авторы не использовали текущие реагенты TotalSeq ™, технология осталась прежней. Кроме того, другие пользователи CITE-seq также продемонстрировали этот подход. Пожалуйста, свяжитесь с нашей группой технического обслуживания для получения дополнительной информации.

Почему важно удалять мертвые клетки перед исследованием образцов для CITE-seq?

Мы рекомендуем> 95% жизнеспособности перед началом эксперимента CITE-seq.Запуск мертвых ячеек во время CITE-seq по существу приводит к «потере» работы отдельных ячеек на мертвых, что в конечном итоге может привести к неоптимальным данным, или к необработке достаточного количества ячеек для сбора положительных событий, особенно если частота вашей целевой ячейки очень низкий. Мертвые клетки также можно удалить с помощью магнитных шариков. Если требуется выполнение CITE-seq перед удалением мертвых клеток, можно использовать методы биоинформатики, чтобы попытаться очистить события низкого качества (которые могут включать мертвые клетки).Это может быть более сложный подход, но в таких случаях мы рекомендуем следующую литературу:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4758103/
https: //www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/28045081

Обязательно ли сортировать образцы перед CITE-seq? Что мне следует учитывать при принятии решения о предварительной сортировке или нет?

Если интересующие популяции можно сгруппировать / идентифицировать без сортировки, вероятность того, что вам потребуется предварительная сортировка, минимальна.Однако, если количество ячеек в кластере очень мало, этого может быть недостаточно, чтобы делать выводы по сравнению с контролем или другими популяциями клеток. В этом случае обогащение этой популяции перед анализом CITE-seq может помочь в получении более значимых данных секвенирования, которые являются селективными для интересующей вас редкой популяции клеток. Мы также рекомендуем отсортировать мертвые клетки, если жизнеспособность образца ниже 95%.

Как я могу титровать антитела TotalSeq ™?

Мы разработали предварительно титрованные лиофилизированные панели TotalSeq ™ для облегчения использования комбинированных антител.У нас есть панели всех трех форматов (TotalSeq ™ -A, B и C), предназначенные для идентификации основных иммунных клеток, а также универсальная панель, которая содержит антитела против 130 белковых мишеней и 7 контрольных изотипов. Мы продолжим выпускать эти предварительно оптимизированные панели, поскольку понимаем, что титрование десятков антител для этого приложения — непростая задача. Возможно, мы не сможем предоставить конкретные значения титрования для отдельных антител, поскольку это может зависеть от множества факторов. Тем не менее, вот несколько рекомендаций на тот случай, если вы не сможете использовать наши панели и вам нужно будет выполнить титрование самостоятельно:

  1. Выполнение титрования с использованием фактического метода CITE-seq является дорогостоящим, но использование хэштегов может сделать процесс более доступным.См. Рис. 3 и связанные методы этой публикации для получения дополнительной информации.
  2. Проведите эксперименты по проточной цитометрии, чтобы найти оптимальную концентрацию антител, используя тот же клон, конъюгированный с PE. Количество антител проточной цитометрии должно хорошо транслироваться в CITE-seq.
  3. Пометьте клетки различными концентрациями антитела TotalSeq ™, а затем используйте поли (dT) олиго, конъюгированный с флуорофором, например Alexa Fluor® 647, в качестве вторичного реагента для обнаружения антитела TotalSeq ™.Это более прямой метод, но он требует использования реальных антител TotalSeq ™.
Какие инструменты доступны для анализа данных?

Некоторые доступные ресурсы включают CITE-Seq-Count и инструменты, разработанные лабораторией Rahul Satija. Пожалуйста, свяжитесь с нашей группой технического обслуживания для получения дополнительной информации.

Мне нужно заказать грунтовки; где их заказывать и какая чистота нужна?

Есть несколько компаний, предлагающих синтез праймеров.Мы можем порекомендовать технологии IDT. Для аддитивных грунтовок достаточно обессоливания. Для индексных праймеров требуется ВЭЖХ или ПААГ.

Почему я должен создавать библиотеки ADT / HTO отдельно от мРНК?

Отдельные библиотеки ADT / HTO и мРНК обеспечивают гибкость при секвенировании. Библиотеки можно смешивать в различных соотношениях перед секвенированием в зависимости от количества необходимых чтений.Обычно библиотеки ADT / HTO требуют меньшей глубины секвенирования по сравнению с их аналогами мРНК.

Как олиго-метка связывается с антителом, чтобы не мешать связыванию антитела с белком-мишенью?

Олиго прикрепляется к антителу тем же способом, что и некоторые из наших антител, конъюгированных с флуорофором, качество которых проверено с помощью проточной цитометрии.После того, как антитела были конъюгированы с олигонуклеотидом, мы проверяем с помощью проточной цитометрии, что антитело все еще может связываться со своей мишенью. Это часть нашего процесса контроля качества конъюгатов TotalSeq ™.

Можно ли запускать CyTOF® и TotalSeq ™ (CITE-seq) одновременно?

Не в том же эксперименте; это невозможно, потому что CyTOF® требует своего собственного инструмента и протокола, и он разрушает образец в процессе.Для этого необходимо разделить образец и запустить тесты CyTOF® и CITE-seq. Обратите внимание, что CITE-seq генерирует эквивалентные данные для поверхностных белков, как CyTOF®, с более высокими возможностями мультиплексирования панелей и на уровне одной клетки.

Можно ли распространить CITE-seq на микро-РНК?

Это технически сложное приложение, поскольку микро-РНК очень малы, и во многих случаях они будут такими же или даже меньше, чем праймеры, необходимые для выполнения протокола.На данный момент это невозможно.

Могу ли я использовать TotalSeq ™ в массовых экспериментах с последовательностью РНК?

Да, протокол для выполнения объемного секвенирования эпитопа и нуклеиновых кислот (BEN-seq) был разработан в сотрудничестве между Illumina и BioLegend. Вы можете узнать больше об этом в нашей заметке по применению.

Является ли аутофлуоресценция проблемой, как в проточной цитометрии?

Нет, аутофлуоресценция клеток не влияет на секвенирование при окончательном считывании.

Какое базовое количество копий для определения экспрессии белка (с помощью мечения TotalSeq ™)?

В основном это связано с аффинностью антител, титрованием и уровнем экспрессии антигена. BioLegend и некоторые сотрудники работают над данными титрования. Также уже есть некоторые данные. Теоретически, пока антитело может связывать одну молекулу, амплификация и секвенирование с помощью ПЦР должны выявить ее, но всегда присутствует фоновый шум.Обычный способ контролировать это — добавить в эксперимент отрицательные клетки. Например, при работе с PBMC человека используйте клетки мыши и наоборот.

Сколько ячеек вам нужно на эксперимент?

Это зависит от биологического вопроса, на который необходимо ответить. С технической точки зрения, при использовании 10x Genomics Chromium рекомендуется загружать от 5000 до 10000 ячеек на дорожку.Использование хэштегов может увеличить это число. Для простоты окрашивания мы обычно рекомендуем 1 миллион клеток, но это количество также зависит от доступности клеток и способности оператора работать с небольшим количеством клеток.

Сколько антител TotalSeq ™ можно мультиплексировать?

Мы оптимизировали несколько предварительно смешанных коктейлей антител, включая TotalSeq ™ -A, -B или -C TBNK человека, которые содержат 9 антител, и наш универсальный коктейль TotalSeq ™ -C для человека, v1.0, который содержит беспрецедентные 130 целевых антител плюс 7 изотипических контролей в одном флаконе. В ближайшем будущем мы выпустим больше панелей. Литература предполагает, что возможны панели большего размера, чем эти коктейли. Например, Yapeng et al. опубликовали исследование с использованием 197 антител TotalSeq ™ и 7 контрольных изотипов. BioLegend и научное сообщество продолжают раздвигать верхние пределы обнаружения мультиплексных белков с помощью секвенирования, и им еще предстоит их найти.

Можно ли сначала выполнить сортировку FACS, а затем выполнить CITE-Seq, одновременно выполняя мечение как антитело-олиго, так и антитело-флуорофор? Выдержит ли олигоконъюгат сортировку?

Олиго должен выдерживать сортировку.Однако, исходя из теоретических соображений, мы рекомендуем использовать неконкурирующие клоны, чтобы минимизировать влияние либо на FACS, либо на сигнал / считывание секвенирования. Даже при очень непродолжительном воздействии мы не оценивали влияние ультрафиолетовых или фиолетовых лазеров на конъюгаты олигонуклеотидов. Альтернативой потоковой сортировке может быть обогащение отрицательными магнитными шариками, например наша платформа MojoSort ™.

Какой должна быть моя глубина секвенирования для моей библиотеки ADT / HTO?

Мы рекомендуем глубину секвенирования 5000 чтений на ячейку.Если вы используете более 100 антител TotalSeq ™, вам следует увеличить до 10 000 считываний на ячейку. Только для HTO достаточно 500 чтений на ячейку.

Нужен ли мне контроль изотипа?

Изотипические контроли настоятельно рекомендуются, но не требуются. Полезность контроля изотипа в этих приложениях заключается в том, что они могут помочь идентифицировать «липкие клетки», вызванные клетками с нарушенной жизнеспособностью.Контроль изотипа также обеспечивает общую картину фонового уровня или неспецифического связывания различных типов клеток. Обычно при запуске изотипических контролей для тестов CITE-seq вы хотите включить 1 изотипический контроль для каждого изотипа, включенного в панель, независимо от количества антител. Мы рекомендуем использовать изотипический контроль в концентрации, соответствующей максимальной концентрации одного антитела, используемого в панели, для этого конкретного изотипа. Обычно контроли изотипа следует использовать в той же пробирке, что и сама панель.В отличие от традиционного эксперимента с проточной циометрией, для изотипических контролей для характеристики мультиомных клеток не требуются отдельные образцы для сравнения. Контроли изотипа включены в наши универсальные коктейли TotalSeq ™.

Другой полезный контроль, помогающий идентифицировать положительные сигналы, — это клетки, о которых известно, что они не связывают используемые антитела. Например, мышиные клетки при характеристике образцов человека, если антитела не вступают в перекрестную реакцию между мышиными и человеческими мишенями. Однако этого не требуется для уверенного определения положительных сигналов.

Должен ли я использовать сульфат декстрана для блокировки?

Несколько протоколов геномики, включая некоторые из 10x Genomics, могут рекомендовать включение сульфата декстрана в качестве блокатора для предотвращения нежелательных зарядовых взаимодействий между нуклеиновыми кислотами и другими положительно заряженными молекулами. Однако мы обнаружили, что в некоторых случаях включение сульфата декстрана может мешать связыванию и распознаванию антител, и мы не рекомендуем использовать его с какими-либо из наших реагентов TotalSeq ™.Неясно, каков точный механизм действия, вызывающего эту проблему. Все наши протоколы отражают это наблюдение; поэтому мы не рекомендуем использовать сульфат декстрана.

Визуализация сложных белков — CSIRO

Вызов

Повышение доступности сложных данных о белках

Белки — это строительные блоки жизни, но они представляют собой сложные структуры, состоящие из тысяч молекул.Исследователям нужен способ визуализировать точные способы соединения белков, чтобы они могли лучше понять функции, которые они играют в нашем организме.

Наш ответ

Aquaria: инструмент для визуализации белков

Мы создали новый веб-инструмент под названием Aquaria, который может создавать беспрецедентные трехмерные представления белковых структур. Инструмент 3D-визуализации CSIRO, Aquaria, помогает составить карту темного протеома, используя информацию из банка данных белков.

Aquaria использует данные из Protein Data Bank, онлайн-ресурса, который содержит более 100 000 структур белков, содержащих множество деталей о молекулярных процессах жизни. Инструмент позволяет добавлять дополнительные уровни информации (например, генетические различия) к базовой структуре белка и делает эти сложные данные доступными в быстром и простом в использовании интерфейсе, который визуализируется в полностью трехмерной среде.

В 2020 году платформа была обновлена ​​и теперь включает базу данных из почти 1000 моделей структуры белков вируса SARS-COVID-19, что позволяет ученым и исследователям визуализировать различные компоненты вируса и понимать, как они взаимодействуют с человеческими белками, чтобы получить доступ к ним. человеческая система и развитие инфекции.

Чтобы сделать этот большой и сложный набор данных доступным и удобным для исследователей, команда разработала индивидуальную стратегию компоновки для визуальной организации трехмерных моделей путем сопоставления их с вирусным геномом. Затем эти модели можно раскрасить, чтобы показать особенности последовательности, такие как однонуклеотидные полиморфизмы и посттрансляционные модификации.

Результаты

Оптимизированная наука о белке

В свободном и публичном доступе Аквария может помочь ученым, таким как экологи, диетологи, специалисты по биобезопасности и медицинские исследователи, упростить процесс открытий и получить новое представление о структурах белков.Трехмерная визуализация последовательностей белка-шипа COVID-19 на платформе Aquaria. Пользователь сосредотачивается на последовательности rep K3929 из структуры 6yyt-C K70, чтобы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе инфекции.

Обновление COVID-19 2020 обеспечивает немедленный и исчерпывающий визуальный обзор того, что известно — и неизвестно — о трехмерной структуре вирусного протеома COVID, тем самым помогая направлять будущие исследования.

Ресурс

Aquaria о COVID находится в свободном доступе в Интернете, а в приведенном ниже видео объясняется, как исследователи могут использовать этот ресурс.

Aquaria была разработана в сотрудничестве с Техническим университетом Мюнхена и размещена при поддержке гранта Amazon Web Services.

В видео доступны субтитры / скрытые титры.

В ответ на пандемию COVID-19, вызванную вирусом SARS-CoV-2, структурные биологи используют экспериментальные методы определения структуры, чтобы лучше понять протеом вируса.
  • Вид стенограмма
  • Копировать вставлять код

Поделитесь и вставьте это видео

Ссылка

Код для вставки

белковый комплекс, который формирует и защищает теломеры человека

Абстрактные

Добавленные теломеразой, массивы повторов TTAGGG определяют концы хромосом человека.Комплекс, образованный шестью теломер-специфичными белки связываются с этой последовательностью и защищают концы хромосом. По аналогии с другими хромосомными белковыми комплексами, такими как как конденсин и когезин, я буду называть этот комплекс шелтерином. Три субъединицы шелтерина, TRF1, TRF2 и POT1 напрямую распознавать повторы TTAGGG. Они связаны между собой тремя дополнительными белками шелтерина, TIN2, TPP1 и Rap1, образуя комплекс, позволяющий клеткам отличать теломеры от участков повреждения ДНК.Без защитной активности шелтерина, теломеры больше не скрыты от наблюдения за повреждениями ДНК, а концы хромосом неправильно обрабатываются путем восстановления ДНК пути. Как укрытие предотвращает эти события? Текущие данные утверждают, что укрытие не является статическим структурным компонентом. теломер. Вместо этого шелтерин превращается в белковый комплекс с активностью ремоделирования ДНК, который действует вместе с несколько связанных факторов репарации ДНК для изменения структуры теломерной ДНК, тем самым защищая концы хромосом.

Шесть субъединиц шелтерина: TRF1, TRF2, TIN2, Rap1, TPP1 и POT1

Компоненты шелтерина постепенно выявлялись в течение последних 10 лет (рис. 1). Первый теломерный белок млекопитающих, теперь называемый TRF1, был выделен на основании его специфичности in vitro в отношении двухцепочечных TTAGGG-повторы, типичные для теломер позвоночных (Zhong et al.1992; Чонг и др. 1995). TRF2 был идентифицирован как паралог TRF1 в базе данных (Bilaud et al. 1997; Broccoli et al. 1997), а TIN2 и Rap1 были обнаружены в двухгибридных скринингах с TRF1 и TRF2, соответственно (Kim et al. 1999; Li et al. 2000). TPP1 (ранее называвшийся TINT1 [Houghtaling et al. 2004], PTOP [Liu et al. 2004b] и PIP1 [Ye et al. 2004b]) недавно появился в результате поисков взаимодействующих с TIN2 белков. Был идентифицирован наиболее консервативный компонент шелтерина, POT1. основан на гомологии последовательностей с факторами связывания концов теломер у одноклеточных эукариот (Baumann and Cech 2001).Масс-спектрометрия факторов, связанных с шелтерином, не дала дополнительных компонентов, что позволяет предположить, что подсчет его субъединицы близятся к завершению (Liu et al. 2004b; O’Connor et al. 2004; Ye et al. 2004a).

Все шесть субъединиц shelterin могут быть обнаружены в едином комплексе во фракционированных ядерных экстрактах (Liu et al. 2004a; Ye et al. 2004a). Стержнем шелтерина является TIN2, который связывает TPP1 / POT1 с TRF1 и TRF2. TIN2 также соединяет TRF1 с TRF2 и эту ссылку способствует стабилизации TRF2 на теломерах (Liu et al.2004a; Ye et al. 2004а). Подкомплексы шелтерина, содержащие TRF1 или TRF2 в ассоциации с другими субъединицами, также могут быть выделены. Несмотря на то что эти субкомплексы могут быть артефактом изоляции солевой чувствительности связи TIN2-TRF2 (Ye et al. 2004a), эксперименты по фотообесцвечиванию также предполагают, что некоторые из TRF1 и TRF2 находятся в отдельных комплексах (Mattern et al. 2004). Необходима дальнейшая работа, чтобы установить количество единиц шелтерина, связанных на теломер, стехиометрию шелтерина. субъединиц и значение подкомплексов shelterin.

Не все белки на концах хромосом являются частью шелтерина. Несколько критериев отличают компоненты укрытия от белки, не относящиеся к шелтерину, наблюдаемые на теломерах (таблица 1). Шелтерин в изобилии присутствует на концах хромосом, но не накапливается где-либо еще; он присутствует на теломерах по всей клетке цикл, и его известная функция ограничена теломерами. Белки, не относящиеся к шелтерину, на концах хромосом не могут встретиться с двумя или тремя этих критериев, но они могут играть важную роль на теломерах.

Таблица 1.

Примеры белков, не относящихся к шелтерину, на теломерах человека

Shelterin обладает исключительной специфичностью в отношении теломерных повторов TTAGGG из-за наличия множественных складок распознавания TTAGGG. в комплексе. Каждый из ДНК-связывающих доменов SANT / Myb TRF1 и TRF2 связывает последовательность 5′-YTAGGGTTR-3 ‘в дуплексной ДНК, демонстрируя очень низкую толерантность к изменениям на одной базе (рис.1; Bianchi et al. 1999; Court et al. 2005; Hanaoka et al. 2005). Каждый TRF1 и TRF2 образуют гомодимеры и олигомеры более высокого порядка, поэтому совокупность нескольких DBD, которые они приносят в комплекс может просматривать большую последовательность ДНК. POT1 также обладает высокой специфичностью к последовательности, связывая одноцепочечные сайты 5 ‘- (T) TAGGGT TAG-3′ как на 3’-конце, так и во внутренних положениях (Fig. 1; Lei et al. 2004; Loayza et al. 2004). Поскольку эти три субъединицы шелтерина связаны посредством белок-белковых взаимодействий, шелтерин обладает способностью к распознают теломерные ДНК по крайней мере с пятью ДНК-связывающими доменами (по два в TRF1 и TRF2 и один в POT1).Как следствие, shelterin обладает уникальной способностью отличать теломеры от всех других концов ДНК.

Рисунок 1.

Шелтерин. ( A ) Шесть известных субъединиц шелтерина, их доменная структура, белковые взаимодействия и сайты связывания ДНК. POT1 может связывать его место как на 3′-конце, так и во внутреннем положении (как показано).Не показано, сообщается о взаимодействии между POT1 и TRF2. Харриса и его коллег (Янг и др., 2005). ( B ) Схема шелтерина на теломерной ДНК. Для простоты POT1 показан только как связывающий сайт, ближайший к теломерному дуплексу. ДНК, хотя она также может связываться с 3′-концом. ( C ) Возможные комплексы и субкомплексы шелтерина на теломерах. (I) Шести субъединичный шелтерин с POT1, не связанным с оцДНК. (II) Как и в I, с POT1, взаимодействующим с TRF2.(III) Комплекс TRF2 / Rap1 / TIN2 / TPP1 / POT1. (IV) Комплекс TRF1 / TIN2 / TPP1 / POT1. (V) Шестисубъединичный шелтерин с POT1, связанным с одноцепочечной теломерной ДНК. Гибкий линкер между DBD POT1 и остальная часть комплекса укрытия спекулятивна. Нуклеосомы на этой и всех других схемах не показаны. теломерный хроматин.

Комплексы, связанные с шелтерином, также обнаруживаются на теломерах у других эукариот.POT1-подобные белки присутствуют почти во всех eukaryotes (de Lange, 2001), TRF1 / 2-подобный белок обнаружен в делящихся дрожжах и в трипаносомах (Cooper et al. 1998; Sfeir et al. 2005), а Rap1 присутствует в грибах (Shore 1994; Chikashige and Hiraoka 2001; Канох и Исикава 2001). Напротив, субъединицы шелтерина TIN2 и TPP1 пока обнаружены только у позвоночных; их появление может иметь совпало с усилением второго TRF-подобного гена. Таким образом, шелтерин, по-видимому, образуется из дуплексного теломерного ДНК-связывания. белок, белок, связывающий одноцепочечную ДНК (оцДНК), и Rap1.Единственным исключением из этого правила может быть Saccharomyces cerevisiae , который лишен TRF-подобного белка и использует вместо этого сильно дивергированный ортолог Rap1, который связывает двухцепочечную теломерную ДНК. И наоборот, теломеры дрожжей содержат Rif1, консервативный белок, который не играет известной роли в теломерах млекопитающих и вместо этого функционирует. в контрольной точке внутри S-фазы (Hardy et al. 1992; Silverman et al. 2004; Xu and Blackburn 2004). По этим причинам экстраполяция почкующихся дрожжей на млекопитающих может быть обманчивой, если речь идет о теломерах.

Shelterin формирует теломеры

Главный ключ к разгадке того, как шелтерин защищает теломеры, связан с наблюдениями, что этот комплекс влияет на структуру теломерная ДНК. Задокументированы по крайней мере три отдельных эффекта шелтерина. Шелтерин определяет структуру конец теломеры, он участвует в образовании t-петель и контролирует синтез теломерной ДНК теломеразой. (Инжир.2).

Считается, что решающим способом, которым shelterin влияет на структуру теломерной ДНК, является формирование t-петель (Fig. 2; Griffith et al. 1999; Stansel et al. 2001). Теломеры имеют длинный одноцепочечный массив повторов TTAGGG на 3′-конце (Makarov et al. 1997). Было высказано предположение, что этот выступ вторгается в двухцепочечную теломерную ДНК, спаривая основание с С-цепью и смещая G-прядь. Инвазия нити происходит на расстоянии от физического конца теломер и, следовательно, приводит к большая дуплексная структура лариата, т-образная петля (рис.2). Ключевой особенностью Т-образных петель является то, что конец теломеры заправлен внутрь. Размер части круга, вероятно, не имеет значения. поскольку t-петли с очень большими (25 т.п.н.) и очень маленькими (1 т.п.н.) петлями наблюдались в клетках человека.

Т-петли были впервые идентифицированы с помощью электронной микроскопии очищенных рестрикционных теломерных фрагментов из клеток человека и мыши. (Гриффит и др., 1999). Чтобы наблюдать t-петли в безбелковой ДНК, необходимо ввести межцепочечные сшивки с псораленом и УФ.Без поперечных связей или белков, которые стабилизируют инвазию цепи, миграция ветвей может их диссоциировать. Лариаты имеют теперь также наблюдались в теломерном хроматине, который был изолирован без использования псоралена, и в этом анализе нуклеосомы было обнаружено, что они присутствуют на петле, а также на соседней хвостовой ДНК (Nikitina and Woodcock 2004).

In vitro компоненты шелтерина обладают активностями ремоделирования ДНК, которые имеют отношение к образованию t-петли.TRF2 может реконструировать искусственный теломерный субстрат в петли (Griffith et al. 1999; Stansel et al. 2001). Эти петли стабилизируются за счет сшивания псораленом, что указывает на событие инвазии цепи. Образование t-петли очищенным TRF2 вызывает недоумение, поскольку для реакции не требуется АТФ, а TRF2 лишен узнаваемого геликазного домена. Реакции нет эффективен, однако, и вполне вероятно, что in vivo TRF2 требует помощи других факторов для генерации t-петель.Как партнеры приюта с несколькими белками, участвующими в рекомбинационной репарации (Таблица 1), предполагается, что эти факторы могут вносить вклад в образование и поддержание t-петли (de Lange and Petrini 2000).

TRF1 также обладает активностью ремоделирования ДНК. In vitro, TRF1 может образовывать петли, изгибать и спаривать массивы теломерных повторов, действия, которые могут стимулируют сворачивание теломер in vivo (Bianchi et al. 1997, 1999; Griffith et al.1998) и TIN2 могут усилить некоторые архитектурные эффекты TRF1 (Kim et al. 2003). Гимнастика ДНК TRF1, вероятно, связана с его необычайно гибким способом связывания. Два домена SANT / Myb в TRF1 димер находится на конце гибких участков, что объясняет, как они могут задействовать свои полусайты 5′-YTAGGGTTR-3 ‘в разных ориентации и на переменном расстоянии. Теперь, когда другие компоненты в значительной степени известны, важно дополнительно определить как шелтерин ремоделирует теломерную ДНК in vitro и чтобы проверить вклад субъединиц шелтерина в формирование Т-петли и поддержание in vivo.

Т-петли являются консервативным аспектом структуры теломер, и предполагалось, что они защищают теломеры и регулируют теломеразу. Однако многое в них еще предстоит выяснить. Точная структура у основания t-петли неизвестна, и роль TRF1 и TRF2 в образовании t-петли (пока) не тестировался in vivo. Также неясно, являются ли t-петли единственными (или даже преобладающее) состояние защищенных концов хромосом.Хотя репликационная вилка должна разъединять вторжение цепи, неизвестно, приводит ли репликация ДНК к временному «открытому» состоянию. Ответить на эти вопросы непросто, потому что Обнаружение t-петель в настоящее время ограничено требованиями ЭМ анализа.

Шелтерин также влияет на структуру 3′-конца. Когда либо TRF2, либо POT1 ингибируются, общее количество одноцепочечных Количество повторов TTAGGG уменьшается на 30-50% (van Steensel et al.1998; Hockemeyer et al. 2005). В случае ингибирования TRF2 потеря одноцепочечной ДНК TTAGGG включает ERCC1 / XPF, эндонуклеазу лоскута, которая может расщепляются рядом с 3′-выступом внутри соседней дуплексной ДНК (Zhu et al. 2003). Участие ERCC1 / XPF предсказывает, что некоторые теломеры теряют всю свою оцДНК, когда TRF2 ингибируется. Адресовать В этом случае необходимо будет применять методы измерения изменений длины выступов, а не потерь. общего однонитевого повтора сигнала TTAGGG.Защита 3 ‘навеса с помощью укрытия могла быть косвенным эффектом. образования т-петель. Например, инвазии цепи 3′-выступа может быть достаточно для защиты оцДНК от расщепление ERCC1 / XPF и другими нуклеазами 3’-лоскута. Кроме того, связывание POT1 с оцДНК может блокировать нуклеолитическую деградацию. (Hockemeyer et al. 2005; Lei et al. 2005; Yang et al. 2005).

Как создается 3 ‘выступ? Для модификации конца теломеры, генерируемого ведущей цепью, может потребоваться нуклеазная активность. Синтез ДНК, как продукта ее репликации, может иметь тупой конец.Хотя вовлеченная нуклеаза еще не идентифицирована, Недавние данные показывают, что нуклеолитический процессинг 5′-цепи контролируется shelterin. В качестве примера Sfeir et al. al. (2005) смогли определить последовательность на 3′- и 5’-концах хромосом человека. Они обнаружили, что в то время как конец 3 ‘больше или менее случайно расположенный внутри повторов TTAGGG, 5’-конец является удивительно точным (рис. 2A). Почти все хромосомы человека имеют последовательность AATC CCAATC-5 ‘, что указывает на то, что нуклеолитический процессинг регулируется.Субъединица шелтерина POT1 участвует в этом контроле. Когда POT1 запрещен, 5’-концы теряют свою однородность и теперь заканчиваются. с AA, AT, TC, CC, CA или AT (Hockemeyer et al. 2005).

Простая модель того, как POT1 контролирует 5′-концевую последовательность, предложена его особенностями связывания с ДНК (Fig. 2). В естественной структуре теломер первый сайт POT1 в 3′-выступе находится всего в 2 нуклеотидах (нт) от конца дуплексная теломерная ДНК.Эта конфигурация является предпочтительным связывающим субстратом для POT1 in vitro (F. Ishikawa, личн. Комм .; D. Hockemeyer и T. de Lange, неопубликовано), предполагая, что POT1 взаимодействует с дуплексным концом теломеры. Итак, однажды эта терминальная структура была создана 5′-экзонуклеазой, POT1, связанной вблизи перехода двухцепочечная-одноцепочечная может просто перекрыть 5′-конец от дальнейшей обработки. Очевидно, прикрепление POT1 к соседней дуплексной теломерной ДНК через другие белки шелтерина может дополнительно усилить образование крышки POT1 на 5′-конце.

Рисунок 2.

Как шелтерин может формировать теломеры. ( A ) Образование конца теломер. После репликации концы хромосом требуют обработки для получения длинных 3 ‘ свес. Участвующая нуклеаза неизвестна. Результирующий 5 ‘конец всегда имеет последовательность ATC-5’. Когда POT1 запрещен, эта точность потеряна.Как POT1 определяет последовательность 5′-конца, неизвестно, но результирующая структура терминала является предпочтительным сайтом связывания для POT1 in vitro. ( B ) Т-образная петля. 3′-выступ вторгается в соседний дуплексный массив теломерных повторов, образуя D-петлю. Размер петли варьируется. ( C ) Спекулятивная модель образования t-петли шелтерином. TRF1 обладает способностью изгибать, образовывать петли и спаривать теломерные ДНК in vitro. и потенциально может свернуть теломер.Компонент шелтерина TRF2 может опосредовать образование t-петли in vitro. ( D ) Модель для регулирования длины теломер с помощью шелтерина. Поскольку t-петля вряд ли будет субстратом для теломеразы, теломеры показаны только в «открытом» состоянии (либо в линейной, либо в более компактной сложенной конфигурации), которые могут быть сгенерированы во время фазы S. Предполагается, что присутствие большего количества шелтерина на более длинных теломерах увеличивает нагрузку POT1 на теломеры. свес.Предполагается, что POT1, связанный с 3′-концом, блокирует действие теломеразы. Справа показаны короткие теломеры с меньшим укрытием. Из-за уменьшенного количества укрытия вероятность того, что POT1 загрузится на выступ уменьшается, что увеличивает вероятность того, что теломераза может удлинить теломер. Принудительное увеличение POT1 на теломеры (за счет сверхэкспрессии шелтерина) увеличивают вероятность того, что теломераза будет заблокирована, что приведет к укорочению теломер.Ингибирование шелтерина или мутанта POT1, который не связывает оцДНК, снижает вероятность того, что теломераза будет заблокирована, что приводит к удлинению теломер.

Третий способ, которым shelterin формирует теломеры, заключается в его влиянии на поддержание длины теломер (Fig. 2D). У дрожжей и млекопитающих теломеры поддерживаются в заданном диапазоне размеров с помощью петли отрицательной обратной связи, которая блокирует их действие. теломеразы на концах отдельных хромосом (см. обзор Smogorzewska and de Lange 2004).Когда данная теломера слишком длинная, этот механизм действия цис- ограничивает путь теломеразы. На слишком короткой теломере контроль ослабляется, так что теломераза может восстановить его длину. Шелтерин — ключевой компонент этого пути, представляющий цис--действующий ингибитор. В модели ингибирование теломеразы — это случайный процесс, на который влияет общее количество шелтерина. на теломере. Поскольку количество шелтерина, связанного с теломером, примерно пропорционально длине повтора TTAGGG. array, предполагается, что более длинные теломеры имеют большую вероятность ингибирования теломеразы.Этот контроль теломеразы требует оцДНК-связывающая активность компонента шелтерина POT1 (Loayza and de Lange 2003; Liu et al. 2004b). Мутантная форма POT1, которая не связывает оцДНК, приводит к полной потере контроля длины теломер. В этом случае теломераза образует очень длинные теломеры, которые утратили способность ингибировать фермент, хотя их укрытие постоянно увеличивается (Лоайза и де Ланге, 2003). Легко представить, как активность связывания оцДНК POT1 может блокировать доступ теломеразы к 3′-теломерам. terminus, и in vitro отмечена такая ингибирующая активность (Kelleher et al.2005; Lei et al. 2005). Основываясь на этих данных, текущая модель состоит в том, что количество шелтерина на теломере определяет вероятность того, что его Компонент POT1 может позиционировать себя на 3′-конце и блокировать теломеразу (Fig. 2D).

Ингибирование шелтерина активирует канонический ответ на повреждение ДНК

Долгое время предполагалось, что теломеры «спрятаны» от пути, предупреждающего клетки о повреждении ДНК.Доказательства того, что дисфункциональный человеческие теломеры действительно активируют путь ответа на повреждение ДНК, впервые выявленный в экспериментах, в которых субъединица шелтерина TRF2 ингибируется доминантно-отрицательным аллелем (TRF2 ΔBΔM ), который гетеродимеризуется с эндогенным TRF2, блокируя его связывание с ДНК (van Steensel et al. 1998; для обзора см. De Lange 2002). Потеря TRF2 активирует путь киназы ATM, приводя к усилению регуляции p53 и задержке G1 / S, опосредованной p21 (Karlseder et al.1999). Недавние эксперименты на мышиной модели нокаута TRF2 подтвердили, что потеря TRF2 приводит к активации ATM и p53-зависимой остановка клеточного цикла (Celli and de Lange 2005). Супрессор опухолей р53 также участвует в ответе на укорочение теломер. Например, мыши с дефицитом р53 лучше переносят последствия укорочения теломер у более поздних поколений мышей с дефицитом теломеразы (Chin et al. 1999).

Дисфункция теломер может привести либо к апоптозу, либо к старению.Результат, по-видимому, продиктован типом ячейки; фибробласты претерпевают старение после ингибирования TRF2 (и лечения агентами, повреждающими ДНК), тогда как апоптоз является более заметным исходом в лимфоцитах и ​​эпителиальных клетках (Karlseder et al. 1999). Активация пути ATM не требует вторичного повреждения ДНК, которое может возникнуть, когда клетки с дицентриком хромосомы проходят митоз. Скорее, повреждение самой теломеры активирует путь киназы ATM. (Инжир.3).

Мнение о том, что снятие защиты с теломер активирует ответ на повреждение ДНК, было подтверждено экспериментами, в которых повреждение ДНК факторы ответа наблюдались на теломерах (d’Adda di Fagagna et al. 2003; Takai et al. 2003). После ингибирования TRF2 или когда теломеры становятся критически короткими, 53BP1, γ-h3AX, комплекс Mre11, Rif1 и фосфорилированный форма ATM, ATM S1981-P, накапливаются на концах хромосом.К цитологическим структурам, образованным факторами повреждения ДНК, относятся как очаги, индуцированные дисфункцией теломер (TIFs) (Takai et al. 2003). TIF также образуются, когда ингибируются другие компоненты шелтерина (например, TIN2 или POT1) (Kim et al. 2004; Hockemeyer et al. 2005). ATM-дефицитные (A-T) клетки имеют пониженную способность образовывать TIF, и ответ дополнительно снижается при обработке кофеин, ингибитор ATM, ATR и других PI3-подобных киназ (PIKK) (Takai et al.2003). Основываясь на этих находках, кажется вероятным, что и ATM, и второй PIKK ответственны за реакцию на повреждение теломер. ATR был задействован как второй преобразователь в экспериментах на клетках с укороченными теломерами (Herbig et al. 2004). Одновременная репрессия ATM и ATR может обратить некоторые фенотипы теломер-направленного старения (d’Adda di Fagagna et al. 2003). В совокупности данные утверждают, что дисфункциональные теломеры обнаруживаются с помощью канонической реакции на повреждение ДНК.Пока что есть Нет необходимости задействовать «контрольную точку» теломер или конкретные пути передачи сигналов, чтобы объяснить, как клетки реагируют на потерю теломер. функция.

Многие аспекты реакции на повреждение теломер еще предстоит проработать. Например, неизвестно, какие датчики и медиаторы (например, комплекс Mre11, комплекс 9-1-1, комплекс Rad17, RPA, 53BP1, MDC1) действуют в повреждении теломер пути, относительный вклад ATM и ATR (и, возможно, других PIKK) не изучен, а природа теломер сигнал (ы) повреждения не установлен.

Рисунок 3.

Ответ на повреждение ДНК на дисфункциональных теломерах. Теломеры теряют защиту после ингибирования субъединиц шелтерина (например, TRF2, TIN2 или POT1) или истирание теломер. Молекулярная природа незащищенного состояния неизвестна. Теломеры могут стать незащищенными с явным изменением структуры ДНК или без такового (последняя изображена).При потере защиты теломеры становятся связанные с факторами ответа на повреждение ДНК, образующими TIF, показанные IF-изображением окрашивания 53BP1 на теломерах. Теломер Повреждение активирует киназу ATM, что приводит к p53-зависимой остановке G1 / S и может вызывать апоптоз или старение. Считается, что в отсутствие ATM киназа ATR вызывает остановку клеточного цикла. Дисфункция теломер также индуцирует p16 (Jacobs and de Lange 2004), который может способствовать ингибированию пролиферации в клетках человека с дефицитом p53.В клетках мыши индуцируется p16, но его индукция не влияет на переход в S-фазу (Smogorzewska and de Lange, 2002).

Как shelterin предотвращает сигнал о повреждении теломер?

Одна из рассматриваемых возможностей заключается в том, что реакция на повреждение ДНК активируется при потере 3′-выступа.В соглашении с этой моделью ингибирование shelterin действительно приводит к потере (части) 3′-выступающей ДНК из теломер млекопитающих. Однако недавние данные показывают, что эта обработка не требуется для ответа на повреждение ДНК. В ДНК-лигазе IV-дефицитной В клетках мыши ингибирование TRF2 активирует киназу ATM и превращает теломеры в очаги повреждения ДНК, даже если теломерные свес остается нетронутым (Celli, de Lange, 2005).

Если защиты от выступа недостаточно для предотвращения реакции на повреждение теломер, у шелтерина должен быть хотя бы один другой механизм. для предотвращения обнаружения теломер с помощью наблюдения за повреждениями ДНК. Интересная возможность состоит в том, что t-петли создают нуклеосомную организация, которая скрывает концы хромосом от наблюдения за повреждениями ДНК. Последние работы по ATM, 53BP1 и делящимся дрожжам Crb2 предположил, что ключевым событием в реакции на повреждение ДНК является изменение нуклеосомной организации в месте Повреждение ДНК (Баккенист и Кастан, 2003; Huyen et al.2004; Sanders et al. 2004 г.). В случае 53BP1 критическое взаимодействие происходит с диметилированной формой K79 гистона h4 (Huyen et al. 2004). Этот остаток конститутивно метилирован, но может быть недоступен в интактном хроматине. Предполагается, что когда ДНК происходит разрыв, нуклеосомная организация изменяется, обнажая сайт связывания для 53BP1. Имея в виду этот механизм, Легко увидеть, как t-петли могут скрыть важную поверхность нуклеосом от наблюдения за повреждениями ДНК.Когда теломер в В открытом состоянии последняя нуклеосома может иметь открытый сайт взаимодействия 53BP1. В t-петле эта предпоследняя нуклеосома могут быть расположены так, чтобы h4-K79 и другие сигнальные остатки были скрыты от других нуклеосом. Однако 53БП1 не единственный (или главный) фактор, который определяет повреждение ДНК. Сигнал для других датчиков, таких как комплекс Мрэ11 и 9-1-1 / RFC, не разработаны.Как только их механизмы восприятия станут известны, можно будет приступить к контр-тактике укрытия. И наоборот, лучшее понимание шелтерина может дать подсказку о том, как реакция на повреждение ДНК обнаруживает повреждение. на теломерах и в других местах.

Ингибитор ATM в шелтерине?

Неожиданно было обнаружено, что субъединица TRF2 шелтерина слабо взаимодействует с киназой ATM (Karlseder et al.2004), хотя ATM не обнаруживается на теломерах. TRF2 связывается с областью в ATM, которая содержит Ser 1981, остаток, который аутофосфорилируется в ответ на повреждение ДНК (Bakkenist and Kastan 2003). Аутофосфорилирование ATM рассматривается как ключевой шаг в активации ATM, что приводит к диссоциации киназы. димеры, которые считаются менее активными, чем мономеры. В исследованиях сверхэкспрессии TRF2 обладает способностью ингибировать S1981 фосфорилирование, и когда TRF2 в большом количестве в нуклеоплазме, он оказывает подавляющее действие на сигнальный путь ATM (Karlseder et al.2004 г.). Предложение о том, что шелтерин может содержать ингибитор АТМ, является привлекательным, потому что шелтерин в изобилии присутствует на теломерах, но не в большом количестве. в другом месте, чтобы он мог ограничивать ATM на концах хромосомы, не влияя при этом на реакцию на повреждение ДНК в другом месте геном.

Как избежать ненадлежащего ремонта

Как и в случае с основной массой ДНК, теломерная ДНК требует ремонта.Базовая эксцизионная репарация, эксцизионная репарация нуклеотидов и несоответствие Предполагается, что репарация используется для поддержания повторяющейся последовательности TTAGGG. Но некоторые формы ремонта могут иметь катастрофические последствия. (Рис.4, 5). Негомологичное соединение концов (NHEJ) двух теломер создает круговую или дицентрическую хромосому. Гомологичная рекомбинация (HR) между теломерами может генерировать аберрантную длину теломер и рекомбинацию теломер с интерстициальными теломерными теломерами. последовательность может привести к делециям, инверсиям и транслокациям.Кроме того, гомологичная рекомбинация угрожает целостности t-образной петли, потенциально прерывая петлю. Новая область исследования сосредоточена на установлении того, как shelterin предотвращает эти события.

Рисунок 4.

Предполагаемая роль шелтерина в защите теломер от NHEJ и потери нависания. Предполагается, что теломеры устойчивы к NHEJ из-за их конфигурации t-петли, которая блокирует доступ комплекса NHEJ к концу хромосомы.При потере Предполагается, что t-петли дестабилизируются (или не образуются), что позволяет задействовать путь NHEJ. До лигирование концов хромосом ДНК-лигазой IV, предполагается, что комплекс ДНК-ПК образует синаптическую структуру, которая активирует и / или набирает ERCC1 / XPF. Эта нуклеаза участвует в расщеплении 3′-выступа. Концевое соединение теломер приводит к образованию дицентриков. хромосомы (пример показан внизу ).После репликации ДНК могут происходить слияния сестринских и несестринских теломер. NHEJ также может возникать до репликации ДНК, приводя к слиянию хромосомного типа в метафазе (не показано).

Предотвращение NHEJ и обработки выступов

Концевые слияния хромосом являются заметным маркером дисфункции теломер.Они возникают, когда теломеры стали слишком короткими и когда TRF2 подавлен (см. обзор de Lange 2002). Эти слияния представляют собой ковалентные связи между C-цепью одного теломера и G-цепью др. (Smogorzewska et al. 2002). Они могут возникать до и после репликации ДНК и обычно затрагивают концы двух разных хромосом. Результирующий дицентрические хромосомы могут прикрепляться к обоим полюсам веретена и приводить к проблеме сегрегации хромосом в анафазе.Следовательно, в анафазных клетках с дицентрическими хромосомами наблюдаются характерные хроматиновые мостики.

Рисунок 5.

Контроль ЧСС t-петли шелтерином. Модель, показывающая, как поздние шаги в HR могут привести к внезапной потере теломерной ДНК. Миграция филиала в основании t-петли может генерировать один или два HJ. Разрешение двойного HJ в указанном направлении приведет к сокращению теломер и кольцевая теломерная ДНК.HR T-петли наблюдается, когда мутант TRF2 с укороченным N-концом, лишенный основных домен чрезмерно выражен. Круговой продукт HR t-петли также наблюдается в клетках ALT и на очень низких уровнях в невозмущенных клетках. нормальные клетки человека. В клетках ALT круги могут обеспечивать механизм поддержания теломер посредством репликации катящегося круга.

Для слияния поврежденных теломер необходимы те же факторы, что и для нормального NHEJ (рис.4; Smogorzewska et al. 2002; Челли и де Ланж 2005; Дж. Челли, Э. Денки и Т. де Ланге, неопубликовано). Клетки, лишенные ДНК-лигазы IV или Ku70, обладают сниженной способностью в 10-50 раз. для слияния теломер после ингибирования укрытия. Предполагается, что другие белки NHEJ, DNA-PKcs, XRCC4 и Ku80, участвуют в также, но не были протестированы. Реакция соединения концов теломер представляет собой необычный тип NHEJ, поскольку теломеры имеют длинный 3 ′ свес.Как упоминалось выше, фактор репарации эксцизией нуклеотидов ERCC1 / XPF, эндонуклеаза со специфичностью к 3 ‘выступы были вовлечены в удаление выступов (Zhu et al. 2003). Как и в случае с другими реакциями обрезки концов, эта стадия зависит от механизма NHEJ (Celli and de Lange 2005). Как механизм NHEJ активирует (или рекрутирует) ERCC1 / XPF, пока не известно.

Один из способов, с помощью которого шелтерин может защищать концы хромосом от NHEJ, заключается в стимулировании образования t-петли.Без доступного В конце концов, механизм NHEJ не сможет сформировать синаптический комплекс, который, как считается, необходим для обработки и лигирования. концов. Блокируя доступ, t-петли также защищают теломерный выступ от удаления нуклеазами, которые зависят от на оборудовании NHEJ (рис. 4).

Репрессия HR

Недавно стало ясно, что теломеры также нуждаются в защите от несоответствующей гомологичной рекомбинации.Там это три типа HR, которые имеют пагубные последствия на концах хромосом. Первый — гомологичная рекомбинация между сестринскими теломеры, называемые теломерным сестринским хроматидным обменом (T-SCE). T-SCE могут быть вредными для клеток, если обмен последовательности не равны по длине. Теломеры одной сестры могут удлиняться за счет другой. Обмен между сестринские теломеры могут быть обнаружены с помощью хромосомно-ориентированной флуоресцентной гибридизации in situ (CO-FISH) (для обзора см. Bailey et al.2004 г.). В методе CO-FISH вновь синтезированная ДНК разрушается, а оставшиеся родительские цепи обнаруживаются одноцепочечным методом. зонды. На теломерах одна родительская цепь состоит из 5′-TTAGGG-3 ‘повторов, а другая имеет только 5′-CCCTAA-3’ последовательности, позволяя различать две нити в метафазных хромосомах. После полуконсервативной репликации каждая хроматида в метафазной хромосоме будет иметь сигнал G-цепи на одном конце и сигнал C-цепи на другом.Отображение конца хроматиды сигналы как C-цепи, так и G-цепи указывают на то, что на этом конце произошло событие T-SCE. В нормальных клетках мыши и человека T-SCE встречается нечасто, но клетки ALT, которые поддерживают свои теломеры посредством пути рекомбинации, очень часто имеют T-SCE. (Bailey et al. 2004; Bechter et al. 2004; Londono-Vallejo et al. 2004). Разница может заключаться в том, что T-SCE в норме репрессированы и что клетки ALT ослабили свой контроль над HR на теломерах, позволяя им сохранять свои теломеры и, следовательно, выживать (см. обзор Neumann and Reddel 2002).

Вторая реакция HR, которая угрожает теломерам, называется HR t-петлей (Wang et al. 2004) (Fig. 5). Т-образные петли подвержены риску разрешения резольваз соединения Холлидея (HJ), потому что HJ может образоваться, если 5 ‘конец основание теломер соединяется с петлей смещения (D-петля). Миграция ветвей в направлении центромеры могла генерировать двойной HJ и разрешение этой структуры с кроссовером удалили бы весь сегмент петли, оставив резко укороченный теломер на конце хромосомы.HR T-loop был обнаружен посредством разделения функций мутанта TRF2, TRF2 ΔB , который защищает теломеры от NHEJ, но вызывает внезапные усечения теломер. Эти делеции зависят от двух белков. вовлечены в HR, рекомбинационный репарационный комплекс Mre11 и XRCC3, паралог Rad51, связанный с активностью по разрешению HJ. Клетки, экспрессирующие TRF2 ΔB , также содержат внехромосомную теломерную ДНК, которая является кольцевой. На двумерных гелях эти кружки показывают широкое распределение по размеру. в соответствии с их представлением петлевой части t-петель.Как N-конец TRF2 репрессирует t-петлю HR, не изучено. учредил. Поскольку невозмущенные клетки содержат небольшие количества кольцевой теломерной ДНК, подавление реакции t-петли HR на теломеры могут быть неполными. Контроль HR t-петли, по-видимому, еще больше ослаблен в клетках ALT, которые содержат большое количество теломерных круги (Чезаре и Гриффит, 2004; Ван и др., 2004). Поскольку T-SCE и t-петля HR являются сходными реакциями (одна происходит в цис , другая — в транс ), их преобладание в клетках ALT может быть связано с потерей репрессора, который контролирует оба.

Может быть третий тип HR с пагубными последствиями — рекомбинация между теломерами и интерстициальными теломерными теломерами. ДНК. Внутренняя теломерная ДНК хромосомы встречается нечасто в клетках человека, но у многих других позвоночных таких последовательностей много. по хромосомам. Рекомбинация между теломерами и этими элементами может вызывать терминальные делеции, внехромосомные фрагменты, инверсии и транслокации.Этот тип рекомбинации, по-видимому, имеет место в клетках мыши, лишенных ERCC1, которые генерируют большие внехромосомные элементы, которые содержат один участок теломерной ДНК, предположительно в хромосоме. внутренний сайт (Zhu et al. 2003). Эти элементы, называемые теломерными ДНК-содержащими двухминутными хромосомами (TDM), могут быть образованы путем рекомбинации. между теломерой и интерстициальной теломерной ДНК на одной хромосоме. Возможно, у shelterin есть ERCC1 / XPF на «поясе с инструментами» для предотвращения нежелательных событий рекомбинации.

Связь Шелтерина с факторами репарации ДНК

Shelterin имеет поразительное количество взаимодействующих партнеров, которые участвуют в процессинге ДНК (Таблица 1). С одной стороны, факторы на его «поясе с инструментами» могут облегчить укрытие. С другой стороны, эта обработка ДНК факторы потенциально вредны для теломер. Этот парадокс предполагает, что shelterin должен тщательно контролировать свои дочерние компании.

Особенно запутанным случаем связанных с теломерами факторов репарации ДНК являются ДНК-PKcs и гетеродимер Ku70 / 80 (Hsu et al. al. 1999, 2000; d’Adda di Fagagna et al. 2001; О’Коннор и др. 2004 г.). Эти белки способствуют развитию NHEJ и, как полагают, связаны с теломерами посредством взаимодействия с шелтерином (Таблица 1). Как ДНК-PKcs и Ku вносят вклад в функцию теломер, неизвестно; в любом случае их поведение необходимо будет строго контролировать так что избегается NHEJ концов хромосом.Похожая головоломка возникает из-за ассоциации шелтерина с ERCC1 / XPF. (Zhu et al. 2003), нуклеаза участвует в процессинге теломерного выступа после повреждения теломер. Как было предложено выше, shelterin может использовать эту нуклеазу для блокирования потенциально опасной рекомбинации между теломерами и интерстициальной теломерной ДНК.

Другим другом шелтерина в хорошую погоду является WRN, геликаза RecQ с 3′-экзонуклеазной активностью.WRN взаимодействует с TRF2 и могут быть обнаружены на теломерах с помощью ChIP и IF в S фазе (Opresko et al. 2002, 2004; Crabbe et al. 2004; Machwe et al. 2004). Общая функция WRN — разрешить миграцию ветвей HJ. In vitro WRN может разрешить структуру t-петли и разрушить 3 ‘выступ, атрибуты, которые представляют потенциальную угрозу целостности теломер (Opresko et al. 2002, 2004). Однако геликазы RecQ также обладают способностью удалять структуры G-квадруплексов из повторов TTAGGG (Sun et al.1998; Huber et al. 2002). Недавно было предложено, что эта активность необходима для репликации теломер на основании обнаружения S-фазозависимых потеря теломер в отсутствие WRN (Bai and Murnane 2003; Crabbe et al. 2004). Ингибирование WRN влияет только на синтез ДНК отстающей цепи на теломерах, которая копирует G-богатую теломерную цепь и является поэтому ожидается, что они ингибируются G-квадруплексами (Crabbe et al. 2004). Так что, возможно, шелтерин может использовать WRN для предотвращения проблем во время синтеза отстающей цепи, одновременно блокируя WRN от ненадлежащего разрешение t-петель после завершения репликации ДНК.

Ожидается, что список факторов, связанных с убежищем, будет расширяться. Задача будет заключаться в том, чтобы понять особенности теломер, специфичных для теломер. функции этих белков и то, как shelterin удается контролировать свою нежелательную активность.

Выводы

Обрисованная здесь концепция заключается в том, что шелтерин защищает концы хромосом, активно изменяя архитектуру теломерной ДНК.Шелтерин распознает теломерную ДНК и преобразует ее в Т-образную петлю, предположительно так, чтобы конец хромосомы был скрыт от оборудование NHEJ. Субъединица шелтерина POT1 взаимодействует с одноцепочечной теломерной ДНК, влияя на поддержание теломерной ДНК теломеразой и защищает 5′-конец хромосомы. И все же другие аспекты убежища, пока в значительной степени неизвестно, позволяют теломерам ускользать от обнаружения с помощью надзора за повреждениями ДНК.Шелтерин, похоже, использует «пояс с инструментами», на котором несколько белков репарации ДНК, таких как WRN, ERCC1 / XPF, комплекс Mre11 и ДНК-PK, которые, как предполагается, помогают шелтерину при выполнении дополнительных транзакций ДНК, обеспечивающих целостность конца хромосомы. В то же время укрытие должно контролируют действие этих факторов репарации ДНК, поскольку некоторые из них способны разрушать концы хромосом. Дальнейшая деконструкция Византийского мира теломер должны показать, как защищаются концы хромосом, и предоставит уникальную перспективу на ответ на повреждение ДНК.

Благодарности

Несколько важных исследований функции теломер человека не обсуждались в этом обзоре из-за нехватки места и тематики. соображения. Прошу прощения у коллег, работа которых не упоминается. Я очень благодарен Тому Чеху за полезные комментарии. Благодарим сотрудников моей лаборатории за критику моих идей и стиля письма.Мы благодарны за постоянную поддержку за нашу работу с теломерами за счет грантов от NIH и NCI (GM49046-12, CA76027-8, AG16642-7).

Сноски

  • Статья и публикации находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1346005.

  • №1 Переписка.E-MAIL delange {at} mail.rockefeller.edu; ФАКС (212) 327-7147.

  • Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

синаптонемных сложных белков: единственность или универсальность?

  • 1

    Page, S.L. и Хоули, Р.С., Генетика и молекулярная биология синаптонемного комплекса, Annu. Rev. Cell Dev. Биол. , 2004, т. 20. С. 525–558. https://doi.org/10.1146/annurev.cellbio.19.111301.155141

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 2

    Гао, Дж. И Колаяково, М.П. Застегивание и разархивирование: модификации белков, регулирующие динамику синаптонемных комплексов, Trends Genet. , 2018, т. 34. С. 232–245. https://doi.org/10.1016/j.tig.2017.12.001

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 3

    Циклер, Д.и Клекнер, Н., Мейотические хромосомы: интегрирующая структура и функция, Ann. Преподобный Жене. , 1999, т. 33. С. 603–754. https://doi.org/10.1146/annurev.genet.33.1.603

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 4

    Моисей М.Дж., Хромосомные структуры в сперматоцитах раков, J. Biophys. Biochem. Цитол. , 1956, т. 2. С. 215—219. https://doi.org/10.1083/jcb.2.2.215

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 5

    Кахун, К.К. и Хоули, Р.С., Регулирование строительства и разрушения синаптонемного комплекса, Nat. Struct. Мол. Биол. , 2016, т. 23. С. 369–377. https://doi.org/10.1038/nsmb.3208

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 6

    Шмекель, К. и Данехолт, Б., Центральная область синаптонемного комплекса, выявленная в трех измерениях, Trends Cell Biol. , 1995, т. 5. С. 239–242. https: // doi.org / 10.1016 / s0962-8924 (00) 89017-0

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 7

    Хоули, Р.С., Решение мейотической загадки LEGO: поперечные волокна и сборка синаптонемного комплекса в Caenorhabditis elegans, Генетика , 2011, т. 189, с. 405–409. https://doi.org/10.1534/genetics.111.134197

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8

    Коллинз, К.A., Unruh, J.R., Slaughter, B.D., et al., Corolla — это новый белок, который вносит вклад в архитектуру синаптонемного комплекса Drosophila, Генетика , 2014, т. 198. С. 219–228. https://doi.org/10.1534/genetics.114.165290

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 9

    Коста Ю., Спид Р., Оллингер Р. и др. Два новых белка, задействованных синаптонемным комплексным белком 1 (SYCP1), находятся в центре мейоза, J.Cell Sci. , 2005, т. 118. С. 2755—2762. https://doi.org/10.1242/jcs.02402

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 10

    Хамер, Г., Гелл, К., Кузнецова, А. и др., Характеристика нового мейоз-специфичного белка в центральном элементе синаптонемного комплекса, J. Cell Sci. , 2006, т. 119. С. 4025—4032. https://doi.org/10.1242/jcs.03182

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 11

    Шрамм, С., Fraune, J., Naumann, R., et al., Новый синаптонемный комплексный белок мыши необходим для загрузки белков центрального элемента, рекомбинации и фертильности, PLoS Genet. , 2011, т. 7. e1002088. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002088

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12

    Gmez, -H. L., Felipe-Medina, N., Sáchez-Marti, M., et al., C14ORF39 / SIX6OS1 является составной частью синаптонемного комплекса и необходим для фертильности мышей, Nat.Commun. , 2016, т. 7, номер статьи 13298. https://doi.org/10.1038/ncomms13298

    CAS Статья Google ученый

  • 13

    Humphryes, N., Leung, W.-K., Argunhan, B., et al., Комплекс Ecm11-Gmc2 способствует образованию синаптонемного комплекса посредством сборки поперечных нитей у почкующихся дрожжей, PLoS Genet. , 2013, т. 9. e1003194. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003194

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 14

    Фелькель-Мейман, К., Cheng, S.-Y., Morehouse, S.J., and MacQueen, A.J., Белки синаптонемного комплекса почкующихся дрожжей определяют реципрокные роли в MutSγ-опосредованном образовании кроссовера, Genetics , 2016, vol. 203, с. 1091–1103. https://doi.org/10.1534/genetics.115.182923

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 15

    Фрауне Дж., Шрамм С., Альшаймер М. и Бенавенте Р. Синаптонемный комплекс млекопитающих: белковые компоненты, сборка и роль в мейотической рекомбинации, Exp.Cell Res. , 2012, т. 318, с. 1340–1346. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2012.02.018

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 16

    Богданов Ю.Ф., Гришаева Т.М., Дадашев С.Ю. Сходство доменной структуры белков как основа сохранения мейоза // Int. Rev. Cytol. , 2007, т. 257. С. 83–142. https://doi.org/10.1016/S0074-7696(07)57003-8

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 17

    Гришаева Т.М., Богданов Ю.Ф. Сохранение и изменчивость белков синаптонемных комплексов в филогенезе эукариот // Int. J. Evol. Биол. , 2014, т. 2014 г., номер статьи 856230. https://doi.org/10.1155/2014/856230

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 18

    Фрауне Дж., Брошье-Армане К., Альшаймер М. и Бенавенте Р. Филогения белков центральных элементов раскрывает динамическую эволюционную историю синаптонемного комплекса млекопитающих: древние и современные компоненты, Генетика , 2013, т.195. С. 781–793. https://doi.org/10.1534/genetics.113.156679

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • 19

    Фрауне, Дж., Брошье-Армане, К., Альшаймер, М. и др., Эволюционная история синаптонемного комплекса млекопитающих, Хромосома , 2016, т. 125. С. 355–360. https://doi.org/10.1007/s00412-016-0583-8

    Статья PubMed Google ученый

  • 20

    Рамеш, М.А., Малик, С.-Б., и Логсдон, Дж. М., мл., Филогеномный перечень мейотических генов: доказательства пола у лямблий и раннее эукариотическое происхождение мейоза, Curr. Биол. , 2005, т. 15. С. 185—191. https://doi.org/10.1016/j.cub.2005.01.003

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • 21

    Богданов Ю.Ф. и Гришаева, Т.М., Консерватизм, изменение и эволюция мейоза, , М .: КМК, 2020, с.231–245, 260–277.

  • 22

    Вестергаард М. и фон Веттштайн Д., Синаптонемный комплекс, Ann. Преподобный Жене. , 1972, т. 6. С. 71—110. https://doi.org/10.1146/annurev.ge.06.120172.000443

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Периодическая таблица белковых комплексов

    Периодическая таблица белковых комплексов, опубликованная в журнале Science , предлагает новый способ взглянуть на огромное разнообразие структур, которые белки могут создавать в природе, какие из них могут быть открыты в ближайшее время, и предсказать, как можно создать совершенно новые структуры.Таблица, созданная междисциплинарной командой под руководством исследователей из кампуса Wellcome Genome и Кембриджского университета, представляет собой ценный инструмент для исследований в области эволюции и белковой инженерии.

    Периодическая таблица белковых комплексов, Ahnert et al., Science 2015

    Почти каждый биологический процесс зависит от взаимодействия белков и их сборки в комплексы определенным образом, и многие заболевания связаны с проблемами сложной сборки. Принципы, лежащие в основе этой организации, еще не полностью поняты, но, определяя фундаментальные этапы эволюции белковых комплексов, новая «периодическая таблица» представляет систематический, упорядоченный взгляд на сборку белков, предоставляя визуальный инструмент для понимания биологической функции.

    Мы наводим порядок в запутанном мире белковых комплексов.

    «Эволюция привела к появлению огромного разнообразия белковых комплексов, и это может показаться немного хаотичным», — объясняет Джо Марш, ранее работавший в Геномном кампусе Wellcome, а теперь из Отделения генетики человека MRC Эдинбургского университета. «Но если вы разберете шаги, которые предпринимают белки, чтобы стать комплексами, то можно найти несколько основных правил, которые могут объяснить почти все сборки, которые люди наблюдали до сих пор.”

    Бесконечные вариации на тему

    Различные бальные танцы можно рассматривать как бесконечную комбинацию небольшого количества основных шагов. Точно так же «танец» сборки белкового комплекса можно рассматривать как бесконечные вариации димеризации (один удваивается и становится двумя), циклизации (один образует кольцо из трех или более) и добавления субъединиц (два разных белка связываются друг с другом). . Поскольку это происходит довольно предсказуемым образом, не так сложно, как вы думаете, предсказать, как будет образовываться новый белок.

    «Мы наводим порядок в беспорядочном мире белковых комплексов», — объясняет Себастьян Анерт из Кавендишской лаборатории Кембриджского университета, физик, который регулярно сталкивается с биологическими проблемами. «Белки могут проходить несколько итераций этих простых шагов, добавляя все новые и новые уровни сложности и приводя к огромному разнообразию структур. Мы создали классификацию, основанную на этих основополагающих принципах, которая помогает людям разобраться в сложности.”

    Исключения из правила интересны сами по себе, добавляет Себастьян, поскольку являются предметом текущих исследований.

    «Проанализировав десятки тысяч белковых комплексов, трехмерные структуры которых уже были экспериментально определены, мы смогли увидеть повторяющиеся закономерности в происходящих переходах сборки — и с новыми данными масс-спектрометрии мы смогли увидеть более широкую картину. , — говорит Марш.

    «Основная работа этого исследования — теоретическая физика и вычислительная биология, но его невозможно было бы сделать без масс-спектрометрии наших коллег из Оксфордского университета», — добавляет Сара Тайхманн, руководитель исследовательской группы EMBL-EBI и Wellcome Trust Институт Сэнгера.«Это еще один отличный пример того, насколько ценными могут быть междисциплинарные исследования».

    Этот пост был первоначально опубликован на EMBL-EBI News.


    Теги: биофизика, эмбле-эби, эволюция, структурная биология

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.