Сложные белки это какие продукты: Сложные белки — это… Что такое Сложные белки?

Бисквит — одна из старейших известных сладостей. Современный бисквит появился в Европе в начале 19 века. Однако его предшественники были популярны гораздо раньше. Первое зарегистрированное упоминание о бисквите относится к итальянской выпечки эпохи Возрождения. Итальянские повара пекли «печенье», которое распространилось в Италии, Англии и Франции. Часто тесто выливали в сложные формы, но также использовали два жестяных обруча, которые ставились на противень, застеленный пергаментной бумагой.

В кухнях разных стран есть свои традиционные бисквиты. Например, на Филиппинах популярен мамон — бисквит в форме пирожного, который покрывается маслом, посыпается сахаром и тертым сыром. «Ангельский бисквит» появился в США в 19 веке и имеет легкую воздушную текстуру, как облако — за счет того, что готовится исключительно из яичных белков. Пао где Ло — португальский бисквит, в который помимо классических ингредиентов добавляется оливковое масло и соль.

Итак, мы рассмотрели классические способы и поделились лайфхаками приготовления трех популярных блюд — омлета, безе и бисквита, основой для которых являются яйца или яичные продукты ЯСЕНСВІТ. И насчет последних — рекомендуем попробовать их в ваших ежедневных кулинарных творениях, если вы хотите сэкономить свое время и усилия. Напомним, что жидкие пастеризованные яичные продукты ЯСЕНСВІТ имеют удобную, компактную и экологическую упаковку, сделанные из вкусных и безопасных яиц ЯСЕНСВІТ, и главное — позволяют добиться идеальных результатов даже в сложных рецептах!

Как поститься без вреда для здоровья

Великий Пост, который в этом году начался 15 марта, самый строгий и продолжительный из всех православных постов. Предлагаем ознакомиться с некоторыми советами, как правильно питаться во время поста, чтобы не навредить здоровью.

Соблюдение Великого поста подразумевает отказ от продуктов животного происхождения, а в какие-то дни и от растительного масла.

Если раньше Пост соблюдали только люди верующие, то сегодня придерживаться ограничений в еде начали и те, кто далек от церковных обычаев и обрядов.

Несмотря на моральную готовность соблюдать Великий пост, многие сомневаются, сможет ли их семья в этот период питаться без вреда для здоровья.

Предлагаем ознакомиться с некоторыми советами, как правильно питаться во время поста, чтобы не навредить здоровью.

Да, это воздержание от излишеств, в том числе пищевых. Но с точки зрения диетологии пост — это очень нерациональное питание, несбалансированное по основным микро- и макронутриентам. Поэтому если вы хотите соблюдать пост, можете это делать, и здорово, что у вас есть сила воли. Но нужно к этому подходить разумно и не пытаться похудеть за счёт поста!

В такие периоды, как пост, очень легко свести свой рацион к минимальному количеству продуктов и есть, например, в основном пасту и хлеб.

В периоды серьёзных ограничений важно получать все необходимые микро- и макроэлементы из разрешённых продуктов. Поэтому чем разнообразнее будет рацион, тем больше шансов, что не возникнет нехватки важных веществ. Кроме того, однообразный рацион может наскучить человеку. Из-за этого соблюдать пост от начала до конца ему будет сложнее.

Необходимо получать белки, жиры, углеводы, витамины, микроэлементы. Во время поста полезные жиры — это растительные масла, белки — это растительные белки (бобовые, грибы, орехи), сложные углеводы, обеспечивающие энергией, — крупы, паста из твердых сортов злаковых, хлеб, хлебцы.

Одна из основных проблем постного рациона — это нехватка животного белка. Белок, особенно животный, очень хорошо насыщает, так как достаточно долго усваивается организмом, кроме того белок — это строительный материал для мышц.

Когда человек существенно ограничивает белок в своём рационе, он теряет вес, и в первую очередь за счёт мышц. А этого категорически нельзя допускать!

В свой рацион во время поста стоит включать продукты, содержащие растительный белок — соевые продукты, бобовые (чечевицу, нут, горох, фасоль (зерновую и стручковую)). Также растительный белок содержат грибы (достаточно тяжёлая для переваривания пища, поэтому лучше их не употреблять каждый день, а пару раз в неделю).

Орехи и крупы тоже содержат белок — их нужно обязательно включать в свой рацион во время поста.

Так вы обеспечите максимальным количеством разных полезных жиров. Ведь в одном виде масла содержатся одни полезные жиры, в другом виде масла — другие. Масло можно добавлять и в крупу, и в овощные блюда. Это будет и вкусно, и полезно.

Важно, чтобы на виду были полезные перекусы, например, овощные чипсы, фрукты, несолёные орехи, тыквенные семечки, хлебцы. То есть то, к чему может потянуться рука, когда хочется не обильно поесть, а просто что-то перекусить, не навредив здоровью.

Выход из поста должен быть плавным. При выходе из поста будьте умеренными при употреблении мясной и жирной пищи. Постепенно и аккуратно возвращайтесь в свой ежедневный рацион. Правильное питание во время Поста — залог хорошего самочувствия!

Белки и здоровье сердечно-сосудистой системы

Белки (иначе — протеины) входят в состав всех органов и тканей нашего тела. Мышцы — основной строительный материал для мышц. Миокард (сердечная мышца) — самый важный потребитель белка, потому что работает без перерыва.

Белки — это источник энергии. При интенсивных нагрузках организм извлекает из белка мышц глюкозу для питания мозга. Протеины входят в состав ферментов, гормонов, антител.

Недостаток белка приводит к нарушению водно-солевого обмена, потере веса за счет мышечной ткани, ослаблению иммунитета, сбоям сердечного ритма, воспалению миокарда и его оболочек.

Интересный факт. Протеин — источник энергии, но его расщепление требует много энергии. Исследования показали, что энергозатраты на переваривание белка составляют около 30 % от его собственной калорийности. Поэтому после плотной белковой пищи многим хочется сладкого («быстрых» углеводов для восполнения энергии).

Продукты, богатые белком

• 1

  Бобовые: фасоль, горох, нут, чечевица, соя. Содержат растительный белок, который легко усваивается, сложные углеводы, клетчатку, макро- и микроэлементы.

• 2

  Крупы: гречневая, перловая, ячневая, овсяная. Источники растительного белка, витаминов, минералов, «медленных» углеводов.

• 3

  Рыба и морепродукты. Из употребление улучшает состояние сердечной мышцы и стенок сосудов, нормализует давление и снижает уровень «плохого» холестерина.

• 4

  Яйца. Вы могли слышать, что яйца вредны для сосудов, так как содержат холестерин. Современные исследования показали, что употребление яиц почти не влияет на уровень холестерина в крови.

• 5

  Курица, индейка. В куриной грудке белка больше, чем в бедрах или крыльях, а жира меньше.

• 6

  Орехи содержат белок, много витаминов и минералов.

• 7

  Молочные продукты, сыр. Содержат белок и животный жир.

Красное мясо и сердце

Много протеина содержится в красном мясе (говядина, свинина, баранина, конина).

Долгое время считалось, что красное мясо вредно для сердца, потому что в нем содержится много насыщенных жиров. Исследования последних лет доказали, что в процессе переваривания красного мяса образуется N-оксид триметиламин — вредное для почек, сердца и сосудов вещество. Но, несмотря на это, не стоит отказываться от красного мяса. Главное, как и везде, мера. Отдавайте предпочтение говядине или нежирной свинине, не ешьте их каждый день.

Важно! Переработанное мясо (колбаса, сосиски) вредны при заболеваниях сердца — это источники насыщенных жиров и лишней соли, а не белка.

Нормы белка

Американский центр по контролю и профилактике заболеваний рекомендует отводить белкам от 10 до 35 % дневной нормы калорий (в граммах это примерно 1,5–2,5 г белка на кг массы тела).

Список литературы

Идентификация белкового комплекса и количественный комплексом с помощью CN-PAGE

Дизайн эксперимента и воспроизводимость данных

Количественные протеомные исследования на основе ЖХ-МС / МС дают большие и информативные наборы данных, но подвержены большим вариациям, что отрицательно влияет на статистический анализ. Поэтому настоятельно рекомендуется обезопасить себя от технических изменений, разработав строгие и строгие рабочие процессы ¹⁴ . Следует проявлять особую осторожность при выборе подходящих методов, используемых для экстракции белковых комплексов, фракционирования и пробоподготовки для масс-спектрометрии, любой из которых или все они могут служить источником технических вариаций.Имея это в виду, мы разработали рабочий процесс, позволяющий обрабатывать экстракты природного белка для сравнительного анализа комплексома растений в различные суточные моменты времени. В этом подходе выделенные белковые экстракты разделяют с помощью нативного PAGE-фракционирования, после чего следует модифицированная процедура расщепления в геле и анализ тандемной масс-спектрометрией (рис. 1). Native-PAGE был выбран для разделения белков по сравнению с обычно используемым SEC, потому что он обеспечивает простое, эффективное и экономичное решение для фракционирования белка ^10,12,15,16 .Это также позволяет создать экспериментальный план, при котором можно приготовить несколько копий образцов и запустить их параллельно на одном геле. Это, в свою очередь, снижает риск внесения дополнительных технических изменений, которые обычно связаны с подготовкой и разделением проб.

Визуальное представление экспериментального рабочего процесса, используемого для изучения комплексных изменений. Схематическое изображение рабочего процесса, используемого для изучения изменений в белковом комплексоме. Белковые экстракты получали из полностью разросшихся листьев Arabidopsis thaliana в нативных условиях и разделяли с помощью нативного PAGE.Затем белки переваривали с использованием модифицированной процедуры расщепления в геле, а пептиды обессоливали с использованием колонок C18. Полученные пептиды анализировали с помощью ЖХ-МС / МС, а необработанную спектральную информацию экспортировали в MaxQuant для идентификации белков и количественного определения без метки на основе пиков. Все последующие анализы данных были выполнены с использованием статистического программного обеспечения R.

В качестве доказательства концепции исследования мы решили проанализировать Arabidopsis thaliana Col-0 растений, собранных в конце светового периода (ED), когда растения являются фотосинтетически активными, и в конце ночи (EN), когда рост растений зависит от внутренних запасов углерода.Нативные белки и интактные белковые комплексы экстрагировали из четырех биологических повторностей при 4 ° C в буфере, не содержащем детергента, и разделяли с использованием 1D нативного PAGE. Нативный гель, приготовленный для этого исследования, показал высокую воспроизводимость разделения белков для всех дорожек. Это было необходимо для получения 20 фракций для каждого из восьми биологических образцов путем разрезания геля по всей ширине (дополнительный рис. 1). Чтобы свести к минимуму технические вариации и загрязнение, фракции образцов были подготовлены для масс-спектрометрического анализа с использованием HiT-Gel, недавно разработанного высокопроизводительного метода разложения в геле ¹⁷ .Необработанные спектральные данные 160 фракций образца были обработаны с помощью MaxQuant. Мы идентифицировали 2338 белков на основе уникальных пептидов в ED и 2469 в EN с перекрытием 88,3% между двумя условиями (рис. 2). Высокая степень перекрытия является предпосылкой для точного сравнения изменений комплексома при ED и EN. Перекрытие между биологическими повторами при ED и EN было представлено в виде диаграммы Венна (рис. 2) с перекрытием 92,5% (ED) и 87,6% (EN). Мы рассчитали коэффициент вариации (CV), используя относительное содержание белков всех идентифицированных белков в четырех биологических повторностях в обеих временных точках.Результат был представлен в виде гистограммы с нормальной кривой (дополнительный рис. 2A, B). Мы также использовали относительное содержание белков для всех идентифицированных белков в качестве входных данных для корреляционного анализа Пирсона между всеми возможными парами биологических реплик одного и того же состояния (рис. 2D). В каждом из парных сравнений мы обнаружили корреляцию выше 0,9. Таким образом, мы можем сделать вывод, что наш экспериментальный рабочий процесс приводит к воспроизводимым протеомным данным с большим количеством совпадений в идентифицированных белках и низкой вариабельностью от образца к образцу.Чтобы определить, не является ли высокая воспроизводимость между нашими экспериментами следствием горизонтального переноса, мы проводим дополнительный эксперимент. Такое же количество белкового экстракта (300 мкг) обрабатывали на двух центральных дорожках геля для электрофореза в ПААГ. Десять случайно выбранных гелевых фракций вырезали, обрабатывали и анализировали с помощью ЖХ-МС / МС (дополнительный рис. 2С). Всего было идентифицировано 20 белков, что предполагает минимальный горизонтальный перенос между полосами геля. Большинство идентифицированных белков аннотировано одним пептидом (дополнительный рис.2D).

Оценка идентификации и воспроизводимости белков в наборах данных. Количественная оценка необработанной спектральной информации без метки была выполнена в MaxQuant для создания наборов данных по белкам в ED и EN. ( A ) Перекрытие между всеми идентифицированными белками в ED и EN было представлено в виде диаграммы Венна. ( B ) В качестве меры воспроизводимости было рассчитано перекрытие 4 биологических повторов в ( B ) ED и ( C ) EN и отображено в виде диаграммы Венна.( D ) Корреляционную матрицу Пирсона использовали в качестве дополнительной меры воспроизводимости на уровне белка. Коэффициенты корреляции рассчитывались для белков попарно по всей матрице для каждой фракции каждой биологической реплики по сравнению с другой.

Профилирование белков и деконволюция профилей

Основной целью нашего исследования было создание эффективного метода сравнительного анализа белковых комплексов. После идентификации и количественной оценки белков были рассчитаны профили миграции всех белков по градиенту молекулярной массы, чтобы позволить дальнейший анализ данных, такой как кластеризация, идентификация белковых комплексов и статистический анализ изменений в содержании белковых комплексов между ED и EN.

В основе нашего конвейера обработки данных лежит статистическое программное обеспечение R. Наш конвейер анализа данных начинается с реконструкции профилей миграции белка путем объединения соседних фракций, вырезанных из геля. На следующем этапе мы идентифицировали локальные максимумы (пики) вдоль градиента молекулярной массы для каждого белка, используя функцию точек поворота (пакет pastecs) в R (рис. 3). Локальные максимумы были отфильтрованы, чтобы удалить максимумы ниже 20% от наивысшего относительного содержания вдоль профиля белка.

Схематическое изображение деконволюции профиля белка. Один белок из эксперимента ED был выбран в качестве примера, чтобы проиллюстрировать процедуру деконволюции профиля белка. В этом случае профиль элюции выбранного белка можно упростить до четырех отдельных пиков. На первом этапе алгоритм определяет локальные максимумы в сложном профиле элюирования. После определения локальных максимумов выполняется строгий процесс фильтрации для выявления отдельных пиков, которые, скорее всего, скрыты в сложном профиле.На этом этапе вновь идентифицированные пики сравниваются с локальными максимумами, и генерируются деконволютированные пики, где наблюдается четкое перекрытие.

Затем мы отделили кажущиеся массы для всех идентифицированных белковых пиков от их мономерных масс, которые мы получили из базы данных TAIR10 ¹⁸ . Это предоставило нам обзор состояния олигомеризации (R _app ) всех пиков белка, идентифицированных в наших экспериментах. Распределение видимых масс идентифицированных белков визуально суммировали с помощью диаграмм рассеяния (дополнительный рис.3). Мы применили двукратное отсечение мономерной массы к нашим данным, потому что ранее было показано, что это хороший порог для идентификации белков в олигомерных сборках ^10,15 . Большинство идентифицированных белков (89%) в наших данных приходилось на фракции, соответствующие диапазонам размеров, превышающим их мономерную массу. Менее 11% пиков были идентифицированы в мономерном диапазоне, и белки испытали минимальную деградацию, на что указывает небольшое количество пиков с R _app менее 0.5. Эти данные показывают, что большинство белков находится в комплексах. В качестве дополнительного доказательства белковых комплексов в наборе данных мы использовали гистограмму, чтобы суммировать распределение мономерных масс по сравнению с наблюдаемыми диапазонами размеров каждого локального максимума (дополнительный рис. 4). Гистограмма показала, что мономерные массы в основном наблюдались в узком и более низком окне диапазона масс, чем у кажущихся масс. Это еще раз подтверждает, что белковые комплексы фиксируются в нашем наборе данных.

Впоследствии каждую из хроматограмм белка деконволютировали на отдельные пики, которые представляют независимые гомо- или гетеромерные состояния олигомеризации белка. В случае взаимодействия белков белки, которые взаимодействуют с образованием сборки, также будут иметь общий пик. Из-за гетерогенного состава белковых комплексов не ожидается, что все возможные взаимодействующие элементы будут демонстрировать идентичные профили элюирования белка. Партнеры по взаимодействию могут скорее разделять одну вершину, но иметь общий очень отдаленный профиль.Следовательно, сложные белковые профили проблематичны в подходах к кластеризации, которые полагаются на евклидово расстояние между целыми профилями. После деконволюции каждый пик можно рассматривать как отдельный объект, независимый от других пиков в исходном профиле (рис. 3). Хотя деконволюция профиля была успешно реализована в анализе белковых комплексов млекопитающих на основе SEC, насколько нам известно, она не проводилась в исследованиях на растениях и в подходах, основанных на PAGE.

Мы использовали набор из 4 параметров для деконволюции профилей обилия белков. на изолированные пики.Вкратце, профиль анализировали, переходя от фракции к фракции и начиная с самой низкой молекулярной массы. В каждой позиции использовалось дерево решений. Только относительное содержание белка, превышающее 5% от максимального содержания в общем профиле, считалось частью деконволютированного пика (минимальный рассматриваемый сигнал). Если содержание фракции превышает содержание предыдущей, то профиль считается повышающимся к пику, а следующие фракции анализируются. Если численность снижается до <70% максимальной численности в текущем пике, сценарий считает, что профиль переходит на нисходящий уклон, и доля пика фиксирована.Пик считается завершенным, когда сигнал пересекает минимальный рассматриваемый сигнал или относительное содержание в следующей фракции увеличивается на> 30% по сравнению с предыдущей. Наконец, предполагаемый пик должен соответствовать еще двум критериям, чтобы его принял сценарий деконволюции: во-первых, записанная доля пика должна быть аннотирована в виде локальных максимумов (см. Выше), а во-вторых, относительное содержание в месте пика должно быть > 20% от максимальной численности в общем профиле.Затем мы удалили деконволютированные пики, представляющие мономерное состояние, сравнив размер каждого пика с мономерной молекулярной массой соответствующего белка согласно базе данных TAIR10.

Недавние подходы к изучению комплексома у растений не смогли преодолеть проблему, представленную сложными профилями белков в экспериментах по нативному фракционированию ^10,15,16 . Чтобы обойти проблему формы пика и множественных пиков на профиль белка, исследователи сосредоточили свой анализ на положении максимального содержания белка в профиле и рассмотрели белки с аналогичными максимумами в качестве предполагаемых партнеров по взаимодействию.Это решение действительно дает представление об образовании белковых комплексов, но исключает возможность идентификации совместно элюируемых белковых комплексов в остальных фракциях. Ранее сообщалось, что деконволюция профилей элюирования является возможным решением, и мы применили наш собственный метод деконволюции для решения проблемы ¹² . Используя двукратное отсечение молекулярной массы, чтобы исключить деконволютированные пики, представляющие мономерные белки, мы обнаружили 1768 (ED) и 1758 (EN) белков в диапазоне размеров, указывающих на образование белкового комплекса (рис.4A – C) с перекрытием 1798 белков между ED и EN. Большинство (приблизительно 74%) белков показывают только один пик, указывающий на образование комплекса, в то время как приблизительно 16% имеют два пика, 7% 3 и 2% 4 пика (фиг. 4D). Пять пиков наблюдались только примерно в 1% белков. Следовательно, большинство белков обнаруживается только в одном белковом комплексе в нашем собственном анализе PAGE.

Оценка идентификации белкового комплекса между ED и EN.Перекрытие между белковыми комплексами, идентифицированными в каждом из биологических повторений в ( A ) ED и ( B ) EN, было рассчитано и визуализировано в виде диаграмм Венна. ( C ) Также была составлена ​​диаграмма Венна, чтобы показать перекрытие между общим количеством белка в комплексах, идентифицированных в ED и EN. ( D ) Белки, которые участвуют в образовании комплекса, должны иметь по крайней мере один пик в дополнение к их мономерному пику. Чтобы проиллюстрировать вероятность образования комплекса, количество пиков, продуцируемых каждым белком, было визуализировано в виде столбчатой ​​диаграммы.

Влияние деконволюции профиля на анализ данных

Чтобы продемонстрировать значение деконволюции, мы использовали профиль элюции аспартат-полуальдегиддегидрогеназы (AT1G14810) в качестве примера (рис. 5A). После деконволюции исходного профиля распределения по размерам мы получили три различных пика. Затем все пики после деконволюции были сгруппированы на основе их евклидова расстояния. Три пика аспартат-полуальдегиддегидрогеназы были идентифицированы в трех независимых кластерах. Далее мы проанализировали кластеры с использованием аннотаций GO ¹⁹ для идентификации функционально связанных белков.В каждом из кластеров были идентифицированы функционально связанные белки, которые потенциально могут образовывать комплекс с аспартат-полуальдегиддегидрогеназой (рис. 5А). Предполагаемые партнеры по взаимодействию уникальны для каждого кластера. Мы предполагаем, что аспартат-полуальдегиддегидрогеназа образует различные олигомерные комплексы в разных диапазонах размеров. Идентификация этих кластеров не была возможна с использованием исходного и сложного белкового профиля аспартат-полуальдегиддегидрогеназы. Этот подход также можно использовать для эффективной идентификации более крупных комплексов с множеством субъединиц (рис.5Б). Однако он ограничен сложностью данных и не предназначен для однозначного прогнозирования новых взаимодействий. Тем не менее, данные могут быть полезны для подтверждения предсказанных взаимодействий или образования метаболонов в конкретном метаболическом пути. Кроме того, это может также помочь в подтверждении присутствия известных белковых партнеров в пути или предложить новые предполагаемые взаимодействия, которые будут руководить будущими исследованиями взаимодействия белков в меньшем масштабе.

Важность деконволюции белкового профиля для идентификации белковых комплексов.Профиль миграции аспартат-полуальдегиддегидрогеназы деконволюционировал до трех отдельных пиков. ( A ) Каждый из деконволютированных пиков был обнаружен в отдельном кластере после анализа иерархической кластеризации. Визуально были представлены профили белков, обнаруженных в одном кластере, которые также функционируют в том же клеточном процессе, что и аспартат-полуальдегиддегидрогеназа. Слева: окислительно-восстановительный процесс (AT1G14810_1), процесс биосинтеза метионина (AT1G14810_2), процесс биосинтеза лизина через диаминопимелат (AT1G14810_3).( B ) Чтобы определить влияние деконволюции на очень сложные профили белков, показан профиль элюции ряда белков пентозофосфатного пути. На верхней панели деконволюция не применяется, и в результате иерархическая кластеризация не может использоваться для идентификации белков как находящихся в комплексе. На нижней панели была выполнена деконволюция, которая дала четко определенные пики, которые можно было использовать в том же подходе иерархической кластеризации для идентификации комплекса из 16 белков.

Было обнаружено, что большинство белков в наборах данных существуют как белковые сборки (рис. 4, дополнительные рис. 3 и 4). Поскольку эти сборки должны быть стабильными в естественных условиях, субъединицы этих белковых комплексов должны оставаться собранными во время разделения и давать сопоставимые профили миграции. Мы решили рассчитать евклидово расстояние между всеми возможными парами деконволютированных пиков как меру сходства. Чтобы определить евклидово расстояние отсечения, которое отделяет прогнозы взаимодействия от пар невзаимодействующих белков, был проведен анализ кривой рабочих характеристик приемника (ROC).Кривые ROC требуют набора данных истинно положительных и истинно отрицательных пар белков (TP и TN). Набор данных TP был создан с использованием белковых комплексов Arabidopsis, аннотированных в категории TAIR GO «белковый комплекс» (GO: 0043234). Набор данных TN состоит из пар белков, причем один белок является частью набора TP, а второй выбирается случайным образом из оставшегося набора данных. Кривые ROC были построены для данных ED и EN с использованием как исходного, так и деконволютированного профиля белка (дополнительный рисунок 5). Каждая точка на кривой ROC представляет собой истинно положительный показатель (TPR), также называемый чувствительностью, и ложноположительный показатель (FPR), или 1-специфичность, в парах белков, которые считаются взаимодействующими на определенном пороговом евклидовом расстоянии.Мы наблюдали крутой подъем наших кривых ROC с сильным отклонением от линии отсутствия дискриминации. Это показывает, что по мере постепенного увеличения отсечения Евклидова расстояния истинно положительные взаимодействия обнаруживаются быстрее, чем ложноположительные взаимодействия (дополнительный рис. 5). Более того, кривые ROC, рассчитанные на основе профилей деконволюции белков, показали немного лучшую кривую, указывающую на то, что деконволюция способствовала повышению специфичности и чувствительности. Наши кривые ROC также показали более высокую чувствительность и специфичность, чем сообщалось ранее для аналогичных исследований, что подтверждает качество сгенерированных наборов данных ^12,20 .

Реконструкция биологически значимых путей

Чтобы оценить качество нашего набора данных, мы выбрали белки из биологически значимых путей и реконструировали белковые комплексы, используя деконволюцию пиков.

Первый белковый комплекс, протеасома, также является предпочтительным эталонным комплексом для оценки качества набора данных в других исследованиях ^10,15,16 . Этот комплекс присутствует во всех эукариотических клетках и отвечает за деградацию белков в цитозоле.Протеасома состоит из каталитической 20S ядерной частицы (CP) и 19S регуляторной субъединицы (RP) ²¹ . Визуально представленная в виде тепловой карты, мы смогли обнаружить как CP, так и RP в легко различимых кластерах (рис. 6). Центральная субъединица также была идентифицирована в меньшем диапазоне размеров, чем регуляторная субъединица, что соответствует литературным данным ²² . Однако нам не удалось обнаружить полностью собранную протеасому. Этого и следовало ожидать, поскольку полностью собранная протеасома A.thaliana имеет молекулярную массу приблизительно 2MDa и не может быть эффективно захвачен с помощью нативного метода PAGE.

Перемещение профилей протеасомных субъединиц белка. Белковые профили субъединиц, составляющих протеасомный комплекс, исследовали в ( A ) ED и ( B ) EN. Показанные тепловые карты представляют собой профили элюирования деконволютированных белков, которые принадлежат регуляторным и коровым субъединицам протеасомного комплекса.Профили белков были нормализованы до максимального значения. Зеленые области указывают фракцию, в которой наблюдалось наибольшее содержание белка. Коммиграция наблюдалась для составляющих регуляторных и основных субъединиц протеасомного комплекса. Справа от тепловых карт показаны профили элюирования белка, используемые для создания соответствующих тепловых карт. ( C ) Сравнение содержания протеасомных белков проводили в ED и EN. Общее содержание каждого из белков, принадлежащих основной (слева) и регуляторной (справа) субъединицам протеасомы, сравнивали между двумя временными точками.Содержание каждого из белков было суммировано по фракциям и представлено желтыми и синими кружками для ED и EN, соответственно.

На основании аннотаций в базе данных KEGG CP должен присутствовать в виде гетеромерной сборки из 23 α- и β-субъединиц, в то время как RP состоит из 32 белков ²³ . Использование SEC-подхода для изучения белковых комплексов Arabidopsis Aryal et al . ¹⁰ восстановило 16 (70%) белков ЦП и 3 белка (9.3%) от РП. Мы идентифицировали 20 (87%) и 22 (95%) совместно мигрирующих белков CP в ED и EN, соответственно (рис. 6). Для RP удалось обнаружить 24 (75%) совместно мигрирующих белка в ED и EN (фиг. 6). Этот анализ показывает, что наш подход является высоко воспроизводимым и обеспечивает улучшенное покрытие протеасомы по сравнению с предыдущими исследованиями ^10,16 . Мы также расширили этот анализ, чтобы сравнить относительные количества белков, которые образуют субъединицы протеасомы в ED и EN (рис.6). Наблюдалось, что распределение белковых соотношений является стабильным, что указывает на воспроизводимость измерений в оба момента времени.

В качестве второго анализа мы намеревались исследовать состояния олигомеризации определенных ферментов в хорошо известном метаболическом пути. С этой целью мы выбрали цикл трикарбоновой кислоты (ТСА). Цикл TCA присутствует в митохондриях и управляет клеточным дыханием в окислительных условиях. Было высказано предположение, что ферменты в цикле TCA способны образовывать супрамолекулярные комплексы со слабыми и временными взаимодействиями ^24,25 .

Чтобы проверить эту теорию, мы применили наш метод для исследования 63 ферментов из базы данных KEGG, которые участвуют в реакциях цикла TCA и обратного цикла TCA (рис. 7A). Из этих 63 назначенных белков мы смогли обнаружить 40 (63,5%). Почти все обнаруженные ферменты имели состояние олигомеризации (R _{примерно} ) более двух, что указывает на образование комплекса (дополнительная таблица 1). Чтобы определить, какие из ферментов могут взаимодействовать друг с другом, мы выбрали ферменты, которые участвуют в восьми основных реакциях пути, и сравнили их профили элюирования.Почти на всех каталитических стадиях мы могли наблюдать, что ферменты имели очень похожие профили элюирования по градиенту размера, что позволяет предположить, что они могли образовывать белковый комплекс (рис. 7B).

Использование цикла TCA в качестве основы для тестирования идентификации белковых комплексов. Используя базу данных KEGG в качестве справочной, была составлена ​​блок-схема цикла TCA. На этой диаграмме ферменты, катализирующие индивидуальные реакции превращения субстрата, отмечены узлами.Эта блок-схема служила каркасом, на котором было выполнено сравнение узлов с набором данных ED. Удалось проверить почти все реакции превращения, за исключением сукцинил-КоА в сукцинат. Ферменты, участвующие в этом этапе, не были обнаружены ни в одной из экспериментальных повторностей. Впоследствии профили белков всех обнаруженных ферментов в каждом отдельном узле были объединены, чтобы наглядно проиллюстрировать возможности нашего метода для обнаружения взаимодействий между белками и белками. ( B ) Графический обзор сети взаимодействия PPI, спрогнозированный для цикла TCA с использованием набора данных ED.( C ) Показано совпадение между ИЦП, обнаруженными в наборе данных ED, и ИЦП, определенными Чжаном и его коллегами26. ( D ) Взаимодействия, выявленные между ферментами, которые катализируют последовательные реакции в цикле TCA, о которых не сообщалось Zhang и соавторами26 ( E ) Прогнозируемые белковые взаимодействия внутри ферментных белковых комплексов аконитазы (слева) и цитратлиазы АТФ (справа) . Прогнозируемые взаимодействия наблюдались с использованием отсечки Евклидова расстояния, как было заранее определено с помощью анализа кривой ROC (10% FDR).Ферменты и их изоформы представлены узлами, а соединяющие их ребра показывают потенциальные взаимодействия.

Другой важный метод регуляции метаболизма зависит от микрокомпартментации ферментов, также известных как образование метаболонов ^26,27,28 . Недавно Zhang и соавторы показали каналирование субарет во взаимодействии цикла TCA и выявили сам интерактом ²⁹ . Используя эти данные PPI в качестве эталона, мы провели анализ белковых комплексов в отделении неотложной помощи.Чтобы идентифицировать потенциальные ИПП, в нашем анализе CN-PAGE мы вычислили евклидово расстояние между деконволютивными пиками всех ферментов, связанных с циклом TCA. Используя наш анализ кривой ROC, мы установили порог евклидова расстояния на основе 10% отсечки FDR. Если рассчитанное евклидово расстояние между двумя пиками после деконволюции было меньше порогового значения, мы считали, что белковая пара взаимодействует. Мы идентифицировали 27 ферментов, связанных с циклом TCA, с сетью из 74 взаимодействий (рис. 7B).Сеть взаимодействия, описанная Zhang et al . состоит из 158 взаимодействий между 38 белками, аннотированными в цикле TCA ²⁹ . Сравнивая два исследования, было обнаружено, что перекрываются только 11 белков. Эти белки производили 14 взаимодействий в исследовании Zhang et al . Из этих 14 PPI только два (ACO2 | ACO3 и ACO3 | IDH6) также наблюдались в нашем анализе взаимодействий между ферментами цикла TCA ²⁹ (рис. 7C).

В то время как исследование Zhang и соавторов сообщило о существовании метаболонов в цикле TCA, небольшое совпадение между данными их взаимодействия с белками и нашим подходом CN-PAGE указывает на то, что PPI и образование метаболонов в цикле TCA еще не полностью решены. .Метаболоны определяются как взаимодействия последовательных ферментов метаболического пути, которые позволяют эффективно направлять метаболиты ^26,28,30 . Поэтому мы проанализировали 74 PPI, предсказанные анализом кривой ROC для взаимодействий между последовательными ферментами цикла TCA, о которых не сообщалось Zhang et al . Мы наблюдали взаимодействие субъединицы аконитазы ACO2 с субъединицей изоцитратдегидрогеназы IDH6. Кроме того, в нашем наборе данных предполагалось, что две оставшиеся субъединицы изоцитратдегидрогеназы (IDh2 и IDH5) и кетоглутаратдегидрогеназа (ODC1-1) будут взаимодействовать.Наконец, мы предсказали взаимодействие между субъединицей цитратсинтазы (CSY4) с ACO1 (рис. 7D). Об этом конкретном взаимодействии не сообщили Чжан и его сотрудники ²⁹ . Однако образование метаболона между MDH, CYS и ACO было описано до ³¹ .

Кроме того, наши данные предполагают взаимодействия между известными белковыми комплексами, аконитазой (ACO) и тремя субъединицами цитратлиазы АТФ (ACL), которые играют важную роль в восстановительном цикле TCA ³² (рис.7E). Хотя для подтверждения этого предполагаемого взаимодействия требуются дальнейшие эксперименты, интересно предположить, что может происходить образование метаболона между ACO и ACL и поддерживать передачу субстратов от изоцитрата через цитрат к оксалоацетату.

Мы также предположили, что состояние олигомеризации ферментов может зависеть от факторов окружающей среды, таких как свет и температура. Поскольку цикл TCA работает в разных режимах при свете и в темноте, мы использовали наши наборы данных ED и EN для проверки этой гипотезы ³³ .Однако мы не смогли наблюдать никаких изменений в состоянии олигомеризации ферментов, связанных с циклом TCA, между двумя временными точками (дополнительная таблица 1). Было показано, что перестройки взаимодействия между комплексами цикла TCA играют роль в ответе растительных клеток на окислительный стресс ³⁴ . Отсутствие значительных изменений между ED и EN может указывать на то, что в нормальных условиях роста растения регулируют активность ферментов цикла TCA независимо от состояния олигомеризации — потенциально с помощью посттрансляционных модификаций ^35,36,37 .Также возможно, что перестройки в белковых комплексах цикла TCA между ED и EN незначительны и не могут быть разрешены с помощью нашего экспериментального подхода. Более того, изменения в сложном составе или содержании между ED и EN могут происходить в основном в нестабильных ИЦП, которые, как правило, недостаточно представлены в нашем наборе данных.

В будущих экспериментах установленный конвейер обработки проб и анализа данных может быть применен для изучения изменений в содержании и составе белковых комплексов в ответ на изменения в окружающей среде или вслед за восприятием биотического или абиотического стресса.

Количественный анализ комплексомов в ED и EN

Мы продолжили развитие нашего подхода к количественному сравнению белковых комплексов и применили его для изучения комплексома A. thaliana в ED и EN. Высокая воспроизводимость данных позволила нам сравнить изменения относительного содержания белковых комплексов между двумя временными точками. Площадь под кривой (AUC) была рассчитана для всех идентифицированных белков на основании профилей миграции после деконволюции.Используя отсечение Евклидова расстояния, полученное анализом кривой ROC (дополнительный рис. 5), были идентифицированы профили, предположительно представляющие белки одного и того же белкового комплекса. Затем данные были отфильтрованы для белков, которые присутствовали как в наборе данных ED, так и в EN. Это позволило нам специально исследовать изменения численности в отдельные моменты времени и в то же время исключить изменения, вносимые составом белка. Затем вычисляли среднее значение AUC для каждого из белковых комплексов и сравнивали между временными точками.Рассчитанные таким образом отношения показаны в виде горизонтальной гистограммы (фиг. 8A). Парный t-критерий использовался для проверки значимости наблюдаемых изменений. В то время как большинство белковых комплексов, которые мы идентифицировали, не показали значительных изменений в содержании между ED и EN, скопления пластидных рибосом показали более высокое содержание в EN, чем в ED (рис. 8B). На первый взгляд это наблюдение кажется противоречащим предыдущим исследованиям, которые показали, что количество рибосомных белков стабильно в течение всего суточного цикла у растений ³⁸ .Однако было показано, что трансляционная активность рибосом днем ​​выше, чем ночью ³⁹ . Сборки рибосом, разрешенные в нашем собственном анализе PAGE, имеют размер менее 1MD и, следовательно, представляют собой не полностью собранные рибосомы, необходимые для трансляции, а отдельные субъединицы. Это можно объяснить молекулярной массой полностью собранной пластидной рибосомы, которая составляет приблизительно 2 МДа и превышает диапазон размеров прозрачного геля нативного ПААГ, использованного в этом исследовании.Однако малая субъединица имеет молекулярную массу около 650 кДа и может растворяться в геле. Большая субъединица составляет примерно 1300 кДа и соответствует верхнему пределу диапазона размеров геля ^40,41 . Следовательно, более высокое количество сборок рибосомных белков, которые мы наблюдали, показывает, что неактивные рибосомы разбираются в течение ночи, и их субъединицы могут быть разделены в нашем собственном PAGE. Это объяснение также подчеркивает способность нашего метода точно определять, когда происходят изменения относительного содержания белка в белковых комплексах.

Комплексом Arabidopsis в ED и EN. Относительное содержание белковых комплексов из базы данных GO-Slim сравнивали в ED и EN. Были рассчитаны отношения AUC для субъединиц белкового комплекса, идентифицированные в ED и EN, и усреднены для белков, принадлежащих к одному и тому же комплексу. ( A ) Количество белков, из которых состоит комплекс. ( B ) Гистограмма общего содержания рибосомных белков, обнаруженных в каждой фракции геля.Анализ проводился для всех перекрывающихся рибосомных белков, которые присутствовали в обоих экспериментах.

Характеристика белкового комплекса, содержащего сплайсосомные белки SAPs 49, 130, 145 и 155

Mol Cell Biol. 1999 Oct; 19 (10): 6796–6802.

Отделение клеточной биологии Гарвардской медицинской школы, Бостон, Массачусетс

Поступила в редакцию 11 мая 1999 г .; Изменения запрошены 23 июня 1999 г .; Принято 9 июля 1999 г.

Abstract

SF3b представляет собой U2 snRNP-ассоциированный белковый комплекс, необходимый для сборки сплайсосом. Хотя доказательства того, что SF3b содержит сплайсосомные белки SAPs 49, 130, 145 и 155, накопились, опосредованная белками ассоциация между всеми этими белками еще не была продемонстрирована напрямую.Здесь мы сообщаем о выделении кДНК, кодирующей SAP 130, которая завершает клонирование предполагаемых сложных белков SF3b. Используя антитела к SAP 130 и другим предполагаемым компонентам SF3b, мы показали, что SAP 130, 145 и 155 присутствуют в белковом комплексе в ядерных экстрактах и ​​что эти белки связываются друг с другом в очищенном U2 snRNP. Более того, SAP 155 и 130 взаимодействуют друг с другом (прямо или косвенно) внутри этого комплекса, а SAP 49 и 145, как известно, взаимодействуют друг с другом напрямую.Таким образом, вместе с предыдущей работой, наши исследования показывают, что SAP 49, 130, 145 и 155 действительно являются компонентами SF3b. Гомологи Saccharomyces cerevisiae SAP 49 и 145 кодируются основными генами. Мы показываем здесь, что гомологи S. cerevisiae SAP 130 и 155 (scSAP 130 / RSE1 и scSAP 155, соответственно) также важны. Недавно белки SF3b были обнаружены в очищенном snRNP U12, который функционально замещает snRNP U2 в минорной сплайсосоме. Этот высокий уровень консервативности вместе с предыдущим наблюдением, что белки SF3b взаимодействуют с пре-мРНК очень близко к сайту разветвления, позволяют предположить, что комплекс SF3b играет критическую роль вблизи или на каталитическом ядре сплайсосомы.

Было идентифицировано множество белков, необходимых для сборки и сплайсинга сплайсосом, и теперь известны многочисленные человеческие гомологи основных факторов сплайсинга дрожжей (обзоры см. Ссылки 19, 20, 24 и 29). К числу наиболее охарактеризованных из них относятся компоненты мяРНП U2 (обзоры см. В ссылках 19, 20 и 29). У млекопитающих функциональный 17S U2 snRNP может быть собран из 12S U2 snRNP и двух основных факторов сплайсинга, SF3a и SF3b (5, 6). SF3a очищен до гомогенности и содержит три белка (SF3a60, SF3a66 и SF3a120) (5, 6).SF3b был очищен с помощью нескольких хроматографических стадий, но не был очищен до гомогенности (5, 6). Компоненты, которые, как считается, составляют SF3b, были идентифицированы путем сравнения очищенного 17S U2 snRNP и сплайсосомного комплекса A (обзоры см. В ссылках 14 и 19). Обильные белки, общие для обоих этих комплексов, обозначаются как SF3b 53, 120, 150 и 160 в 17S U2 snRNP и SAP 49, 130, 145 и 155, соответственно, в сплайсосоме (здесь мы используем последнюю номенклатуру) ( 2, 6, 19).Дальнейшие доказательства того, что по крайней мере два из этих белков являются компонентами SF3b, получены из наблюдения, что SAP 49 и 145 взаимодействуют напрямую друг с другом (7). Кроме того, SAP 49, 145 и 155, а также все три субъединицы SF3a могут быть УФ-сшиты с областью, окружающей сайт разветвления в сплайсосомном комплексе A (11, 12). Таким образом, все эти белки расположены рядом друг с другом в функциональных сплайсосомных комплексах, что согласуется с представлением о том, что они присутствуют в комплексе. Несмотря на все косвенные доказательства того, что SAP 49, 130, 145 и 155 соответствуют SF3b, остается установить, действительно ли какие-либо из этих белков или все они являются компонентами единого белкового комплекса.

Все компоненты SF3a млекопитающих и три предполагаемых компонента SF3b (SAP 49, 145 и 155) были клонированы (19). Кроме того, были идентифицированы дрожжевые аналоги SF3a, которые, как было показано, необходимы для жизнеспособности (обзор см. В ссылке 19). В отличие от SF3a, ни один из предполагаемых компонентов SF3b не был идентифицирован на ранних генетических скринингах факторов сплайсинга дрожжей. Однако вероятные гомологи Saccharomyces cerevisiae SAP 145 и 155, scSAP 145 и scSAP 155 были идентифицированы в базе данных GenBank на основании их сходства с соответствующими белками млекопитающих (7, 12, 26).Один из этих белков, scSAP 145, впоследствии оказался таким же, как CUS1, белок, идентифицированный как супрессор мутации мяРНК U2 (27). scSAP 145 необходим для сборки комплекса у дрожжей (27). scSAP 49 / HSh59 также был идентифицирован в базе данных и, как было показано, важен для жизнеспособности дрожжей (15). Дрожжевые SAP 49 и 145, как и их аналоги у млекопитающих, напрямую взаимодействуют друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий и, таким образом, считаются компонентами дрожжевого комплекса SF3b (10, 15).Пока не известно, важен ли scSAP 155 для дрожжей или существует дрожжевой аналог SAP 130.

Здесь мы сообщаем об выделении кДНК, кодирующей SAP 130. Используя антитела к этому белку, а также антитела к другим предполагаемым компонентам SF3b, мы показали, что SAP 130, 145 и 155 присутствуют в белковом комплексе и что SAP 130 и 155 взаимодействуют (прямо или косвенно) друг с другом в этом комплексе. Вместе с предыдущей работой наши данные убедительно свидетельствуют о том, что SAP 49, 130, 145 и 155 являются компонентами SF3b.Мы также завершили описание дрожжевых аналогов SF3b, идентифицировав гомолог S. cerevisiae SAP 130 и продемонстрировав, что он и scSAP 155 важны для дрожжей. Таким образом, вместе данные показывают, что сплайсосомные белки SAPs 49, 130, 145 и 155 являются компонентами высококонсервативного белкового комплекса, необходимого для сплайсинга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение кДНК SAP 130.

Сплайсосомный комплекс A3 ‘был продуцирован в больших количествах путем инкубации биотинилированной пре-мРНК AD3’ENH (которая не имеет 5’-сайта сплайсинга, но содержит экзонный энхансер) в крупномасштабных реакциях сплайсинга (11 мл) (3, 9).Комплекс A3 ‘выделяли гель-фильтрацией с последующим связыванием с авидиновой агарозой. Общий белок из очищенного комплекса A3 ‘затем фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS), и полосу SAP 130 вырезали из геля, окрашенного кумасси бриллиантовым синим. Две последовательности (NVSEELDRTPPEVSK и KLEDIRTRYAF) были получены с помощью микросеквенирования (W. Lane, Microchemistry Facility, Гарвардский университет). Эти последовательности кодируются частичной кДНК в базе данных GenBank (номер доступа.{«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «T92977», «term_id»: «724890», «term_text»: «T92977»}} T92977). На основе этой последовательности были сконструированы олигонуклеотидные зонды для скрининга библиотек кДНК бактериофага λ человека. Частичная кДНК, кодирующая 718 аминокислот от карбоксильного конца SAP 130, была выделена из этого скрининга. Чтобы выделить 5′-конец кДНК SAP 130, мы использовали быструю амплификацию концов кДНК и амплификацию ПЦР (кДНК Marathon Ready; Clontech). Полноразмерную кДНК SAP 130 получали путем соединения клонов 5′- и 3’-кДНК.

Вестерн-анализ и иммунопреципитация.

Кроличьи поликлональные антитела были индуцированы против карбоксиконцевой пептидной последовательности SAP 130, VSKKLEDIRTRYAF (HRP Inc). Были описаны моноклональные антитела cap (4) и B «(13) и кроличьи поликлональные антитела SAP 155 (26), SAP 145 (23) и hPrp17 (31). Поликлональные антитела кролика SF3a будут описаны в другом месте (9a). Для вестерн-блоттинга сплайсосомные комплексы выделяли гель-фильтрацией с последующей аффинной очисткой биотин-авидин (2, 21).Суммарные белки фракционировали на SDS – 6% полиакриламидных гелях, а затем иммобилизовали на поливинилидендифторидных мембранах. Поликлональные антитела использовали в разведении 1/1000, а вторичные козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, использовали при 1/5000. Блоты блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,1% твин 20. Белки определяли с помощью набора ECL (Amersham). Иммунопреципитацию U2 snRNP с кэпом или B «антителом проводили путем связывания антитела с протеином G-сефарозой и затем вращения с ядерным экстрактом в течение 4 часов.После обширной промывки 250 мМ NaCl – 20 мМ Трис (pH 7,8) белки элюировали SDS, РНКазой A или 1 М мочевиной, как указано ниже.

Иммунопреципитацию элюатов РНКазы и мочевины проводили путем вращения с указанными антителами с последующей промывкой 250 мМ NaCl – 20 мМ Трис (pH 7,8).

Нарушение scSAP 130 и 155 в

Разрушение scSAP 130 проводили с использованием стандартных процедур гомологичной рекомбинации (22).Вкратце, примерно 0,5 т.п.н. 5′-фланкирующей области и примерно 0,5 т.п.н. 3′-фланкирующей области гена SAP 130 амплифицировали из общей геномной ДНК дрожжей с помощью ПЦР с соответствующими праймерами. Эти фланкирующие области затем клонировали по обе стороны от гена LEU для получения плазмиды pscSAP 130Δ :: LEU . Эту плазмиду расщепляли с помощью Alw NI на 5′-конце и Stu I на 3′-конце фланкирующих SAP 130 областей, и ДНК использовали для трансформации диплоидного штамма дрожжей дикого типа.Для разрушения scSAP 155 1,229 т.п.н. 5′-фланкирующей области и 761 п.н. 3′-фланкирующей области гена SAP 155 амплифицировали из общей геномной ДНК дрожжей с использованием ПЦР и соответствующих праймеров. Эти фланкирующие области затем клонировали по обе стороны от гена LEU для создания плазмиды pscSAP 155Δ :: LEU . Эту плазмиду расщепляли Apa I на 5′-конце и Xba I на 3′-конце фланкирующих областей SAP 155, и ДНК использовали для трансформации диплоидного штамма дрожжей дикого типа.Трансформанты отбирали на чашках без лейцина, и правильную интеграцию гена LEU в локус SAP 130 проверяли анализом по Саузерну. Трансформанты спорулировали и тетрады препарировали стандартными процедурами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение кДНК человеческого SAP 130.

Для выделения кДНК, кодирующей SAP 130, мы очистили сплайсосомный комплекс A в больших количествах (3). Белки в этом комплексе фракционировали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле, и пептидные последовательности получали из продуктов триптического расщепления SAP 130.Эти последовательности использовали для выделения полноразмерной кДНК (см. Материалы и методы). Предполагается, что кДНК SAP 130 кодирует белок из 1217 аминокислот с молекулярной массой 130 кДа и изоэлектрической точкой 5,10 (рис.). Инициатору метионина предшествует хорошо законсервированная последовательность Козака, и рамка считывания закрыта перед этим метионином, что указывает на то, что кДНК кодирует полноразмерный белок SAP 130 (18) (данные не показаны).

Прогнозируемая аминокислотная последовательность кДНК SAP 130.Показана аминокислотная последовательность, предсказанная на основе последовательности кДНК SAP 130 человека. Две пептидные последовательности, полученные в результате микросеквенирования, подчеркнуты один или два раза, а пептид, используемый для получения антител, заключен в рамку.

Для дальнейшей характеристики кДНК SAP 130 мы подняли кроличьи поликлональные антитела к С-концевому пептиду (рис.). Это антитело является высокоспецифичным для SAP 130, поскольку оно обнаруживает только одну полосу 130 кДа в общих экстрактах ядер клеток HeLa (рис. A). Белок, продуцируемый in vitro трансляцией кДНК SAP 130, совпадает с белком, обнаруженным на Вестерн-блоттинге антителами к SAP 130 (рис.А). Антитела SAP 130 также обнаруживают белок SAP 130 в аффинно-очищенных сплайсосомных комплексах (рис. B и C). Этот белок связывается со сплайсосомами через 10 минут сборки и остается связанным на протяжении всего времени сплайсинга (рис. B и C). Антитело SAP 130 также специфически иммунопреципитирует продукт трансляции кДНК SAP 130 in vitro (данные не показаны). Вместе эти наблюдения показывают, что мы выделили полноразмерную кДНК, кодирующую сплайсосомный белок SAP 130. Антитела SAP 130 не иммунопреципитируют сплайсосому или U2 snRNP из экстрактов сплайсинга, что указывает на то, что эпитоп (14 остатков на С-конце [фиг. .]) недоступен в этих комплексах (данные не показаны).

Антитела SAP 130 обнаруживают одну полосу ~ 130 кДа в ядерном экстракте и сплайсосомных комплексах. (A) Продукт трансляции кДНК SAP 130 in vitro сочетается с белком в ядерном экстракте, который обнаруживается антителами к SAP 130. (B) ³² Р-меченая большая поздняя пре-мРНК аденовируса инкубировали в условиях сплайсинга в течение указанного времени, а затем общую РНК фракционировали на 15% денатурирующем геле.Указаны промежуточные продукты и продукты сращивания. (C) Антитела SAP 130 использовали для зондирования вестерн-блоттинга очищенных сплайсосомных комплексов, собранных в течение указанного времени в условиях сплайсинга. IVT, перевод in vitro.

SAP 130, 145 и 155 существуют в белковых комплексах в ядерных экстрактах и ​​в U2 snRNP.

Как упоминалось во введении, SAP 49, 130, 145 и 155 являются компонентами 17S U2 snRNP и предполагаемыми компонентами важного фактора сплайсинга SF3b (5, 6).Чтобы определить, связаны ли эти белки друг с другом в экстрактах сплайсинга и, таким образом, могут ли они соответствовать комплексу SF3b, мы провели анализы коиммунопреципитации. Используемые антитела были направлены против snRNP-специфического триметильного кэпа, U2 snRNP-специфического белка B «, SAP 130, 145 и 155 и hPrp17 (см. Материалы и методы). Как показано на фиг. A, все сплайсосомные snRNP были иммунопреципитированы антикап-антителами, а один U2 snRNP иммунопреципитировался анти-B «, анти-SAP 145 и анти-SAP 155.Ни один из snRNP не подвергался иммунопреципитации под действием антител против SAP 130 (см. Выше) или отрицательного контроля против hPrp17.

SAP 130, 145 и 155 являются частью белкового комплекса в ядерных экстрактах. (A) Указанные антитела использовали для иммунопреципитации из общих ядерных экстрактов (NE). Тотальную РНК фракционировали на 8% денатурирующем геле. Указаны мяРНК и тРНК. (B) Аликвоту каждого иммунопреципитата фракционировали на SDS – 6% полиакриламидном геле, а затем вестерн-блоты зондировали указанными антителами (α).(C) То же, что и панель B, за исключением того, что ядерный экстракт инкубировали с 2 мкл РНКазы A (10 мг / мл) перед иммунопреципитацией.

Вестерн-анализ показал, что SAP 155, 145 и 130 присутствовали во всех иммунопреципитатах, которые содержали мяРНК U2 (рис. B). Таким образом, как и ожидалось, эти белки являются компонентами мяРНП U2. Чтобы определить, существуют ли эти белки в составе белкового комплекса независимо от мяРНК U2, мы предварительно инкубировали ядерные экстракты в РНКазе А, которая полностью переваривала мяРНК (данные не показаны).Затем проводили иммунопреципитацию с антителами, описанными выше. Как показано на фиг. C, SAP 155, 145 и 130 больше не обнаруживаются в иммунопреципитатах anti-cap или anti-B «. Напротив, все три белка обнаруживаются в иммунопреципитатах anti-SAP 145 и anti-SAP 155. данные показывают, что SAP 130, 145 и 155 существуют в белковом комплексе независимо от мяРНК U2.

Чтобы определить, взаимодействуют ли SAP 130, 145 и 155 друг с другом в дискретном белковом комплексе внутри очищенной частицы мяРНП U2, мы провели иммуноочистку 17S U2 snRNP из ядерных экстрактов с использованием иммобилизованного анти-B «антитела.Белки элюировали из антитела путем инкубации с РНКазой A (фиг. A). Основные белки в элюате соответствуют SF3a и предполагаемым белкам SF3b (см. Ниже; также данные не показаны). Когда элюат использовали для иммунопреципитации с антителами против SAP 155 (фиг. B, дорожки 2 и 6) или против SAP 145 (данные не показаны), SAP 145, 155 и 130 были обнаружены на Вестерн-блоттинге иммунопреципитатов. Эти три белка не были обнаружены при иммунопреципитации элюата антителами к SF3a (рис.B, дорожки 3 и 7) или антитело отрицательного контроля, анти-hPrp17 (фиг. B, дорожки 4 и 8). Таким образом, SAP 130, 145 и 155 присутствуют в специфическом белковом комплексе, который связан с U2 snRNP. Белковый комплекс не связывается с SF3a в отсутствие мяРНК U2.

SAP 130 и 155 взаимодействуют друг с другом в белковом комплексе. (A) Антитела к U2 snRNP протеину B «использовали для иммунопреципитации U2 snRNP из ядерного экстракта. Общие белки элюировали РНКазой A и фракционировали на SDS – 9% полиакриламидном геле.Обильные SAP указаны и были идентифицированы на двумерных гелях и на вестерн-блотах (панель B и данные не показаны). Звездочка обозначает полосу неизвестного происхождения. Однако маловероятно, что он является компонентом SF3b, поскольку он не коиммунопреципитирует с антителами SF3b (данные не показаны). (B) Элюат из панели A использовали для иммунопреципитации с антителами (α), указанными в верхней части каждой дорожки, и вестерн-блоттинг зондировали антителами, указанными слева от каждого блоттинга.(C) То же, что и панель A, за исключением того, что белки элюировали 1 М мочевиной. (D) Элюат мочевины использовали для иммунопреципитации с антителами SAP 155 и SAP 145. Связанные (IP) и несвязанные (FT) белки фракционировали на SDS – 6% полиакриламидном геле, и вестерн-блоты зондировали указанными антителами.

Для дальнейшего определения взаимодействий между белками SF3b внутри U2 snRNP, мы иммуноочистили U2 snRNP с использованием антитела B, а затем элюировали белки 1 М. мочевиной. Этот элюат содержал набор белков, обнаруженных в элюате РНКазы (сравните фиг.А и С). Когда элюат мочевины использовали для иммунопреципитации с анти-SAP 155, мы обнаружили, что SAP 155 и 130 коиммунопреципитируются (фиг. D, дорожка 1). Напротив, SAP 130 и 155 были обнаружены в проточном потоке, когда анти-SAP 145 использовали для иммунопреципитации (фиг. D, дорожки 3 и 4). В соответствии с этими данными, SAP 145 был обнаружен в потоке, когда антитела против SAP 155 использовались для иммунопреципитации (фиг. D, дорожки 5 и 6), тогда как SAP 145 был обнаружен в иммунопреципитате при использовании антител против SAP 145 (фиг.D, дорожки 7 и 8). Мы пришли к выводу, что SAP 130 и 155 более тесно взаимодействуют друг с другом, чем с SAP 145.

Вместе данные, представленные выше, показывают, что SAP 130, 145 и 155 связываются друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий. Эти белки присутствуют в виде белкового комплекса в очищенном snRNP U2, и SAP 130 и 155 более тесно взаимодействуют друг с другом, чем с SAP 145 в этом комплексе. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, является ли взаимодействие между SAP 130 и 155 прямым или косвенным (см. Обсуждение).

scSAP 130 и 155 необходимы для жизнеспособности дрожжей.

Ранее было показано, что гомологи S. cerevisiae SAP 145 / CUS1 (YMR240c) и SAP 49 / HSh59 (YOR319w) важны для дрожжей (15, 27). Эти и другие данные (см. Введение) указывают на то, что дрожжи также содержат комплекс SF3b (15, 27). Чтобы получить дополнительные доказательства того, что это так, мы спросили, содержат ли дрожжи гомолог SAP 130. Наибольшее сходство с геном SAP 130 человека в базе данных было у S.cerevisiae открытая рамка считывания, которую мы обозначили как scSAP 130. В ходе нашего исследования Чен и его коллеги (8) независимо идентифицировали scSAP 130 как белок RSE1 (YML049c) в скрининге чувствительных к температуре мутантов, дефектных в эндоплазматическом ретикулуме. транспорт до Гольджи. Характеристика термочувствительного гена RSE1 показала, что он является фактором сплайсинга (8). Взятые вместе, эти данные показывают, что scSAP 130 / RSE1 является ортологом SAP 130.

SAP 130 также напоминает большую субъединицу гетеродимера человека, называемого специфическим для повреждений ДНК-связывающим белком (DDB), который участвует в ДНК. ремонт (8, 16, 17).Человеческий SAP 130 на 27% идентичен и на 40% подобен scSAP 130 и на 20% идентичен и 29% подобен DDB127 (рис.). Размер трех белков сохранен, а сходство распределено по их длине. SAP 130 дрожжей больше связан с SAP 130 человека, чем с DDB (рис.). Таким образом, вероятно, что дрожжевой SAP 130 является функциональным гомологом человеческого SAP 130, а не DDB. В соответствии с этим выводом Чен с соавторами (8) показали, что мутанты RSE1 имеют нормальную репарацию ДНК после обработки УФ-светом.Используя антитела к DDB, мы обнаружили этот белок в ядерных экстрактах, но не в очищенных сплайсосомах или очищенном комплексе hnRNP H (данные не показаны). Таким образом, DDB, по-видимому, не является обычным сплайсосомным белком. Возможно, что сходство между этими белками связано с общей функцией, которую еще предстоит определить.

Согласование SAP 130 с scSAP 130 и DDB человека. Выравнивание проводили методом Clustal (DNASTAR Inc.). Остатки, которые идентичны в hsSAP 130 и двух других белках, показаны белым на черном.Общая идентичность scSAP 130 и hsDDB с hsSAP 130 составляет 27 и 20% соответственно.

Недавно мы идентифицировали вероятный гомолог SAP 155 (YMR288w) в дрожжах (26). Чтобы определить, являются ли scSAP 130 и 155 важными для жизнеспособности дрожжей, мы сконструировали диплоидные штаммы дрожжей, в которых одна копия генов была нарушена путем замены селектируемым маркером leu2 (22). Саузерн-анализ тотальной геномной ДНК дрожжей подтвердил замену одного аллеля геном Leu2 (рис.A и B [панели I и II]). Тетрадный анализ продемонстрировал разделение нежизнеспособных и жизнеспособных спор 2: 2 (рис. C [панели I и II]), и жизнеспособные споры не росли на чашках без лейцина (рис. D [панели I и II]). Вместе эти данные указывают на то, что гены scSAP 130 и SAP 155 необходимы для жизнеспособности дрожжей.

Гены scSAP 130 и scSAP 155 необходимы для S. cerevisiae . (Панель I) (A) Структура аллелей scSAP 130 и scSAP 130Δ :: LEU .Указаны размеры рестрикционных фрагментов Alw NI и Stu I. Зонд показан под областью, с которой он гибридизуется. (B) Саузерн-анализ общей геномной ДНК нормального диплоидного штамма (WT) и диплоидных штаммов, трансформированных аллелем scSAP 130Δ :: LEU (дорожки 1 и 2). Показаны размеры (в килобазах) маркеров и рестрикционных фрагментов. (C) Тетрадный анализ. Штамм scSAP 130Δ :: LEU спорулировали и рассекали 13 индивидуальных тетрад.(D) Жизнеспособные споры — Leu ^— . Пятнадцать жизнеспособных спор накладывали на чашку без лейцина. Диплоидный штамм был залатан в качестве контроля. (Панель II) (A) Структура аллелей SAP 155 и scSAP 155Δ :: LEU . Указаны размеры рестрикционных фрагментов Stu I и Xho I, используемых для идентификации каждого аллеля. (B) Саузерн-анализ общей геномной ДНК нормального диплоидного штамма дрожжей (wt) и диплоидных штаммов, трансформированных аллелем scSAP 155Δ :: LEU (дорожки с 1 по 5).Показаны размеры (в килобазах) маркеров и рестрикционных фрагментов. Различия в интенсивности полос между дорожками, скорее всего, связаны с разными уровнями ДНК, загруженными в гель. (C) Тетрадный анализ. Штамм scSAP 155Δ :: LEU спорулировали и рассекали 15 индивидуальных тетрад. (D) Жизнеспособные споры — Leu ^— . Восемнадцать жизнеспособных спор помещали на чашку без лейцина. Диплоидный штамм был залатан в качестве контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы сообщаем об выделении кДНК, кодирующей человеческий сплайсосомный белок SAP 130, который завершает клонирование основных белков U2 snRNP у человека.Наши данные показывают, что SAP 130 вместе с SAP 145 и 155 существует в составе белкового комплекса в ядерных экстрактах. У нас нет антител к белку U2 snRNP SAP 49. Однако этот белок очень тесно взаимодействует с SAP 145 (7). Таким образом, простейшая интерпретация данных состоит в том, что SAP 49, 130, 145 и 155 присутствуют в одном и том же белковом комплексе. Хотя функциональные исследования необходимы, чтобы доказать, что этот белковый комплекс соответствует важному фактору сплайсинга SF3b, весьма вероятно, что это так.Это утверждение основано на нескольких наблюдениях. Функциональный snRNP 17S U2 состоит из snRNP 12S U2 вместе с SF3a и SF3b (5). Очищенный 17S U2 snRNP содержит SAP 61, 62 и 114, которые, как известно, являются компонентами SF3a (5, 6). 17S U2 snRNP также содержит SAP 49, 130, 145 и 155 в равной стехиометрии (1). Наши данные показывают, что эти белки присутствуют в составе белкового комплекса в очищенном U2 snRNP. Таким образом, весьма вероятно, что этот белковый комплекс соответствует комплексу SF3b, ассоциированному с U2 snRNP.

Предыдущая работа показала, что очищенный 17S U2 snRNP содержит два дополнительных белка (35 и 92 кДа) (1), но эти белки присутствуют на более низких уровнях, чем другие белки SF3a и SF3b. Действительно, белки с молекулярной массой 35 и 92 кДа не обнаруживаются в очищенном иммуноочисткой U2 snRNP (рис. A и C). Таким образом, еще предстоит определить, являются ли они важными компонентами U2 snRNP или SF3b.

Предыдущие исследования показали, что SAP 145 и 49 взаимодействуют друг с другом посредством прямых белок-белковых взаимодействий (7).Наши данные показывают, что SAP 130 и 155 взаимодействуют друг с другом (прямо или косвенно). Однако неизвестно, как эти два белковых комплекса (SAP 145-SAP 49 и SAP 155-SAP 130) связываются. Одна из возможностей состоит в том, что эти комплексы напрямую взаимодействуют с образованием SF3b. Однако мы не можем исключить альтернативную возможность того, что еще не обнаруженный белок опосредует взаимодействие, или что упомянутый выше белок 35 или 92 кДа задействован. Мы отмечаем, что мы не смогли обнаружить прямые взаимодействия между SAP 155 и 130 или между SAP 155-SAP 130 и любым из других белков U2 snRNP с помощью анализа Дальнего Запада.Таким образом, необходима дальнейшая работа, чтобы определить, как белки SF3b взаимодействуют друг с другом.

Наше исследование также предоставляет новые доказательства того, что аналог SF3b человека присутствует в S. cerevisiae . Предыдущая работа идентифицировала scSAPs 145 и 49 и показала, что они взаимодействуют напрямую и важны для дрожжей (12, 15, 27). Мы показали здесь, что scSAP 130 и 155 также важны для дрожжей, а недавняя работа показала, что scSAP 130 является фактором сплайсинга (8). Исследования на дрожжах показали, что scSAP 145 подавляет летальные мутации в U2 мяРНК вблизи области, которая спаривает основания с сайтом ветвления (30).Аналогично, у млекопитающих все субъединицы SF3a и -b взаимодействуют с 5′-концом U2 мяРНК рядом с областью, которая спаривается с последовательностью точки ветвления (1). Все субъединицы SF3a и -b млекопитающих, за исключением SAP 130, также подвергаются УФ-перекрестному связыванию с пре-мРНК вокруг этого сайта разветвления до обеих каталитических стадий I и II. Одна из функций этих взаимодействий, по-видимому, заключается в том, чтобы прочно закрепить U2 snRNP на пре-мРНК (12). Белки SF3b также являются частью мяРНП U12, который является эквивалентом мяРНП U2 в сплайсосоме человека с незначительным содержанием (28).Эта сплайсосома предназначена для сплайсинга редкого класса интронов (25). Таким образом, высокая степень консервативности SF3b, вместе с его расположением рядом с каталитическим центром сплайсосомы, указывает на то, что этот комплекс, вероятно, будет играть ключевую роль в установлении и / или функционировании каталитического центра сплайсосомы на обоих этапах реакция сращивания. Доступность рекомбинантных субъединиц SF3b как у дрожжей, так и у млекопитающих теперь должна позволить напрямую проверить эти возможности.

ССЫЛКИ

9a. Дас Р. и Р. Рид. Неопубликованные данные.

TotalSeq ™ -A0465 Anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody, Nuclear Pore Complex Proteins, MAb414

Визуализация сложных белков — CSIRO

Вызов

Повышение доступности сложных данных о белках

Белки — это строительные блоки жизни, но они представляют собой сложные структуры, состоящие из тысяч молекул.Исследователям нужен способ визуализировать точные способы соединения белков, чтобы они могли лучше понять функции, которые они играют в нашем организме.

Наш ответ

Aquaria: инструмент для визуализации белков

Мы создали новый веб-инструмент под названием Aquaria, который может создавать беспрецедентные трехмерные представления белковых структур. Инструмент 3D-визуализации CSIRO, Aquaria, помогает составить карту темного протеома, используя информацию из банка данных белков.

Aquaria использует данные из Protein Data Bank, онлайн-ресурса, который содержит более 100 000 структур белков, содержащих множество деталей о молекулярных процессах жизни. Инструмент позволяет добавлять дополнительные уровни информации (например, генетические различия) к базовой структуре белка и делает эти сложные данные доступными в быстром и простом в использовании интерфейсе, который визуализируется в полностью трехмерной среде.

В 2020 году платформа была обновлена ​​и теперь включает базу данных из почти 1000 моделей структуры белков вируса SARS-COVID-19, что позволяет ученым и исследователям визуализировать различные компоненты вируса и понимать, как они взаимодействуют с человеческими белками, чтобы получить доступ к ним. человеческая система и развитие инфекции.

Чтобы сделать этот большой и сложный набор данных доступным и удобным для исследователей, команда разработала индивидуальную стратегию компоновки для визуальной организации трехмерных моделей путем сопоставления их с вирусным геномом. Затем эти модели можно раскрасить, чтобы показать особенности последовательности, такие как однонуклеотидные полиморфизмы и посттрансляционные модификации.

Результаты

Оптимизированная наука о белке

В свободном и публичном доступе Аквария может помочь ученым, таким как экологи, диетологи, специалисты по биобезопасности и медицинские исследователи, упростить процесс открытий и получить новое представление о структурах белков.Трехмерная визуализация последовательностей белка-шипа COVID-19 на платформе Aquaria. Пользователь сосредотачивается на последовательности rep K3929 из структуры 6yyt-C K70, чтобы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе инфекции.

Обновление COVID-19 2020 обеспечивает немедленный и исчерпывающий визуальный обзор того, что известно — и неизвестно — о трехмерной структуре вирусного протеома COVID, тем самым помогая направлять будущие исследования.

Aquaria о COVID находится в свободном доступе в Интернете, а в приведенном ниже видео объясняется, как исследователи могут использовать этот ресурс.

Aquaria была разработана в сотрудничестве с Техническим университетом Мюнхена и размещена при поддержке гранта Amazon Web Services.

В видео доступны субтитры / скрытые титры.

• Вид стенограмма
• Копировать вставлять код

Поделитесь и вставьте это видео

Ссылка

Код для вставки

белковый комплекс, который формирует и защищает теломеры человека

Абстрактные

Добавленные теломеразой, массивы повторов TTAGGG определяют концы хромосом человека.Комплекс, образованный шестью теломер-специфичными белки связываются с этой последовательностью и защищают концы хромосом. По аналогии с другими хромосомными белковыми комплексами, такими как как конденсин и когезин, я буду называть этот комплекс шелтерином. Три субъединицы шелтерина, TRF1, TRF2 и POT1 напрямую распознавать повторы TTAGGG. Они связаны между собой тремя дополнительными белками шелтерина, TIN2, TPP1 и Rap1, образуя комплекс, позволяющий клеткам отличать теломеры от участков повреждения ДНК.Без защитной активности шелтерина, теломеры больше не скрыты от наблюдения за повреждениями ДНК, а концы хромосом неправильно обрабатываются путем восстановления ДНК пути. Как укрытие предотвращает эти события? Текущие данные утверждают, что укрытие не является статическим структурным компонентом. теломер. Вместо этого шелтерин превращается в белковый комплекс с активностью ремоделирования ДНК, который действует вместе с несколько связанных факторов репарации ДНК для изменения структуры теломерной ДНК, тем самым защищая концы хромосом.

Шесть субъединиц шелтерина: TRF1, TRF2, TIN2, Rap1, TPP1 и POT1

Компоненты шелтерина постепенно выявлялись в течение последних 10 лет (рис. 1). Первый теломерный белок млекопитающих, теперь называемый TRF1, был выделен на основании его специфичности in vitro в отношении двухцепочечных TTAGGG-повторы, типичные для теломер позвоночных (Zhong et al.1992; Чонг и др. 1995). TRF2 был идентифицирован как паралог TRF1 в базе данных (Bilaud et al. 1997; Broccoli et al. 1997), а TIN2 и Rap1 были обнаружены в двухгибридных скринингах с TRF1 и TRF2, соответственно (Kim et al. 1999; Li et al. 2000). TPP1 (ранее называвшийся TINT1 [Houghtaling et al. 2004], PTOP [Liu et al. 2004b] и PIP1 [Ye et al. 2004b]) недавно появился в результате поисков взаимодействующих с TIN2 белков. Был идентифицирован наиболее консервативный компонент шелтерина, POT1. основан на гомологии последовательностей с факторами связывания концов теломер у одноклеточных эукариот (Baumann and Cech 2001).Масс-спектрометрия факторов, связанных с шелтерином, не дала дополнительных компонентов, что позволяет предположить, что подсчет его субъединицы близятся к завершению (Liu et al. 2004b; O’Connor et al. 2004; Ye et al. 2004a).

Все шесть субъединиц shelterin могут быть обнаружены в едином комплексе во фракционированных ядерных экстрактах (Liu et al. 2004a; Ye et al. 2004a). Стержнем шелтерина является TIN2, который связывает TPP1 / POT1 с TRF1 и TRF2. TIN2 также соединяет TRF1 с TRF2 и эту ссылку способствует стабилизации TRF2 на теломерах (Liu et al.2004a; Ye et al. 2004а). Подкомплексы шелтерина, содержащие TRF1 или TRF2 в ассоциации с другими субъединицами, также могут быть выделены. Несмотря на то что эти субкомплексы могут быть артефактом изоляции солевой чувствительности связи TIN2-TRF2 (Ye et al. 2004a), эксперименты по фотообесцвечиванию также предполагают, что некоторые из TRF1 и TRF2 находятся в отдельных комплексах (Mattern et al. 2004). Необходима дальнейшая работа, чтобы установить количество единиц шелтерина, связанных на теломер, стехиометрию шелтерина. субъединиц и значение подкомплексов shelterin.

Не все белки на концах хромосом являются частью шелтерина. Несколько критериев отличают компоненты укрытия от белки, не относящиеся к шелтерину, наблюдаемые на теломерах (таблица 1). Шелтерин в изобилии присутствует на концах хромосом, но не накапливается где-либо еще; он присутствует на теломерах по всей клетке цикл, и его известная функция ограничена теломерами. Белки, не относящиеся к шелтерину, на концах хромосом не могут встретиться с двумя или тремя этих критериев, но они могут играть важную роль на теломерах.

Примеры белков, не относящихся к шелтерину, на теломерах человека

Shelterin обладает исключительной специфичностью в отношении теломерных повторов TTAGGG из-за наличия множественных складок распознавания TTAGGG. в комплексе. Каждый из ДНК-связывающих доменов SANT / Myb TRF1 и TRF2 связывает последовательность 5′-YTAGGGTTR-3 ‘в дуплексной ДНК, демонстрируя очень низкую толерантность к изменениям на одной базе (рис.1; Bianchi et al. 1999; Court et al. 2005; Hanaoka et al. 2005). Каждый TRF1 и TRF2 образуют гомодимеры и олигомеры более высокого порядка, поэтому совокупность нескольких DBD, которые они приносят в комплекс может просматривать большую последовательность ДНК. POT1 также обладает высокой специфичностью к последовательности, связывая одноцепочечные сайты 5 ‘- (T) TAGGGT TAG-3′ как на 3’-конце, так и во внутренних положениях (Fig. 1; Lei et al. 2004; Loayza et al. 2004). Поскольку эти три субъединицы шелтерина связаны посредством белок-белковых взаимодействий, шелтерин обладает способностью к распознают теломерные ДНК по крайней мере с пятью ДНК-связывающими доменами (по два в TRF1 и TRF2 и один в POT1).Как следствие, shelterin обладает уникальной способностью отличать теломеры от всех других концов ДНК.

Шелтерин. ( A ) Шесть известных субъединиц шелтерина, их доменная структура, белковые взаимодействия и сайты связывания ДНК. POT1 может связывать его место как на 3′-конце, так и во внутреннем положении (как показано).Не показано, сообщается о взаимодействии между POT1 и TRF2. Харриса и его коллег (Янг и др., 2005). ( B ) Схема шелтерина на теломерной ДНК. Для простоты POT1 показан только как связывающий сайт, ближайший к теломерному дуплексу. ДНК, хотя она также может связываться с 3′-концом. ( C ) Возможные комплексы и субкомплексы шелтерина на теломерах. (I) Шести субъединичный шелтерин с POT1, не связанным с оцДНК. (II) Как и в I, с POT1, взаимодействующим с TRF2.(III) Комплекс TRF2 / Rap1 / TIN2 / TPP1 / POT1. (IV) Комплекс TRF1 / TIN2 / TPP1 / POT1. (V) Шестисубъединичный шелтерин с POT1, связанным с одноцепочечной теломерной ДНК. Гибкий линкер между DBD POT1 и остальная часть комплекса укрытия спекулятивна. Нуклеосомы на этой и всех других схемах не показаны. теломерный хроматин.

Комплексы, связанные с шелтерином, также обнаруживаются на теломерах у других эукариот.POT1-подобные белки присутствуют почти во всех eukaryotes (de Lange, 2001), TRF1 / 2-подобный белок обнаружен в делящихся дрожжах и в трипаносомах (Cooper et al. 1998; Sfeir et al. 2005), а Rap1 присутствует в грибах (Shore 1994; Chikashige and Hiraoka 2001; Канох и Исикава 2001). Напротив, субъединицы шелтерина TIN2 и TPP1 пока обнаружены только у позвоночных; их появление может иметь совпало с усилением второго TRF-подобного гена. Таким образом, шелтерин, по-видимому, образуется из дуплексного теломерного ДНК-связывания. белок, белок, связывающий одноцепочечную ДНК (оцДНК), и Rap1.Единственным исключением из этого правила может быть Saccharomyces cerevisiae , который лишен TRF-подобного белка и использует вместо этого сильно дивергированный ортолог Rap1, который связывает двухцепочечную теломерную ДНК. И наоборот, теломеры дрожжей содержат Rif1, консервативный белок, который не играет известной роли в теломерах млекопитающих и вместо этого функционирует. в контрольной точке внутри S-фазы (Hardy et al. 1992; Silverman et al. 2004; Xu and Blackburn 2004). По этим причинам экстраполяция почкующихся дрожжей на млекопитающих может быть обманчивой, если речь идет о теломерах.

Shelterin формирует теломеры

Главный ключ к разгадке того, как шелтерин защищает теломеры, связан с наблюдениями, что этот комплекс влияет на структуру теломерная ДНК. Задокументированы по крайней мере три отдельных эффекта шелтерина. Шелтерин определяет структуру конец теломеры, он участвует в образовании t-петель и контролирует синтез теломерной ДНК теломеразой. (Инжир.2).

Считается, что решающим способом, которым shelterin влияет на структуру теломерной ДНК, является формирование t-петель (Fig. 2; Griffith et al. 1999; Stansel et al. 2001). Теломеры имеют длинный одноцепочечный массив повторов TTAGGG на 3′-конце (Makarov et al. 1997). Было высказано предположение, что этот выступ вторгается в двухцепочечную теломерную ДНК, спаривая основание с С-цепью и смещая G-прядь. Инвазия нити происходит на расстоянии от физического конца теломер и, следовательно, приводит к большая дуплексная структура лариата, т-образная петля (рис.2). Ключевой особенностью Т-образных петель является то, что конец теломеры заправлен внутрь. Размер части круга, вероятно, не имеет значения. поскольку t-петли с очень большими (25 т.п.н.) и очень маленькими (1 т.п.н.) петлями наблюдались в клетках человека.

Т-петли были впервые идентифицированы с помощью электронной микроскопии очищенных рестрикционных теломерных фрагментов из клеток человека и мыши. (Гриффит и др., 1999). Чтобы наблюдать t-петли в безбелковой ДНК, необходимо ввести межцепочечные сшивки с псораленом и УФ.Без поперечных связей или белков, которые стабилизируют инвазию цепи, миграция ветвей может их диссоциировать. Лариаты имеют теперь также наблюдались в теломерном хроматине, который был изолирован без использования псоралена, и в этом анализе нуклеосомы было обнаружено, что они присутствуют на петле, а также на соседней хвостовой ДНК (Nikitina and Woodcock 2004).

In vitro компоненты шелтерина обладают активностями ремоделирования ДНК, которые имеют отношение к образованию t-петли.TRF2 может реконструировать искусственный теломерный субстрат в петли (Griffith et al. 1999; Stansel et al. 2001). Эти петли стабилизируются за счет сшивания псораленом, что указывает на событие инвазии цепи. Образование t-петли очищенным TRF2 вызывает недоумение, поскольку для реакции не требуется АТФ, а TRF2 лишен узнаваемого геликазного домена. Реакции нет эффективен, однако, и вполне вероятно, что in vivo TRF2 требует помощи других факторов для генерации t-петель.Как партнеры приюта с несколькими белками, участвующими в рекомбинационной репарации (Таблица 1), предполагается, что эти факторы могут вносить вклад в образование и поддержание t-петли (de Lange and Petrini 2000).

TRF1 также обладает активностью ремоделирования ДНК. In vitro, TRF1 может образовывать петли, изгибать и спаривать массивы теломерных повторов, действия, которые могут стимулируют сворачивание теломер in vivo (Bianchi et al. 1997, 1999; Griffith et al.1998) и TIN2 могут усилить некоторые архитектурные эффекты TRF1 (Kim et al. 2003). Гимнастика ДНК TRF1, вероятно, связана с его необычайно гибким способом связывания. Два домена SANT / Myb в TRF1 димер находится на конце гибких участков, что объясняет, как они могут задействовать свои полусайты 5′-YTAGGGTTR-3 ‘в разных ориентации и на переменном расстоянии. Теперь, когда другие компоненты в значительной степени известны, важно дополнительно определить как шелтерин ремоделирует теломерную ДНК in vitro и чтобы проверить вклад субъединиц шелтерина в формирование Т-петли и поддержание in vivo.

Т-петли являются консервативным аспектом структуры теломер, и предполагалось, что они защищают теломеры и регулируют теломеразу. Однако многое в них еще предстоит выяснить. Точная структура у основания t-петли неизвестна, и роль TRF1 и TRF2 в образовании t-петли (пока) не тестировался in vivo. Также неясно, являются ли t-петли единственными (или даже преобладающее) состояние защищенных концов хромосом.Хотя репликационная вилка должна разъединять вторжение цепи, неизвестно, приводит ли репликация ДНК к временному «открытому» состоянию. Ответить на эти вопросы непросто, потому что Обнаружение t-петель в настоящее время ограничено требованиями ЭМ анализа.

Шелтерин также влияет на структуру 3′-конца. Когда либо TRF2, либо POT1 ингибируются, общее количество одноцепочечных Количество повторов TTAGGG уменьшается на 30-50% (van Steensel et al.1998; Hockemeyer et al. 2005). В случае ингибирования TRF2 потеря одноцепочечной ДНК TTAGGG включает ERCC1 / XPF, эндонуклеазу лоскута, которая может расщепляются рядом с 3′-выступом внутри соседней дуплексной ДНК (Zhu et al. 2003). Участие ERCC1 / XPF предсказывает, что некоторые теломеры теряют всю свою оцДНК, когда TRF2 ингибируется. Адресовать В этом случае необходимо будет применять методы измерения изменений длины выступов, а не потерь. общего однонитевого повтора сигнала TTAGGG.Защита 3 ‘навеса с помощью укрытия могла быть косвенным эффектом. образования т-петель. Например, инвазии цепи 3′-выступа может быть достаточно для защиты оцДНК от расщепление ERCC1 / XPF и другими нуклеазами 3’-лоскута. Кроме того, связывание POT1 с оцДНК может блокировать нуклеолитическую деградацию. (Hockemeyer et al. 2005; Lei et al. 2005; Yang et al. 2005).

Как создается 3 ‘выступ? Для модификации конца теломеры, генерируемого ведущей цепью, может потребоваться нуклеазная активность. Синтез ДНК, как продукта ее репликации, может иметь тупой конец.Хотя вовлеченная нуклеаза еще не идентифицирована, Недавние данные показывают, что нуклеолитический процессинг 5′-цепи контролируется shelterin. В качестве примера Sfeir et al. al. (2005) смогли определить последовательность на 3′- и 5’-концах хромосом человека. Они обнаружили, что в то время как конец 3 ‘больше или менее случайно расположенный внутри повторов TTAGGG, 5’-конец является удивительно точным (рис. 2A). Почти все хромосомы человека имеют последовательность AATC CCAATC-5 ‘, что указывает на то, что нуклеолитический процессинг регулируется.Субъединица шелтерина POT1 участвует в этом контроле. Когда POT1 запрещен, 5’-концы теряют свою однородность и теперь заканчиваются. с AA, AT, TC, CC, CA или AT (Hockemeyer et al. 2005).

Простая модель того, как POT1 контролирует 5′-концевую последовательность, предложена его особенностями связывания с ДНК (Fig. 2). В естественной структуре теломер первый сайт POT1 в 3′-выступе находится всего в 2 нуклеотидах (нт) от конца дуплексная теломерная ДНК.Эта конфигурация является предпочтительным связывающим субстратом для POT1 in vitro (F. Ishikawa, личн. Комм .; D. Hockemeyer и T. de Lange, неопубликовано), предполагая, что POT1 взаимодействует с дуплексным концом теломеры. Итак, однажды эта терминальная структура была создана 5′-экзонуклеазой, POT1, связанной вблизи перехода двухцепочечная-одноцепочечная может просто перекрыть 5′-конец от дальнейшей обработки. Очевидно, прикрепление POT1 к соседней дуплексной теломерной ДНК через другие белки шелтерина может дополнительно усилить образование крышки POT1 на 5′-конце.

Как шелтерин может формировать теломеры. ( A ) Образование конца теломер. После репликации концы хромосом требуют обработки для получения длинных 3 ‘ свес. Участвующая нуклеаза неизвестна. Результирующий 5 ‘конец всегда имеет последовательность ATC-5’. Когда POT1 запрещен, эта точность потеряна.Как POT1 определяет последовательность 5′-конца, неизвестно, но результирующая структура терминала является предпочтительным сайтом связывания для POT1 in vitro. ( B ) Т-образная петля. 3′-выступ вторгается в соседний дуплексный массив теломерных повторов, образуя D-петлю. Размер петли варьируется. ( C ) Спекулятивная модель образования t-петли шелтерином. TRF1 обладает способностью изгибать, образовывать петли и спаривать теломерные ДНК in vitro. и потенциально может свернуть теломер.Компонент шелтерина TRF2 может опосредовать образование t-петли in vitro. ( D ) Модель для регулирования длины теломер с помощью шелтерина. Поскольку t-петля вряд ли будет субстратом для теломеразы, теломеры показаны только в «открытом» состоянии (либо в линейной, либо в более компактной сложенной конфигурации), которые могут быть сгенерированы во время фазы S. Предполагается, что присутствие большего количества шелтерина на более длинных теломерах увеличивает нагрузку POT1 на теломеры. свес.Предполагается, что POT1, связанный с 3′-концом, блокирует действие теломеразы. Справа показаны короткие теломеры с меньшим укрытием. Из-за уменьшенного количества укрытия вероятность того, что POT1 загрузится на выступ уменьшается, что увеличивает вероятность того, что теломераза может удлинить теломер. Принудительное увеличение POT1 на теломеры (за счет сверхэкспрессии шелтерина) увеличивают вероятность того, что теломераза будет заблокирована, что приведет к укорочению теломер.Ингибирование шелтерина или мутанта POT1, который не связывает оцДНК, снижает вероятность того, что теломераза будет заблокирована, что приводит к удлинению теломер.

Третий способ, которым shelterin формирует теломеры, заключается в его влиянии на поддержание длины теломер (Fig. 2D). У дрожжей и млекопитающих теломеры поддерживаются в заданном диапазоне размеров с помощью петли отрицательной обратной связи, которая блокирует их действие. теломеразы на концах отдельных хромосом (см. обзор Smogorzewska and de Lange 2004).Когда данная теломера слишком длинная, этот механизм действия цис- ограничивает путь теломеразы. На слишком короткой теломере контроль ослабляется, так что теломераза может восстановить его длину. Шелтерин — ключевой компонент этого пути, представляющий цис--действующий ингибитор. В модели ингибирование теломеразы — это случайный процесс, на который влияет общее количество шелтерина. на теломере. Поскольку количество шелтерина, связанного с теломером, примерно пропорционально длине повтора TTAGGG. array, предполагается, что более длинные теломеры имеют большую вероятность ингибирования теломеразы.Этот контроль теломеразы требует оцДНК-связывающая активность компонента шелтерина POT1 (Loayza and de Lange 2003; Liu et al. 2004b). Мутантная форма POT1, которая не связывает оцДНК, приводит к полной потере контроля длины теломер. В этом случае теломераза образует очень длинные теломеры, которые утратили способность ингибировать фермент, хотя их укрытие постоянно увеличивается (Лоайза и де Ланге, 2003). Легко представить, как активность связывания оцДНК POT1 может блокировать доступ теломеразы к 3′-теломерам. terminus, и in vitro отмечена такая ингибирующая активность (Kelleher et al.2005; Lei et al. 2005). Основываясь на этих данных, текущая модель состоит в том, что количество шелтерина на теломере определяет вероятность того, что его Компонент POT1 может позиционировать себя на 3′-конце и блокировать теломеразу (Fig. 2D).

Ингибирование шелтерина активирует канонический ответ на повреждение ДНК

Долгое время предполагалось, что теломеры «спрятаны» от пути, предупреждающего клетки о повреждении ДНК.Доказательства того, что дисфункциональный человеческие теломеры действительно активируют путь ответа на повреждение ДНК, впервые выявленный в экспериментах, в которых субъединица шелтерина TRF2 ингибируется доминантно-отрицательным аллелем (TRF2 ^ΔBΔM ), который гетеродимеризуется с эндогенным TRF2, блокируя его связывание с ДНК (van Steensel et al. 1998; для обзора см. De Lange 2002). Потеря TRF2 активирует путь киназы ATM, приводя к усилению регуляции p53 и задержке G1 / S, опосредованной p21 (Karlseder et al.1999). Недавние эксперименты на мышиной модели нокаута TRF2 подтвердили, что потеря TRF2 приводит к активации ATM и p53-зависимой остановка клеточного цикла (Celli and de Lange 2005). Супрессор опухолей р53 также участвует в ответе на укорочение теломер. Например, мыши с дефицитом р53 лучше переносят последствия укорочения теломер у более поздних поколений мышей с дефицитом теломеразы (Chin et al. 1999).

Дисфункция теломер может привести либо к апоптозу, либо к старению.Результат, по-видимому, продиктован типом ячейки; фибробласты претерпевают старение после ингибирования TRF2 (и лечения агентами, повреждающими ДНК), тогда как апоптоз является более заметным исходом в лимфоцитах и ​​эпителиальных клетках (Karlseder et al. 1999). Активация пути ATM не требует вторичного повреждения ДНК, которое может возникнуть, когда клетки с дицентриком хромосомы проходят митоз. Скорее, повреждение самой теломеры активирует путь киназы ATM. (Инжир.3).

Мнение о том, что снятие защиты с теломер активирует ответ на повреждение ДНК, было подтверждено экспериментами, в которых повреждение ДНК факторы ответа наблюдались на теломерах (d’Adda di Fagagna et al. 2003; Takai et al. 2003). После ингибирования TRF2 или когда теломеры становятся критически короткими, 53BP1, γ-h3AX, комплекс Mre11, Rif1 и фосфорилированный форма ATM, ATM S1981-P, накапливаются на концах хромосом.К цитологическим структурам, образованным факторами повреждения ДНК, относятся как очаги, индуцированные дисфункцией теломер (TIFs) (Takai et al. 2003). TIF также образуются, когда ингибируются другие компоненты шелтерина (например, TIN2 или POT1) (Kim et al. 2004; Hockemeyer et al. 2005). ATM-дефицитные (A-T) клетки имеют пониженную способность образовывать TIF, и ответ дополнительно снижается при обработке кофеин, ингибитор ATM, ATR и других PI3-подобных киназ (PIKK) (Takai et al.2003). Основываясь на этих находках, кажется вероятным, что и ATM, и второй PIKK ответственны за реакцию на повреждение теломер. ATR был задействован как второй преобразователь в экспериментах на клетках с укороченными теломерами (Herbig et al. 2004). Одновременная репрессия ATM и ATR может обратить некоторые фенотипы теломер-направленного старения (d’Adda di Fagagna et al. 2003). В совокупности данные утверждают, что дисфункциональные теломеры обнаруживаются с помощью канонической реакции на повреждение ДНК.Пока что есть Нет необходимости задействовать «контрольную точку» теломер или конкретные пути передачи сигналов, чтобы объяснить, как клетки реагируют на потерю теломер. функция.

Многие аспекты реакции на повреждение теломер еще предстоит проработать. Например, неизвестно, какие датчики и медиаторы (например, комплекс Mre11, комплекс 9-1-1, комплекс Rad17, RPA, 53BP1, MDC1) действуют в повреждении теломер пути, относительный вклад ATM и ATR (и, возможно, других PIKK) не изучен, а природа теломер сигнал (ы) повреждения не установлен.

Ответ на повреждение ДНК на дисфункциональных теломерах. Теломеры теряют защиту после ингибирования субъединиц шелтерина (например, TRF2, TIN2 или POT1) или истирание теломер. Молекулярная природа незащищенного состояния неизвестна. Теломеры могут стать незащищенными с явным изменением структуры ДНК или без такового (последняя изображена).При потере защиты теломеры становятся связанные с факторами ответа на повреждение ДНК, образующими TIF, показанные IF-изображением окрашивания 53BP1 на теломерах. Теломер Повреждение активирует киназу ATM, что приводит к p53-зависимой остановке G1 / S и может вызывать апоптоз или старение. Считается, что в отсутствие ATM киназа ATR вызывает остановку клеточного цикла. Дисфункция теломер также индуцирует p16 (Jacobs and de Lange 2004), который может способствовать ингибированию пролиферации в клетках человека с дефицитом p53.В клетках мыши индуцируется p16, но его индукция не влияет на переход в S-фазу (Smogorzewska and de Lange, 2002).

Как shelterin предотвращает сигнал о повреждении теломер?

Одна из рассматриваемых возможностей заключается в том, что реакция на повреждение ДНК активируется при потере 3′-выступа.В соглашении с этой моделью ингибирование shelterin действительно приводит к потере (части) 3′-выступающей ДНК из теломер млекопитающих. Однако недавние данные показывают, что эта обработка не требуется для ответа на повреждение ДНК. В ДНК-лигазе IV-дефицитной В клетках мыши ингибирование TRF2 активирует киназу ATM и превращает теломеры в очаги повреждения ДНК, даже если теломерные свес остается нетронутым (Celli, de Lange, 2005).

Если защиты от выступа недостаточно для предотвращения реакции на повреждение теломер, у шелтерина должен быть хотя бы один другой механизм. для предотвращения обнаружения теломер с помощью наблюдения за повреждениями ДНК. Интересная возможность состоит в том, что t-петли создают нуклеосомную организация, которая скрывает концы хромосом от наблюдения за повреждениями ДНК. Последние работы по ATM, 53BP1 и делящимся дрожжам Crb2 предположил, что ключевым событием в реакции на повреждение ДНК является изменение нуклеосомной организации в месте Повреждение ДНК (Баккенист и Кастан, 2003; Huyen et al.2004; Sanders et al. 2004 г.). В случае 53BP1 критическое взаимодействие происходит с диметилированной формой K79 гистона h4 (Huyen et al. 2004). Этот остаток конститутивно метилирован, но может быть недоступен в интактном хроматине. Предполагается, что когда ДНК происходит разрыв, нуклеосомная организация изменяется, обнажая сайт связывания для 53BP1. Имея в виду этот механизм, Легко увидеть, как t-петли могут скрыть важную поверхность нуклеосом от наблюдения за повреждениями ДНК.Когда теломер в В открытом состоянии последняя нуклеосома может иметь открытый сайт взаимодействия 53BP1. В t-петле эта предпоследняя нуклеосома могут быть расположены так, чтобы h4-K79 и другие сигнальные остатки были скрыты от других нуклеосом. Однако 53БП1 не единственный (или главный) фактор, который определяет повреждение ДНК. Сигнал для других датчиков, таких как комплекс Мрэ11 и 9-1-1 / RFC, не разработаны.Как только их механизмы восприятия станут известны, можно будет приступить к контр-тактике укрытия. И наоборот, лучшее понимание шелтерина может дать подсказку о том, как реакция на повреждение ДНК обнаруживает повреждение. на теломерах и в других местах.

Ингибитор ATM в шелтерине?

Неожиданно было обнаружено, что субъединица TRF2 шелтерина слабо взаимодействует с киназой ATM (Karlseder et al.2004), хотя ATM не обнаруживается на теломерах. TRF2 связывается с областью в ATM, которая содержит Ser 1981, остаток, который аутофосфорилируется в ответ на повреждение ДНК (Bakkenist and Kastan 2003). Аутофосфорилирование ATM рассматривается как ключевой шаг в активации ATM, что приводит к диссоциации киназы. димеры, которые считаются менее активными, чем мономеры. В исследованиях сверхэкспрессии TRF2 обладает способностью ингибировать S1981 фосфорилирование, и когда TRF2 в большом количестве в нуклеоплазме, он оказывает подавляющее действие на сигнальный путь ATM (Karlseder et al.2004 г.). Предложение о том, что шелтерин может содержать ингибитор АТМ, является привлекательным, потому что шелтерин в изобилии присутствует на теломерах, но не в большом количестве. в другом месте, чтобы он мог ограничивать ATM на концах хромосомы, не влияя при этом на реакцию на повреждение ДНК в другом месте геном.

Как избежать ненадлежащего ремонта

Как и в случае с основной массой ДНК, теломерная ДНК требует ремонта.Базовая эксцизионная репарация, эксцизионная репарация нуклеотидов и несоответствие Предполагается, что репарация используется для поддержания повторяющейся последовательности TTAGGG. Но некоторые формы ремонта могут иметь катастрофические последствия. (Рис.4, 5). Негомологичное соединение концов (NHEJ) двух теломер создает круговую или дицентрическую хромосому. Гомологичная рекомбинация (HR) между теломерами может генерировать аберрантную длину теломер и рекомбинацию теломер с интерстициальными теломерными теломерами. последовательность может привести к делециям, инверсиям и транслокациям.Кроме того, гомологичная рекомбинация угрожает целостности t-образной петли, потенциально прерывая петлю. Новая область исследования сосредоточена на установлении того, как shelterin предотвращает эти события.

Предполагаемая роль шелтерина в защите теломер от NHEJ и потери нависания. Предполагается, что теломеры устойчивы к NHEJ из-за их конфигурации t-петли, которая блокирует доступ комплекса NHEJ к концу хромосомы.При потере Предполагается, что t-петли дестабилизируются (или не образуются), что позволяет задействовать путь NHEJ. До лигирование концов хромосом ДНК-лигазой IV, предполагается, что комплекс ДНК-ПК образует синаптическую структуру, которая активирует и / или набирает ERCC1 / XPF. Эта нуклеаза участвует в расщеплении 3′-выступа. Концевое соединение теломер приводит к образованию дицентриков. хромосомы (пример показан внизу ).После репликации ДНК могут происходить слияния сестринских и несестринских теломер. NHEJ также может возникать до репликации ДНК, приводя к слиянию хромосомного типа в метафазе (не показано).

Предотвращение NHEJ и обработки выступов

Концевые слияния хромосом являются заметным маркером дисфункции теломер.Они возникают, когда теломеры стали слишком короткими и когда TRF2 подавлен (см. обзор de Lange 2002). Эти слияния представляют собой ковалентные связи между C-цепью одного теломера и G-цепью др. (Smogorzewska et al. 2002). Они могут возникать до и после репликации ДНК и обычно затрагивают концы двух разных хромосом. Результирующий дицентрические хромосомы могут прикрепляться к обоим полюсам веретена и приводить к проблеме сегрегации хромосом в анафазе.Следовательно, в анафазных клетках с дицентрическими хромосомами наблюдаются характерные хроматиновые мостики.

Контроль ЧСС t-петли шелтерином. Модель, показывающая, как поздние шаги в HR могут привести к внезапной потере теломерной ДНК. Миграция филиала в основании t-петли может генерировать один или два HJ. Разрешение двойного HJ в указанном направлении приведет к сокращению теломер и кольцевая теломерная ДНК.HR T-петли наблюдается, когда мутант TRF2 с укороченным N-концом, лишенный основных домен чрезмерно выражен. Круговой продукт HR t-петли также наблюдается в клетках ALT и на очень низких уровнях в невозмущенных клетках. нормальные клетки человека. В клетках ALT круги могут обеспечивать механизм поддержания теломер посредством репликации катящегося круга.

Для слияния поврежденных теломер необходимы те же факторы, что и для нормального NHEJ (рис.4; Smogorzewska et al. 2002; Челли и де Ланж 2005; Дж. Челли, Э. Денки и Т. де Ланге, неопубликовано). Клетки, лишенные ДНК-лигазы IV или Ku70, обладают сниженной способностью в 10-50 раз. для слияния теломер после ингибирования укрытия. Предполагается, что другие белки NHEJ, DNA-PKcs, XRCC4 и Ku80, участвуют в также, но не были протестированы. Реакция соединения концов теломер представляет собой необычный тип NHEJ, поскольку теломеры имеют длинный 3 ′ свес.Как упоминалось выше, фактор репарации эксцизией нуклеотидов ERCC1 / XPF, эндонуклеаза со специфичностью к 3 ‘выступы были вовлечены в удаление выступов (Zhu et al. 2003). Как и в случае с другими реакциями обрезки концов, эта стадия зависит от механизма NHEJ (Celli and de Lange 2005). Как механизм NHEJ активирует (или рекрутирует) ERCC1 / XPF, пока не известно.

Один из способов, с помощью которого шелтерин может защищать концы хромосом от NHEJ, заключается в стимулировании образования t-петли.Без доступного В конце концов, механизм NHEJ не сможет сформировать синаптический комплекс, который, как считается, необходим для обработки и лигирования. концов. Блокируя доступ, t-петли также защищают теломерный выступ от удаления нуклеазами, которые зависят от на оборудовании NHEJ (рис. 4).

Репрессия HR

Недавно стало ясно, что теломеры также нуждаются в защите от несоответствующей гомологичной рекомбинации.Там это три типа HR, которые имеют пагубные последствия на концах хромосом. Первый — гомологичная рекомбинация между сестринскими теломеры, называемые теломерным сестринским хроматидным обменом (T-SCE). T-SCE могут быть вредными для клеток, если обмен последовательности не равны по длине. Теломеры одной сестры могут удлиняться за счет другой. Обмен между сестринские теломеры могут быть обнаружены с помощью хромосомно-ориентированной флуоресцентной гибридизации in situ (CO-FISH) (для обзора см. Bailey et al.2004 г.). В методе CO-FISH вновь синтезированная ДНК разрушается, а оставшиеся родительские цепи обнаруживаются одноцепочечным методом. зонды. На теломерах одна родительская цепь состоит из 5′-TTAGGG-3 ‘повторов, а другая имеет только 5′-CCCTAA-3’ последовательности, позволяя различать две нити в метафазных хромосомах. После полуконсервативной репликации каждая хроматида в метафазной хромосоме будет иметь сигнал G-цепи на одном конце и сигнал C-цепи на другом.Отображение конца хроматиды сигналы как C-цепи, так и G-цепи указывают на то, что на этом конце произошло событие T-SCE. В нормальных клетках мыши и человека T-SCE встречается нечасто, но клетки ALT, которые поддерживают свои теломеры посредством пути рекомбинации, очень часто имеют T-SCE. (Bailey et al. 2004; Bechter et al. 2004; Londono-Vallejo et al. 2004). Разница может заключаться в том, что T-SCE в норме репрессированы и что клетки ALT ослабили свой контроль над HR на теломерах, позволяя им сохранять свои теломеры и, следовательно, выживать (см. обзор Neumann and Reddel 2002).

Вторая реакция HR, которая угрожает теломерам, называется HR t-петлей (Wang et al. 2004) (Fig. 5). Т-образные петли подвержены риску разрешения резольваз соединения Холлидея (HJ), потому что HJ может образоваться, если 5 ‘конец основание теломер соединяется с петлей смещения (D-петля). Миграция ветвей в направлении центромеры могла генерировать двойной HJ и разрешение этой структуры с кроссовером удалили бы весь сегмент петли, оставив резко укороченный теломер на конце хромосомы.HR T-loop был обнаружен посредством разделения функций мутанта TRF2, TRF2 ^ΔB , который защищает теломеры от NHEJ, но вызывает внезапные усечения теломер. Эти делеции зависят от двух белков. вовлечены в HR, рекомбинационный репарационный комплекс Mre11 и XRCC3, паралог Rad51, связанный с активностью по разрешению HJ. Клетки, экспрессирующие TRF2 ^ΔB , также содержат внехромосомную теломерную ДНК, которая является кольцевой. На двумерных гелях эти кружки показывают широкое распределение по размеру. в соответствии с их представлением петлевой части t-петель.Как N-конец TRF2 репрессирует t-петлю HR, не изучено. учредил. Поскольку невозмущенные клетки содержат небольшие количества кольцевой теломерной ДНК, подавление реакции t-петли HR на теломеры могут быть неполными. Контроль HR t-петли, по-видимому, еще больше ослаблен в клетках ALT, которые содержат большое количество теломерных круги (Чезаре и Гриффит, 2004; Ван и др., 2004). Поскольку T-SCE и t-петля HR являются сходными реакциями (одна происходит в цис , другая — в транс ), их преобладание в клетках ALT может быть связано с потерей репрессора, который контролирует оба.

Может быть третий тип HR с пагубными последствиями — рекомбинация между теломерами и интерстициальными теломерными теломерами. ДНК. Внутренняя теломерная ДНК хромосомы встречается нечасто в клетках человека, но у многих других позвоночных таких последовательностей много. по хромосомам. Рекомбинация между теломерами и этими элементами может вызывать терминальные делеции, внехромосомные фрагменты, инверсии и транслокации.Этот тип рекомбинации, по-видимому, имеет место в клетках мыши, лишенных ERCC1, которые генерируют большие внехромосомные элементы, которые содержат один участок теломерной ДНК, предположительно в хромосоме. внутренний сайт (Zhu et al. 2003). Эти элементы, называемые теломерными ДНК-содержащими двухминутными хромосомами (TDM), могут быть образованы путем рекомбинации. между теломерой и интерстициальной теломерной ДНК на одной хромосоме. Возможно, у shelterin есть ERCC1 / XPF на «поясе с инструментами» для предотвращения нежелательных событий рекомбинации.

Связь Шелтерина с факторами репарации ДНК

Shelterin имеет поразительное количество взаимодействующих партнеров, которые участвуют в процессинге ДНК (Таблица 1). С одной стороны, факторы на его «поясе с инструментами» могут облегчить укрытие. С другой стороны, эта обработка ДНК факторы потенциально вредны для теломер. Этот парадокс предполагает, что shelterin должен тщательно контролировать свои дочерние компании.

Особенно запутанным случаем связанных с теломерами факторов репарации ДНК являются ДНК-PKcs и гетеродимер Ku70 / 80 (Hsu et al. al. 1999, 2000; d’Adda di Fagagna et al. 2001; О’Коннор и др. 2004 г.). Эти белки способствуют развитию NHEJ и, как полагают, связаны с теломерами посредством взаимодействия с шелтерином (Таблица 1). Как ДНК-PKcs и Ku вносят вклад в функцию теломер, неизвестно; в любом случае их поведение необходимо будет строго контролировать так что избегается NHEJ концов хромосом.Похожая головоломка возникает из-за ассоциации шелтерина с ERCC1 / XPF. (Zhu et al. 2003), нуклеаза участвует в процессинге теломерного выступа после повреждения теломер. Как было предложено выше, shelterin может использовать эту нуклеазу для блокирования потенциально опасной рекомбинации между теломерами и интерстициальной теломерной ДНК.

Другим другом шелтерина в хорошую погоду является WRN, геликаза RecQ с 3′-экзонуклеазной активностью.WRN взаимодействует с TRF2 и могут быть обнаружены на теломерах с помощью ChIP и IF в S фазе (Opresko et al. 2002, 2004; Crabbe et al. 2004; Machwe et al. 2004). Общая функция WRN — разрешить миграцию ветвей HJ. In vitro WRN может разрешить структуру t-петли и разрушить 3 ‘выступ, атрибуты, которые представляют потенциальную угрозу целостности теломер (Opresko et al. 2002, 2004). Однако геликазы RecQ также обладают способностью удалять структуры G-квадруплексов из повторов TTAGGG (Sun et al.1998; Huber et al. 2002). Недавно было предложено, что эта активность необходима для репликации теломер на основании обнаружения S-фазозависимых потеря теломер в отсутствие WRN (Bai and Murnane 2003; Crabbe et al. 2004). Ингибирование WRN влияет только на синтез ДНК отстающей цепи на теломерах, которая копирует G-богатую теломерную цепь и является поэтому ожидается, что они ингибируются G-квадруплексами (Crabbe et al. 2004). Так что, возможно, шелтерин может использовать WRN для предотвращения проблем во время синтеза отстающей цепи, одновременно блокируя WRN от ненадлежащего разрешение t-петель после завершения репликации ДНК.

Ожидается, что список факторов, связанных с убежищем, будет расширяться. Задача будет заключаться в том, чтобы понять особенности теломер, специфичных для теломер. функции этих белков и то, как shelterin удается контролировать свою нежелательную активность.

Выводы

Обрисованная здесь концепция заключается в том, что шелтерин защищает концы хромосом, активно изменяя архитектуру теломерной ДНК.Шелтерин распознает теломерную ДНК и преобразует ее в Т-образную петлю, предположительно так, чтобы конец хромосомы был скрыт от оборудование NHEJ. Субъединица шелтерина POT1 взаимодействует с одноцепочечной теломерной ДНК, влияя на поддержание теломерной ДНК теломеразой и защищает 5′-конец хромосомы. И все же другие аспекты убежища, пока в значительной степени неизвестно, позволяют теломерам ускользать от обнаружения с помощью надзора за повреждениями ДНК.Шелтерин, похоже, использует «пояс с инструментами», на котором несколько белков репарации ДНК, таких как WRN, ERCC1 / XPF, комплекс Mre11 и ДНК-PK, которые, как предполагается, помогают шелтерину при выполнении дополнительных транзакций ДНК, обеспечивающих целостность конца хромосомы. В то же время укрытие должно контролируют действие этих факторов репарации ДНК, поскольку некоторые из них способны разрушать концы хромосом. Дальнейшая деконструкция Византийского мира теломер должны показать, как защищаются концы хромосом, и предоставит уникальную перспективу на ответ на повреждение ДНК.

Благодарности

Несколько важных исследований функции теломер человека не обсуждались в этом обзоре из-за нехватки места и тематики. соображения. Прошу прощения у коллег, работа которых не упоминается. Я очень благодарен Тому Чеху за полезные комментарии. Благодарим сотрудников моей лаборатории за критику моих идей и стиля письма.Мы благодарны за постоянную поддержку за нашу работу с теломерами за счет грантов от NIH и NCI (GM49046-12, CA76027-8, AG16642-7).

Сноски

• Статья и публикации находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1346005.

• №1 Переписка.E-MAIL delange {at} mail.rockefeller.edu; ФАКС (212) 327-7147.

• Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

синаптонемных сложных белков: единственность или универсальность?

Периодическая таблица белковых комплексов

Периодическая таблица белковых комплексов, опубликованная в журнале Science , предлагает новый способ взглянуть на огромное разнообразие структур, которые белки могут создавать в природе, какие из них могут быть открыты в ближайшее время, и предсказать, как можно создать совершенно новые структуры.Таблица, созданная междисциплинарной командой под руководством исследователей из кампуса Wellcome Genome и Кембриджского университета, представляет собой ценный инструмент для исследований в области эволюции и белковой инженерии.

Почти каждый биологический процесс зависит от взаимодействия белков и их сборки в комплексы определенным образом, и многие заболевания связаны с проблемами сложной сборки. Принципы, лежащие в основе этой организации, еще не полностью поняты, но, определяя фундаментальные этапы эволюции белковых комплексов, новая «периодическая таблица» представляет систематический, упорядоченный взгляд на сборку белков, предоставляя визуальный инструмент для понимания биологической функции.

Мы наводим порядок в запутанном мире белковых комплексов.

«Эволюция привела к появлению огромного разнообразия белковых комплексов, и это может показаться немного хаотичным», — объясняет Джо Марш, ранее работавший в Геномном кампусе Wellcome, а теперь из Отделения генетики человека MRC Эдинбургского университета. «Но если вы разберете шаги, которые предпринимают белки, чтобы стать комплексами, то можно найти несколько основных правил, которые могут объяснить почти все сборки, которые люди наблюдали до сих пор.”

Бесконечные вариации на тему

Различные бальные танцы можно рассматривать как бесконечную комбинацию небольшого количества основных шагов. Точно так же «танец» сборки белкового комплекса можно рассматривать как бесконечные вариации димеризации (один удваивается и становится двумя), циклизации (один образует кольцо из трех или более) и добавления субъединиц (два разных белка связываются друг с другом). . Поскольку это происходит довольно предсказуемым образом, не так сложно, как вы думаете, предсказать, как будет образовываться новый белок.

«Мы наводим порядок в беспорядочном мире белковых комплексов», — объясняет Себастьян Анерт из Кавендишской лаборатории Кембриджского университета, физик, который регулярно сталкивается с биологическими проблемами. «Белки могут проходить несколько итераций этих простых шагов, добавляя все новые и новые уровни сложности и приводя к огромному разнообразию структур. Мы создали классификацию, основанную на этих основополагающих принципах, которая помогает людям разобраться в сложности.”

Исключения из правила интересны сами по себе, добавляет Себастьян, поскольку являются предметом текущих исследований.

«Проанализировав десятки тысяч белковых комплексов, трехмерные структуры которых уже были экспериментально определены, мы смогли увидеть повторяющиеся закономерности в происходящих переходах сборки — и с новыми данными масс-спектрометрии мы смогли увидеть более широкую картину. , — говорит Марш.

«Основная работа этого исследования — теоретическая физика и вычислительная биология, но его невозможно было бы сделать без масс-спектрометрии наших коллег из Оксфордского университета», — добавляет Сара Тайхманн, руководитель исследовательской группы EMBL-EBI и Wellcome Trust Институт Сэнгера.«Это еще один отличный пример того, насколько ценными могут быть междисциплинарные исследования».

Этот пост был первоначально опубликован на EMBL-EBI News.

Теги: биофизика, эмбле-эби, эволюция, структурная биология