Роль белков в живой клетке план сообщения: Используя информационные ресурсы, подготовьте сообщение о роли белков в живой клетке.

Роль белков в жизнедеятельности организма

 Редко можно встретить человека, не слыхавшего о белках. О них упоминается почти во всех работах по питанию, о них же в своих выступлениях говорят диетологи – и медики, и натуропаты.

С точки зрения химика, белки – одни из самых сложных компонентов в пище. Значение их чрезвычайно велико, недаром Ф. Энгельс определил нашу биологическую жизнь как «способ существования белковых тел». В клетках человека их содержится в среднем около 20% от общей массы.

Одна из важнейших функций белков – строительная. Все органоиды клетки, мембраны и внеклеточные структуры в своей основе имеют белок. Нет белка – нет и органической жизни на Земле. (По крайней мере в том виде, в каком мы привыкли воспринимать жизнь.)

Белки выполняют и роль катализаторов (ферментов, или энзимов). Почти все химические превращения в живой природе протекают с участием ферментов. Причем каталитическая активность белков весьма специфична. Практически для каждой (!) реакции существуют свои ферменты. Без них реакции идти просто не могут, ведь энзимы ускоряют процессы в десятки и сотни миллионов раз.

Еще одна функция белков – транспортировка необходимых соединений или химических элементов. Гемоглобин, например, переносит кислород, доставляя его в самые удаленные уголки тела, он же транспортирует углекислый газ.

Двигаемся мы также благодаря белкам. Все движения, на которые способны живые организмы – от поворота листьев растений и биения жгутиков простейших до перемещений животных, – все без исключения производятся за счет специального сократительного белка.

Белки выполняют и защитную функцию. При попадании в организм чужих белков или клеток вырабатываются особые белки – антитела, которые связывают и обеззараживают чужеродные вещества.

И наконец, белки могут служить источником энергии. Но это самое невыгодное «топливо».

Все белки построены из более-менее простых составляющих – аминокислот. Каждая из них наряду с углеродом, водородом и кислородом, входящими в органические соединения, обязательно содержит азот.

Известно около 80 природных аминокислот, но в обычной пище встречаются лишь 22 из них. Из этих элементарных «кирпичиков», стыкуемых в различном порядке, состоит все огромное многообразие белковых молекул. По оценкам ученых, в природе насчитывается около 10 ¹⁰ –10 ¹² различных видов белков.

Помимо природных, существуют и синтетические аминокислоты. Из такой искусственной аминокислоты состоит, например, капрон, из которого делают и автомобильные покрышки, и одежду (ходить в которой йоги не советуют).

В природе же аминокислоты производятся живыми организмами. Считается, что 12 аминокислот может синтезировать и человек, поэтому они называются заменимыми. Остальные 10 аминокислот в обычных условиях человеческий организм не производит. Их называют незаменимыми.

Понятно, что незаменимые аминокислоты должны поступать с пищей. В зависимости от их наличия все белки даже подразделяют на «полноценные» (в которых эти аминокислоты присутствуют) и «неполноценные» (где их нет). Однако на практике об этом можно особо не задумываться. При более-менее разнообразном меню мы почти всегда получаем достаточное количество различных аминокислот, к тому же существует кишечная микрофлора, поставляющая массу необходимых соединений, плюс ко всему сам организм в экстремальных условиях или после соответствующей тренировки начинает их синтезировать. Потому-то сам факт «незаменимости» аминокислот некоторые ученые ставят под сомнение.

Серьезные нарушения, вызванные неправильным обменом какой-либо аминокислоты, обычно встречаются только в результате некоторых заболеваний или при злоупотреблении лекарствами, а также при вынужденном недоедании или вынужденном однообразном питании.

Белки содержатся практически во всех натуральных продуктах. При переваривании белки расщепляются на аминокислоты, которые либо используются организмом для синтеза собственных белков, либо окисляются, то есть сжигаются как топливо. При окислении в числе прочих веществ образуется мочевая кислота, которая поступает в кровь и, по идее, должна выводиться почками. Если же организм ослаблен, а мочевой кислоты много (и то и другое – обычный результат злоупотребления мясным), она откладывается в тканях, вызывая подагру.

Часто говорят о «норме потребления» белков. Действительно, в каждый период жизни организм, несомненно, нуждается в каком-то определенном их количестве. Но эти потребности зависят от возраста, наследственности, темперамента, нагрузок, климата и множества других причин. Поэтому понятие «норма» здесь совершенно неприменимо.

В раннем детстве, когда потребность в белках наибольшая (за первый год жизни вес тела утраивается), все необходимые вещества ребенок получает с материнским молоком. Нельзя не признать, что это идеальный продукт, отлично обеспечивающий столь интенсивный рост. Между тем на долю белков в грудном молоке приходится лишь 7,4% его общей калорийности.

С возрастом, естественно, потребность в белках снижается. Ткани наращиваются все медленнее и медленнее, и к моменту зрелости на первый план выдвигается уже не строительная функция пищи, а энергетическая. Главным для организма становится компенсация текущих энергозатрат. Еще более отчетливо это проявляется у взрослых, а тем более у пожилых людей.

Следовательно, доля белка в общей калорийности рациона должна снижаться. Но рассмотрим любопытную таблицу, приводимую Бирхер-Беннером, в которой он демонстрирует распределение калорийности пищи по питательным веществам.

То есть получается, что потребление белков с возрастом не уменьшается, а увеличивается! Организм не может принять больше белка, чем ему необходимо, – это уже яд, и избыток обязательно должен быть сожжен. Так и образуются шлаки – конечные продукты белкового обмена: мочевая кислота, мочевина, аммиак, креатинин, креатин и другие. При избытке этих соединений выведение их затрудняется, и они задерживаются в организме, постепенно накапливаясь и нарушая все обменные процессы.

Разумеется, скорость освобождения от шлаков зависит от множества причин: соотношения прихода и расхода энергии, наличия витаминов, макро- и микроэлементов, физической активности, состояния органов и т. п. Но в любом случае белок – самое невыгодное «топливо». Его энергетическая ценность при окислении в организме составляет (по А. А. Покровскому) лишь 70,8 % от полной теплоты сгорания. Для жиров и усвояемых углеводов эти цифры соответственно 96,3 % и 100 %. Это значит, что 1 г белка при простом сжигании дает 5,65 ккал, а при окислении в организме – 4,0 ккал. А куда исчезает остальное? Остальное – шлаки.

Если учесть также, что избыток белка ведет к неоправданной интенсификации обменных процессов (а это способствует преждевременному изнашиванию, то есть старению тканей), то не таким уж парадоксальным кажется вывод Бирхер-Беннера – белок уменьшает ценность пищи. (По данным К. С. Петровского, белки на 30–40 % повышают основной обмен, жиры – на 4–14 %, углеводы – на 4–7 %.)

Разумеется, какое-то количество белков, и притом разнообразных, необходимо и взрослому человеку. Но даже в «обычной» пище их значительно больше, чем нужно. Иногда действительно не хватает какой-нибудь аминокислоты, но тогда человек инстинктивно набрасывается на нужную еду, и не надо следить за «достаточностью» белка, не надо «питать» организм белком, именно это и приносит вред.

Источник: В. А. Тутельян, А. И. Вялков, А. Н. Разумов, В. И. Михайлов, К. А. Москаленко, А. Г. Одинец, В. Г. Сбежнева, В. Н. Сергеев «Научные основы здорового питания»

Используя информационные ресурсы, подготовьте сообщение о роли белков (или углеводов) в живой клетке. Запишите план сообщения.

Белки — основная структурная единица клеток. Это полимеры, мономерами которых являются аминокислоты. В состав белков входит 20 типов аминокислот. В каждой из аминокислот содержится аминогруппа (-NH), карбоксильная группа (-СООН) и радикал (R). Строение радикалов отличается у различных аминокислот. Соединение аминокислот в молекуле белка происходит благодаря образованию пептидной связи: аминогруппа одной аминокислоты соединяется с карбоксильной группой другой аминокислоты.

Молекулы белков имеют сложную пространственную структуру.
Линейная последовательность аминокислот в составе полипептидной цепи представляет первичную структуру белка. Она уникальна для любого белка и определяет его форму, свойства и функции.
Вторичная структура белков представляет собой спираль или гармошку. Витки спирали или ребра гармошки удерживаются водородными связями между группами — СООН и —NН2— . Хотя водородные связи малопрочные, но благодаря их значительному количеству в комплексе они обеспечивают довольно прочную структуру.
Третичная структура представляет собой причудливую, но для каждого белка специфическую конфигурацию, имеющую вид клубка (глобулу). Прочность третичной структуры обеспечивается ионными, водородными и дисульфидными (—S—S—) связями между остатками цистеина, а также гидрофобным взаимодействием.
Четвертичная структура характерна не для всех белков. Она возникает в результате соединения нескольких глобул в сложный комплекс. Например, гемоглобин крови человека представляет комплекс из четырех таких субъединиц, инсулин – из двух.

Денатурация — это утрата белковой молекулой своей структурной организации: четвертичной, третичной, вторичной, а при более жестких условиях — и первичной структуры . В результате денатурации белок теряет способность выполнять свою функцию. Причинами денатурации могут быть высокая температура, ультрафиолетовое излучение, действие сильных кислот и щелочей, тяжелых металлов и органических растворителей.
Денатурация может быть обратимой и необратимой, частичной и полной. Иногда, если воздействие денатурирующих факторов оказалось не слишком сильным и разрушение первичной структуры молекулы не произошло, при наступлении благоприятных условий денатурированный белок может вновь восстановить свою трехмерную форму. Этот процесс называется ренатурацией, и он убедительно доказывает зависимость третичной структуры белка от последовательности аминокислотных остатков, т. е. от его первичной структуры

Такая сложная организация белковой молекулы связана с разнообразными функциями, свойственными этим биополимерам.
1 Строительный материал – белки участвуют в образовании оболочки клетки, органоидов и мембран клетки. Из белков построены кровеносные сосуды, сухожилия, волосы.
2. Каталитическая роль – все клеточные катализаторы – белки (активные центры фермента). Структура активного центра фермента и структура субстрата точно соответствуют друг другу, как ключ и замок.
3. Двигательная функция – сократительные белки вызывают всякое движение.
4. Транспортная функция – белок крови гемоглобин присоединяет кислород и разносит его по всем тканям.
5. Защитная роль – выработка белковых тел и антител для обезвреживания чужеродных веществ.
6. Энергетическая функция – не основной , но источник энергии :1 г белка эквивалентен 17,6 кДж

Вопросы к экзамену за 10 класс

Список вопросов для экзамена по биологии для 10 класса АГ

Общая биология. Введение

1. Коренные свойства живого. Уровни изучения живых систем.

Биология клетки

1.   Основные положения клеточной теории. Отличия про- и эукариотической клетки.

2.   Химический и элементный состав живого: органогены, макро- и микроэлементы.

3.   Функции воды и других минеральных веществ в живых организмах.

4.   Липиды: классификация состав и функции. 

5.   Жирные кислоты, их классификация и номенклатура.Триглицериды и воска: химический состав и биологические функции.

6.   Структурные липиды (фосфоглицериды, сфинголипиды и гликолипиды): химический состав и биологические функции.

7.   Углеводы: моно- ди- и олигосахариды. Структура и функции в клетке

8.   Углеводы: полисахариды. Структура и функции в клетке

9.   Аминокислоты. Классификация. Функции в живых организмах

10.       Белки. Устройство пептидной связи. Механизм образования пептидной связи. Первичная структура белков. Вторичная. Факторы, определяющие определяющие вторичную структуру белка. Белковые домены.

11.       Третичная и четвертичная структура белка. Факторы определяющие образование данных структур. Фолдинг/укладка белка. Денатурация и ренатурация белка.

12.       Белки: классификация.  Функции белков. Примеры для растений, животных, бактерий.

13.       Классификация и номенклатура ферментов.Структурные особенности белков-ферментов. Функциональные компоненты ферментативных систем. Понятие активного центра. Структура и свойства активных центров ферментов.

14.       Физико-химические основы ферментативного катализа. Влияние факторов среды (температура, рН, ионная сила) на скорость ферментативных реакций. Принципы регуляции ферментативной активности.

15.       Структра и номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеотдиов.

16.       Нуклеиновые кислоты: типы, строение и функции. 

17.       Структура ДНК. Репликация ДНК

18.       Типы, строение и функции РНК в клетке

19.       Транскрипция: процессинг РНК. 

20.       Ген, генетический код. 

21.       Синтез белка: трансляция. Структура и функции рибосом. Регуляция трансляции

22.       Регуляция экспрессии генов  эукариот и прокариот. Оперон.

23.       Пигменты. Химическое строение и функции в клетке. 

24.       Строение прокариотической клетки.

25.       Эукариотическая клетка. Строение и функции ядра, цитоплазмы и основных органоидов.

26.       Сравнительная характеристика клеток эукарит: грибов, растений и животных.

27.       Фазы клеточного цикла.

28.       Этапы и значение митоза.

29.       Этапы и значение мейоза 

30.       Метаболизм. Ассимиляция и диссимиляция. 

31.       Типы питания.

32.       Хемосинтез у прокариот. Реакции брожения. 

33.       Клеточное дыхание. Строение и функции митохондрий.

34.       Гликолиз

35.       Цикл Кребса

36.       Электрон-транспортная цепь. Синтез АТФ.

37.       Фотосинтез. Строение и функции хлоропластов. 

38.       Световая фаза. Z-схема. Синтез АТФ и восстановление НАДФ.

39.       Темновая фаза. Цикл Кальвина

40.       С4 путь. CAM-метаболизм.

Экология

1.    Экологические факторы. Определение, классификация и принципы действия.

2.    Среды жизни. Классификация, общие свойства.

3.    Популяция, определение. Плотность, рождаемость, смертность. Возрастная структура

4.    Ограниченный и неограниченный рост численности. Уравнение Ферхюльста-Пирла.

5.    Структура экосистемы. Поток энергии и круговорот вещества. Цепи и сети питания. Экологическая пирамида.

6.    Понятие о продуцентах, консументах и редуцентах. Систематическое положение и основные процессы преобразования вещества и энергии реализуемые ими.

7.    Типы экосистем и их стабильность. Первичная и вторичная продукция.

8.    Особенности функционирования искусственных экосистем.

9.    Взаимодействия организмов в экосистемах. Классификация.

10.  Взаимодействия хищник-жертва.

11.  Взаимоотношения паразит-хозяин, примеры систем из разных царств органического мира. Основные адаптации к жизни в организме хозяина.

12.  Конкуренция. Типы и механизмы конкурентных взаимоотношений. Принцип Гаузе.

13.  Особенности водной среды обитания. Положение организмов по отношению к действию основных экологических факторов в водной среде.

14.  Особенности наземно-воздушной среды обитания. Положение организмов по отношению к действию основных экологических факторов в наземно-воздушной среде.

15. Освоение растениями и животными наземно-воздушной среды.

16. Основные таксоны животных, обитающих в пресных водах. Первично- и вторичноводные животные.

17. Организмы – вредители древесных пород: основные таксоны и их биологические особенности.

Микробиология

1. Строение клетки эукариот и прокариот. Сравнительная характеристика.

2. Общая характеристика прокариот. Бактерии и археи. Строение клетки, размножение. Спорообразование.

3. Роль прокариот в природе и жизни человека. Болезнетворные бактерии.

4. Основные пути преобразования вещества и получения энергии у прокариот.

Альгология

1. Общая характеристика экологической группы водорослей (фотоавтотрофных протистов). Типы строения вегетативного тела.

2. Размножение и жизненные циклы водорослей.

3. Отдел Зеленые водоросли, общая характеристика, основные представители. Жизненный цикл Улотрикса, Ульвы и Хламидомонады.

4. Отдел Бурые водоросли, общая характеристика, основные представители. Жизненный цикл Ламинарии и Ектокарпуса.

5. Водоросли вне водных местообитаний

Микология

1. Роль грибов в природе, эволюция и строение вегетативного тела.

2. Размножение и жизненные циклы базидиальных и сумчатых грибов, основные представители.

3. Формы и эволюция плодовых тел базидиальных и сумчатых грибов.

4. Лишайники. Строение вегетативного тела, размножение, жизненные формы.

5. Экологические группы грибов

Ботаника

1. Происхождение и общая характеристика высших растений

2. Жизненный цикл высших растений. Две линии эволюции высших растений с преобладанием гаметофита и спорофита.

3. Переход от равно- к разноспоровости как важный этап эволюции высших растений.

4. Эволюция женского гаметофита у высших растений.

5. Отдел Bryophyta (Мохообразные): общая характеристика, происхождение и жиз­нен­ный цикл, роль в природе.

6. Отдел Rhyniophyta (Риниофиты). Про­исхождение. Строение основных предста­вителей. Отдел Equisetophyta (Членистостебельные, Хвощеобразные). Общая характеристика.

7. Отдел Lycopodiophyta (Плауновидные): общая характеристика.

8. Отдел Equisetophyta (Членистостебельные, Хвощеобразные): общая характеристика.

9. Отдел. Polypodiophyta (папоротникообразные). Общая характеристика.

10.Происхождение голосеменных растений (возникновение семезачатка).

11. Общая характеристика класса хвойных, основные представители, жизненный цикл сосны обыкновенной

12.Общая характеристика цветковых растений, деление на классы.

13. ABC модель закладки цветка Основные направления эволюции цветка двудольных и однодольных растений.

14.Развитие мужского гаметофита у голосеменных и цветковых растений.

15.Формы опыления, специализация к агенты опыления.

16.Видоизменение (метаморфоз) органов растений.

17.Жизненные формы цветковых растений

18.Ткани цветковых растений. Классификация, строение.

19.Плоды и семена, принципы классификации, специализация к агенту распространения.

Зоология беспозвоночных. Часть 1

1. Место царства Животные в системе живой природы.
2. Общая характеристика простейших животных (Protozoa). Простейшие как целостный организм. Кто такие «Протисты»?
3. Скелетные образования и способы локомоции простейших.
4. Питание, газообмен, выделение и осморегуляция у простейших.
5. Общая характеристика и сравнительный анализ Саркодовых (Sarcodina).
6. Общая характеристика жгутиконосцев (Mastiogophora). Euglenida как представители миксотрофных простейших.
7. Общая характеристика и основные особенности Инфузорий (Ciliophora).
8. Малярийный плазмодий: систематическое положение, жизненный цикл и значение для человека.
9. Особенности паразитических простейших, связанные с их образом жизни.
10. Теория симбиогенетического происхождения хлоропластов и митохондрий.
11. Особенности многоклеточных животных (Metazoa), их происхождение.
12. Особенности строения и функционирования губок (тип Spongia). Место губок в системе многоклеточных животных.
13. Особенности строения и функционирования пластинчатых (тип Placozoa), их место в системе многоклеточных животных.
14. Основные этапы раннего онтогенеза многоклеточных животных. Понятие зародышевого листка. Двуслойные и трехслойные животные. Способы закладки мезодермы. Первично- и вторичноротые животные.
15. Строение и жизненные циклы кишечнополостных (тип Cnidaria). Одиночные и колониальные кишечнополостные. Особенности поколения полипов и медуз, связанные с их образом жизни.
16. Основные черты строения и функционирования плоских червей (тип Plathelminthes).
17. Сосальщики (Trematoda) как паразитические плоские черви. Жизненный цикл сосальщиков.
18. Ленточные черви (Cestoda) – паразиты человека и других животных: особенности строения и жизненных циклов.
19. Общая характеристика круглых червей (тип Nematoda).
20. Общая характеристика кольчатых червей (тип Annelida). Понятие метамерии.
21. Общая характеристика членистоногих (тип Arthropoda). Основные таксоны членистоногих.
22. Внешнее строение и особенности сегментного состава тела насекомых.
23. Основные отряды насекомых с неполным и полным превращением: особенности строения, образа жизни и онтогенеза.
24. Особенности общественных насекомых на примере муравьев (отр. Перепончатокрылые, сем. Муравьи).
25. Способ локомоции, типы скелета и организация мускулатуры у многоклеточных животных.
26. Особенности паразитических многоклеточных животных, связанные с образом жизни.
27. Способы заражения хозяев паразитами. Приведите примеры соответствующих организмов с указанием их систематической принадлежности.
28. Перед Вами препарат (тотальный препарат, гистологический срез и пр.) некоторого животного. Определите его систематическое положение и охарактеризуйте основные признаки.

Конспект урока по теме: Функции белков. Ферменты.

Тема урока: Функции белков. Ферменты

Цель урока: формирование у учащихся умения доказывать исключительную роль белков в живых клетках.

Планируемые результаты обучения.

Предметные: учащиеся расширяют научные представления о структурной и энергетической роли белков, незаменимых аминокислотах и их источниках для человека; у учащихся развиваются понятия о гормонах и ферментах, их значении в регуляции процессов жизнедеятельности, антителах и иммунитете. Метапредметные: учащиеся совершенствуют умения давать определения понятиям, классифицировать, делать выводы и заключения; у учащихся развивается умение объяснять взаимосвязь строения молекулы белка и выполняемых ею функций.

Личностные: у учащихся продолжает формироваться научное мировоззрение на основе понимания взаимосвязи строения белковых молекул и их функций в организме.

Основные виды деятельности: работа с учебником и другими источниками биологической информации, сотрудничество с одноклассниками при обсуждении существенных признаков строения белков.

Оборудование: таблицы с изображениями структурных уровней организации белковых молекул, схема работы ферментов.

План урока:

1. Актуализация знаний: белки — биологические полимеры, выполняющие в живых системах важнейшие функции (беседа).

Белки – это биополимеры, состоящие из остатков аминокислот, соединённых между собой пептидными связями (-CO-NH-). Белки входят в состав клеток и тканей всех живых организмов. В молекулы белков входит 20 остатков различных аминокислот. В зависимости от того, могут ли аминокислоты синтезироваться в организме человека и других животных, различают: заменимые аминокислоты — могут синтезироваться; незаменимые аминокислоты — не могут синтезироваться. Незаменимые аминокислоты должны поступать в организм вместе с пищей. Растения синтезируют все виды аминокислот.

II. Изучение нового материала.

1. Многообразие функций белков. Ученикам прилагается работа в парах таблицей. Один из пары называет белок, второй его функцию. Можно подменятся ролями.

Транспортная

Белок крови гемоглобин присоединяет кислород и транспортирует его от легких ко всем тканям и органам, а от них в легкие переносит углекислый газ; в состав клеточных мембран входят особые белки, которые обеспечивают активный и строго избирательный перенос некоторых веществ и ионов из клетки во внешнюю среду и обратно.

Регуляторная

Гормоны белковой природы принимают участие в регуляции процессов обмена веществ. Например, гормон инсулин регулирует уровень глюкозы в крови, способствует синтезу гликогена, увеличивает образование жиров из углеводов.

Защитная

В ответ на проникновение в организм чужеродных белков или микроорганизмов (антигенов) образуются особые белки — антитела, способные связывать и обезвреживать их. Фибрин, образующийся из фибриногена, способствует остановке кровотечений.

Двигательная

Сократительные белки актин и миозин обеспечивают сокращение мышц у многоклеточных животных.

Сигнальная

В поверхностную мембрану клетки встроены молекулы белков, способных изменять свою третичную структуру в ответ на действие факторов внешней среды, таким образом осуществляя прием сигналов из внешней среды и передачу команд в клетку.

Запасающая

В организме животных белки, как правило, не запасаются, исключение: альбумин яиц, казеин молока. Но благодаря белкам в организме могут откладываться про запас некоторые вещества, например, при распаде гемоглобина железо не выводится из организма, а сохраняется, образуя комплекс с белком ферритином.

Энергетическая

При распаде 1 г белка до конечных продуктов выделяется 17,6 кДж. Сначала белки распадаются до аминокислот, а затем до конечных продуктов — воды, углекислого газа и аммиака. Однако в качестве источника энергии белки используются только тогда, когда другие источники (углеводы и жиры) израсходованы.

Каталитическая

Одна из важнейших функций белков. Обеспечивается белками — ферментами, которые ускоряют биохимические реакции, происходящие в клетках. Например, рибулезобифосфаткарбоксилаза катализирует фиксацию СО₂ при фотосинтезе.

2. Белки-ферменты: свойства, механизм работы.

Ферменты, или энзимы, — особый класс белков, являющихся биологическими катализаторами. Благодаря ферментам биохимические реакции протекают с огромной скоростью. Скорость ферментативных реакций в десятки тысяч раз (а иногда и в миллионы) выше скорости реакций, идущих с участием неорганических катализаторов. Вещество, на которое оказывает свое действие фермент, называют субстратом.

Ферменты — глобулярные белки, по особенностям строения ферменты можно разделить на две группы: простые и сложные. Простые ферменты являются простыми белками, т.е. состоят только из аминокислот. Сложные ферменты являются сложными белками, т.е. в их состав помимо белковой части входит группа небелковой природы — кофактор. У некоторых ферментов в качестве кофакторов выступают витамины. В молекуле фермента выделяют особую часть, называемую активным центром. Активный центр — небольшой участок фермента (от трех до двенадцати аминокислотных остатков), где и происходит связывание субстрата или субстратов с образованием фермент-субстратного комплекса. По завершении реакции фермент-субстратный комплекс распадается на фермент и продукт (продукты) реакции. Некоторые ферменты имеют (кроме активного) аллостерические центры — участки, к которым присоединяются регуляторы скорости работы фермента (аллостерические ферменты).

Для реакций ферментативного катализа характерны: 1) высокая эффективность, 2) строгая избирательность и направленность действия, 3) субстратная специфичность, 4) тонкая и точная регуляция.

Скорость ферментативных реакций зависит от: 1) температуры, 2) концентрации фермента, 3) концентрации субстрата, 4) рН. Следует подчеркнуть, что поскольку ферменты являются белками, то их активность наиболее высока при физиологически нормальных условиях.

Большинство ферментов может работать только при температуре от 0 до 40 °С. В этих пределах скорость реакции повышается примерно в 2 раза при повышении температуры на каждые 10 °С. При температуре выше 40 °С белок подвергается денатурации и активность фермента падает. При температуре, близкой к точке замерзания, ферменты инактивируются.

3. Взаимосвязь структуры белков и выполняемых ими функций; классификация белков в зависимости от их структуры (фибриллярные и глобулярные белки).

Работа в группах. Рассмотреть таблицы с изображениями структурных уровней организации белковых молекул.

Пептидные, водородные, гидрофобные, ионные (электростатические) связи, в каких структурах могут присутствовать.

Одной из самых старых и распространенных классификаций белков является классификация по форме молекулы. Она делит белки на 2 группы: глобулярные и фибриллярные. К глобулярным относят белки, соотношение продольной и поперечной осей которых не превышает 1:10, а чаще составляет 1:3 или 1:4, т.е. белковая молекула имеет форму эллипса. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде. Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин — белок свёртывающей системы крови.



III. Закрепление знаний: зависимость функциональной активности белков от их структуры и условий среды.

IV. Домашнее задание.

1. Прочитайте § 4, ответьте на вопросы и выполните задания, приведённые в

конце параграфа.

2. Выполните задания 9 и 12 на с. 6—7 рабочей тетради.

3. *Используя дополнительную литературу и Интернет, найдите информацию об истории открытия и изучения ДНК. Подготовьте небольшое сообщение.

Ученые: жизнь на Земле появилась благодаря «союзу» РНК и белков

Две группы биологов из университета Северной Каролины под руководством Картера и его коллеги Ричарда Вольфендена (Richard Wolfenden) проводила эксперименты в своей лаборатории, пытаясь понять, как был совершен этот переход от РНК-мира к «тандему» ДНК и белков.

Как объясняют исследователи, проблема заключается в том, что молекулы белков сохраняют стабильность только в очень узком диапазоне базовых химических параметров. Если хотя бы один из них нарушается, то трехмерная молекула белков обычно распадается или деформируется.

Данное свойство белков является одной из главных причин того, почему ученым пришлось придумать «РНК-мир» — первичный океан Земли мог быть слишком теплым для того, чтобы молекулы белков в нем могли нормально существовать. Картер и Вольфенден проверили, так ли это, изучив то, как ведут себя аминокислоты при необычных температурах.

Эти эксперименты привели к неожиданным результатам. Оказалось, что степень различий в физических свойствах аминокислот и то, как они взаимодействовали с нуклеотидами, были примерно одинаковыми и при 25 градусах Цельсия, оптимальной температуре для жизни, и даже при 100 градусах.

Благодаря этому белки будут «сворачиваться» в трехмерную молекулу по одним и тем же правилам, как в теплой воде, так и в кипятке, что говорит о возможности их существования в горячем первичном океане Земли.

Подтверждение этому ученые нашли в транспортных молекулах РНК, которые захватывают аминокислоты и переносят их к центру сборки белков в клетке. Как оказалось, тРНК содержат в себе две системы распознавания аминокислот, одна из которых ориентируется на размер их молекул, а вторая – на то, как хорошо они отталкивают воду.

Первая находится на «хвосте» тРНК, за который цепляется аминокислота, и состоит из четырех генетических «букв», комбинация которых позволяет закодировать сразу 24 разных размера молекул. Вторая расположена в верхней части тРНК, в так называемом антикодоне из трех нуклеотидов, который цепляется за декодируемую цепочку генетической информации.

Существование подобной двойной системы отбора аминокислот, как считают авторы статьи, говорит о том, что эволюция белков шла в два этапа во время зарождения жизни.

Первый из них, по их словам, завершился еще до появления ДНК, и в то время молекулы белков были устроены достаточно просто – в одиночные линии и простые двумерные конструкции. Для сборки таких структур было достаточно знать размеры аминокислот, которые, по всей видимости, кодировались в РНК молекулах организмов времен «РНК-мира». Данные белки, судя по всему, играли вспомогательную роль и помогали клетке стабилизировать РНК-молекулы.

Появление нового «носителя информации» — ДНК – и связанной с ней возможности различать аминокислоты и по степени их гидрофобности позволило жизни сделать качественный шаг вперед и начать использовать сложные трехмерные белковые структуры, в результате чего жизнь приобрела тот облик, которым она обладает сегодня, заключают ученые.

План-конспект и анализ урока по биологии в 9 классе на тему «Биосинтез белков в живой клетке»

План-конспект и анализ урока

по биологии в 9 классе МБОУ №71 города Дзержинск

на тему «Биосинтез белков в живой клетке», проведенного

Кашировой Еленой Евгеньевной,

слушателем-стажером

курсов профессиональной переподготовки

«Биология и химия: теория и методика преподавания в образовательной организации»


Тема урока: « Биосинтез белка»

Дата проведения:

Место в учебном плане: урок №10. Глава II. Основы учения о клетке.

Класс: 9 класс общеобразовательной школы.

Цель:

Сформировать знания о значении и механизме биосинтеза белка

Задачи:

Образовательные:

1. Сформировать знания об основных этапах процесса биосинтеза белка: транскрипции и трансляции.

2. Дать представление о генетическом коде и его основными свойствами.

3. Изучить основные виды РНК

Развивающие:

1. Развитие познавательного интереса к изучаемому материалу;

2. Развивать умения анализировать, обобщать и делать выводы;

3. Продолжить формирование умений работать с интерактивной доской

Воспитательные:

1. Воспитание умения четко организовать самостоятельную работу,

2. Формировать интерес к учению и познавательную активность учащихся

Тип урока: комбинированный урок.

Оборудование: мультимедийная установка.

План-конспект урока.

Цель урока: Познакомить с процессами транскрипции и трансляции в живой клетке.

Задачи урока:

Учебные:

Формирование знаний о биосинтезе белков как одном из вариантов анаболизма.

Характеристика стадий биосинтеза белков: транскрипция и трансляция.

Обоснование роли различных веществ и структур клетки в процессе биосинтеза белков.

2. Развивающие:

закрепление умений работать с интерактивными заданиями.

Развитие самостоятельности в работе с учебным материалом.

3. Воспитательные:

Формирование мировоззренческого мышления.

Ход урока:

I.Организационный момент. Сообщение темы урока.

II. Актуализация.

1) Перечислите роль белков в клетке. (строительная – липопротеины, каталитическая – пероксидаза, двигательная – миозин, транспортная – гемоглобин, защитная – гамма-глобулин, энергетическая -17, 6 кДж/моль, регуляторная – инсулин и другие).

Рисунок 1

2) Что такое метаболизм? (Совокупность реакций, протекающих в клетке и обеспечивающих процессы её жизнедеятельности.)

3) Что такое ассимиляция? (Совокупность химических процессов, направленных на образование и обновление структурных частей клеток.)

Несколько учеников (по количеству ученических компьютеров) получают индивидуальные задания, связанные с работой на компьютерах:

Выполнить задание, используя интерактивный конструктор «Собери нуклеотид» (п.6 ОК).

Выполнить задание, используя интерактивное задание «Принцип комплементарности» (п.6 ОК).

Остальные ученики опрашиваются устно, используя мультимедийный проектор:

Прокомментируй интерактивную схему «Строение белковых молекул» (п.6 ОК).

Используя интерактивную таблицу «Строение клеток эукариот. Ядро» (п.8 ОК), расскажи об особенностях его строения и выполняемых функциях.

Используя интерактивную таблицу «Строение клеток эукариот. Рибосомы» (п.8 ОК), расскажи об особенностях их строения и выполняемых функциях.

III. Изучение новой темы. Рассказ учителя с элементами беседы о биосинтезе белка. На интерактивной доске демонстрируется анимация «Схема синтеза белка на полисоме». Во время беседы учащиеся записывают определения в тетрадь. «Каждая живая клетка создает (синтезирует) составляющие ее вещества. Этот процесс называется биосинтезом. Биосинтез – образование органических веществ, происходящее в живых клетках с помощью ферментов и внутриклеточных структур. Биосинтез, осуществляемый в процессе обмена веществ, всегда идет с потреблением энергии».

На интерактивной доске демонстрируется таблица «Схема структуры молекулы АТФ». «Главным поставщиком энергии для биосинтеза служит АТФ. Ферменты, отщепляя остатки фосфорной кислоты от молекулы АТФ, обеспечивают выделение энергии и тем самым создают возможность ее использования для биосинтеза».

На интерактивной доске демонстрируется интерактивная схема «Виды РНК». «В биосинтезе молекул участвуют аминокислоты, многочисленные ферменты, рибосомы и различные РНК (иРНК, тРНК, рРНК). Процесс биосинтеза молекул белка осуществляется в рибосомах.

Демонстрируется интерактивная схема «Этапы реализации наследственной информации». Учащиеся зарисовывают схему в тетрадь. Записывают определения транскрипция и трансляция в тетрадь. «Характер биосинтеза определяется наследственной информацией, закодированной в определенных участках ДНК – генах. Гены содержат информацию об очередности аминокислот в молекуле белка, т.е. кодируют его первичную структуру. Молекулы иРНК передают этот код для биосинтеза. Схематично процесс биосинтеза можно представить так:

Демонстрируется анимация «Транскрипция». «Биосинтез белка начинается с транскрипции. Этот процесс происходит в ядре. Благодаря действию ферментов участок ДНК раскручивается, и вдоль одной из цепей по принципу комплементарности выстраиваются нуклеотиды».

Демонстрируется анимация «Трансляция». «Образовавшаяся иРНК выходит из ядра в цитоплазму через поры в ядерной оболочке и вступает в контакт с многочисленными рибосомами. Рибосомы – «сборочный аппарат» клетки.»

Демонстрируется интерактивный рисунок «Строение транспортной РНК». Учащиеся зарисовывают схему РНК в тетрадь. «Для каждой аминокислоты требуется своя тРНК, комплементарная определенному участку иРНК. Такой участок иРНК представлен триплетом – сочетанием трех нуклеотидов, называемых кодоном. В свою очередь, и каждая аминокислота, входящая в белок, тоже закодирована определенным сочетанием трех нуклеотидов тРНК (антикодоном), по которым они и находят друг друга».

IV. Закрепление.

Устный опрос по пройденному материалу.

Словарная работа: транскрипция, трансляция, кодон, антикодон, триплет

Используя записи в тетрадях и текст учебника, ученикам предлагается индивидуально выполнить интерактивные задания:

«Составьте иРНК по фрагменту ДНК»,«Определение антикодона тРНК и аминокислоты по кодону иРНК»

V. Подведение итогов. Оценивание.

Интерактивный тренажер после § 10

Давайте подведем итоги. Синтез белка состоит из двух этапов: транскрипция (образование информационной РНК по матрице ДНК, протекает в ядре клетке) и трансляции (эта стадия проходит в цитоплазме клетки на рибосомах).

VI. Рефлексия.

Что вы узнали на уроке?

Что вам понравилось?

Выставление оценок, их комментирование.

VII. Домашнее задание

Изучить § 10.

Ответить на вопросы в конце § 10.

Творческое задание. С применением материалов Образовательного комплекса и собственных фотографий и рисунков. Сделать презентацию «Биосинтез белков в живой клетке».

Анализ урока в 9 «а» классе

«Биосинтез белка», проведенного Кашировой Еленой Евгеньевной

учителем индивидуального обучения МБОУ школа№71

Урок «Биосинтез белка» был проведен в 9 «а» классе. В данном классе обучается 16 человек. Из них имеют отметки «4» и «5» 75% (12) обучающихся, «3» — 25% (4) обучающихся. Класс по уровню знаний – выше среднего.

Урок «Биосинтез белка» — урок №10 главы II «Основы учения о клетке». Этой теме отводится 1 час из 10 часов. Эта тема является продолжением предыдущего материала «Обмен веществ в живой клетке». Последующая тема раскрывает основы биосинтеза углеводов – фотосинтез в растительной клетке. Для данного класса тема несложная, она помогает обосновать роль различных веществ и структур клетки в процессе биосинтеза белков как одного из вариантов пластического обмена (анаболизма).

На данном учебном занятии учащиеся должны владеть элементарными навыками работы на компьютере: владение мышкой, работа с клавиатурой. Для проведения урока необходимо следующее оборудование: компьютер, оборудованный мультимедийным проектором; система звуковоспроизведения; интерактивная доска; компьютеры с установленным образовательным комплексом «1С:Школа. Основы общей биологии, 9 кл.» (8-9 компьютеров). Анимации и интерактивные задания помогают ученику в понимании и запоминании учебного материала, который обычно вызывает затруднения при работе с обычным учебником. Данное занятие сложно провести без использования ИКТ.

На уроке была поставлена следующая цель: познакомить с процессами транскрипции и трансляции в живой клетке. Задачи урока: формирование знаний о биосинтезе белков как одном из вариантов анаболизма, обоснование роли различных веществ и структур клетки в процессе биосинтеза белков, закрепление умений работать с интерактивными заданиями.

Для выполнения этих целей и задач урок построен таким образом, что в начале урока идет повторение и закрепление знаний о строении клетки, структур клетки, которые участвуют в биосинтезе. Повторяется понятие комплементарности, по этому принципу и идет сборка белковых молекул на полисоме.

При изучении новой темы сначала повторяется материал о строении АТФ – главного поставщика энергии для биосинтеза, различных видах РНК, участвующих в биосинтезе. Затем демонстрируется флешролик «Транскрипция» где в интерактивном режиме показан процесс списывания наследственной информации с ДНК на иРНК. Диктором доступно объясняются все этапы транскрипции. Далее происходит опрос по закреплению полученных знаний.

На втором этапе новой темы демонстрируется второй флешролик «Трансляция» где показан процесс сборки белковых молекул на полисоме. На каждом из этих этапов урока происходит первичное закрепление каждого понятия по новой теме.

На этапе закрепления знаний проводится словарная работа с новыми понятиями: транскрипция, трансляция, кодон, антикодон, триплет. Затем используется интерактивный тренажер § 10 (ОК).

На уроке для лучшего усвоения применялись следующие виды учебной деятельности: опрос, слушание, работа с текстом учебника, самостоятельная работа с интерактивными заданиями, ответы на вопросы. Для контроля знаний по изученной теме были применены следующие методы контроля: самостоятельная работа с последующей проверкой с использованием ИКТ, создание при опросе нестандартных ситуации с вопросом «Почему?»

Считаю, что цели урока были достигнуты, задачи урока выполнены, формы учебной деятельности полностью соответствуют выбранным средствам ИКТ. Часть интерактивных заданий можно использовать на последующих уроках по данной теме в качестве повторения и закрепления знаний и умений.

Функции белков. | План-конспект урока по биологии (9 класс) по теме:

Тема урока: Функции белков

Дата проведения 22.09.14

Цели: 

• организовать познавательную деятельность учащихся на уровне восприятия и первичного осмысления материала о функциях белков; содействовать закреплению знаний учащимися о составе и строении белков;
• способствовать развитию умений наблюдать, анализировать, делать выводы; продолжить формирование практических навыков в процессе исследования и навыков самостоятельной работы с текстом учебника;
• воспитывать здоровый образ жизни и культуру общения учащихся.

Тип учебного занятия: урок изучения нового материала.

Средства обучения: таблица «Структуры белка», компьютер.

Методы: наглядные, практические, проблемного изложения, частично поисковый, поисково-исследовательский.

Оборудование: Раствор яичного белка альбумина (белок одного куриного яйца развести в 0,5 л воды), концентрированная азотная кислота, молоко, уксусная кислота, пробирки, штатив, химические стаканы, стеклянные палочки, спиртовка, держатель.

Ход урока:

I. Организационный этап

Приветствие, проверка готовности учащихся к учебному занятию, организация внимания школьников.

Ребята! Посмотрите на меня, сделайте глубокий вдох, теперь выдох. И начинаем работать.

II. Этап подготовки учащихся к изучению нового материала

1. Для начала проведём теоретическую разминку.

Беседа по вопросам:

1. Что такое биополимеры? Приведите примеры биополимеров.
2. Какие вещества называются белками или протеинами?
3. Что такое первичная структура белка? Какими связями поддерживается? (у доски показ по таблице «Структуры белка»)
4. Что представляет собой вторичная структура белка? Какими связями поддерживается?
5. Что представляет собой третичная структура белка? Какими связями поддерживается?
6. Что представляет собой четвертичная структура белка?
7. Что такое денатурация белка?

2. Эксперимент.

А теперь я попрошу вас понаблюдать за проводимым мною экспериментом и прокомментировать его:

Демонстрационный опыт 1:

В пробирку наливают 10-15 мл раствора белка альбумина и нагревают в пламени горелки.

Что мы наблюдаем? Прокомментируйте наблюдаемое явление.

(Появляется осадок белка еще до того, как жидкость закипит. Белок свертывается, процесс денатурации необратим).

Демонстрационный опыт 2:

В пробирку наливают 10—15 мл белка и добавляют 10 мл концентрированной азотной кислоты.

Что мы наблюдаем? Прокомментируйте наблюдаемое явление.

(Образуется белый аморфный осадок белка. Концентрированные кислоты вызывают также необратимую денатурацию).

Какой вывод мы можем сделать из проведенного исследования?

(Действие высоких температур, концентрированных кислот вызывают денатурацию белков)

Ребята! Почему при попадании кислоты на кожу происходит ожог? (происходит необратимая денатурация белков)

Почему повышение температуры тела до 42 градусов у человека приводит к смерти? (происходит необратимая денатурация белков)

А сейчас вы самостоятельно проведёте эксперимент. 

Перед вами молоко. Внимание, вопрос.

— Как вы думаете, почему в школах нашей области детям дают молоко?

(молоко – ценнейший продукт питания содержит сразу три вещества: жир, углевод – лактозу и, конечно же, белок – казеин, который так необходим растущему организму).

Сейчас вы его сами обнаружите. Добавьте в стаканчики с молоком несколько капель уксусной кислоты.

— Что вы наблюдаете? Прокомментируйте наблюдаемое явление (казеин сворачивается и образуется творожистый осадок (творог)).

— Можно из этого молока (демонстрируется молоко) сварить кашу? (да)

— А из этого? (демонстрируется молоко, в котором казеин свернулся) (нет)

— Могут ли денатурированные белки выполнять свои функции? (При нарушении природной структуры белки не могут выполнять свои функции).

— Так какая же тема сегодняшнего урока? (функции белков).

Запишите, пожалуйста, тему урока в тетради (тема на слайде 1).

А теперь давайте попытаемся сформулировать цели. Учитель обобщает сказанное.

III. Этап изучения нового материала

1. Презентация функций белков

Анализ фото и рисунков на слайдах.

Слайд 2

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют строительную функцию? Белки входят в состав всех клеточных мембран и органоидов клетки. Преимущественно из белка состоят стенки кровеносных сосудов, хрящи, сухожилия, волосы и ногти.

Слайд 3

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют каталитическую или ферментативную функцию? Специальные белки — ферменты способны ускорять биохимические реакции в клетке в десятки и сотни миллионов раз. Известно около тысячи ферментов. Каждая реакция катализируется своим особым ферментом.

Слайд 4

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют двигательную функцию? Двигательную функцию выполняют особые сократительные белки. Благодаря им двигаются реснички и жгутики у простейших, перемещаются хромосомы при делении клетки, сокращаются мышцы у многоклеточных, совершенствуются другие виды движения у живых организмов.

Слайд 5

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют транспортную функцию? Клетки крови – эритроциты содержат белок гемоглобин, который переносит кислород из легких к клеткам других тканей и органов.

В мышцах эту функцию выполняет белок миоглобин. Белки сыворотки крови способствуют переносу липидов и жирных кислот, различных биологически активных веществ. Транспортные белки в наружной мембране клеток переносят различные вещества из окружающей среды в цитоплазму. 

Слайд 6

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют защитную функцию?

Клетки крови – лейкоциты дозревают в тимусе (вилочковая железа) и лимфатических узлах, превращаясь в лимфоциты. Последние делятся, образуя антитела, которые блокируют чужеродные белки. Таким образом, специфические белки предохраняют организм от вторжения чужеродных белков и микроорганизмов;

фибрин и тромбин предохраняют организм от кровопотери.

Слайд 7

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют регуляторную функцию? На слайде представлена эндокринная система человека. Эндокринные железы выделяют в кровь гормоны, которые имеют белковую природу. Они поддерживают постоянные концентрации веществ в крови и клетках, участвуют в росте, размножении и других жизненно важных процессах. Например, инсулин регулирует содержание сахара в крови.

Слайд 8

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют сигнальную функцию? В мембрану клетки встроены белки, способные изменять свою третичную структуру в ответ на действие факторов внешней среды. Так происходит прием сигналов из внешней среды и передача информации в клетку.

Слайд 9

Проанализируйте изображения на слайде. Почему белки выполняют энергетическую функцию? Белки могут выполнять энергетическую функцию, являясь одним из источников энергии в клетке. При полном расщеплении 1 г белка до конечных продуктов выделяется 17,6 кДж энергии.

2. Самостоятельная работа (слайд 10) с текстом учебника на с.27-28.

Прочитать текст и заполнить таблицу «Функции белков» в рабочей тетради на печатной основе – с.12-13

IV. Этап проверки первичного усвоения знаний (слайд 11)

Ответить на вопросы:

1. Какие функции белков вам известны?

2. При окислении 1 г белков выделяется столько же энергии, сколько при окислении 1 г углеводов. Почему организм использует белки как источник энергии только в крайних случаях?

3. Почему белок коллаген, входящий в состав волокнистой структуры, находящийся в тканях кожи, добавляют в косметические кремы по уходу за кожей?

4. Почему пересаженные органы: почки, печень часто отторгаются у пациентов?

5. Шерсть содержит белок кератин, почему при стирке в воде с t° = 90° -100 шерсть садится?

V. Этап информации о домашнем задании (слайд 12)

Задание на дом: §1.5, вопросы 1 — 5, стр. 29.

По желанию подготовить сообщения: «Антитела – наши защитники», «Белки – ферменты», «Белки – гормоны».

VI. Этап подведения итогов занятия

VII. Этап рефлексии (слайд 13)

Оцените свою работу на уроке, закончив следующие предложения: (на слайде)

Больше всего мне понравилось……..

Теперь я буду знать………

Сегодня я понял (а), что ………..

Белка (Урок 4)

Вступление

Что вы думаете, когда слышите слово протеин ? Мясо? Бобы? Сильный? Жизнь? Многие думают о мышцах и фитнесе. Белки действительно имеют какое-то отношение к жизни и жизнеспособности, потому что они являются необходимым компонентом каждой клетки.Белки необходимы человеку для роста и борьбы с инфекциями и болезнями.


Вы состоите из белка. Части вашего тела состоят из белков — даже те внутренние части, которые вы не видите. Гены, гормоны и ферменты также являются белками.

Греческое слово белок означает «первое место». Иногда мы придаем большое значение белкам по сравнению с двумя другими классами питательных веществ, которые дают нам энергию — углеводами и жирами. Возможно, мы выросли с мыслью, что еда — это не еда, если в нее не входит мясо.Планируя свое питание, мы можем сначала подумать о том, какое мясо мы будем есть, а затем выбрать другие продукты, которые будут к нему добавлены. Теперь мы знаем, что нам нужно планировать свое питание в обратном порядке — планировать прием пищи, чтобы включить сложные углеводы, такие как цельнозерновой хлеб и крупы, овощи, фрукты, молоко, а затем, возможно, добавить немного мяса. Здоровое питание основано на продуктах растительного происхождения; добавление небольшого количества животного белка улучшает качество белка.

Есть много разных видов белков. Все питательные вещества, которые дают нам энергию, такие как белки, углеводы и жиры, состоят из углерода, водорода и кислорода.Но азот есть только в белках. Это делает структуру и роль в здоровье особенными. Азот необходим для жизни.

Что вы узнаете

Из этого урока вы узнаете, что белок — это нутриент.Вы узнаете, как он устроен (структура) и каковы его функции. Вы узнаете, какие продукты содержат белок, в том числе продукты животного и растительного происхождения, и какие продукты являются лучшими источниками белка для вашего тела. Обладая этой информацией, вы сможете решить, какие продукты будут лучшими источниками белка для вашей семьи.

MyPlate Обзор

MyPlate может помочь вам увидеть, какие продукты вы и ваша семья должны есть каждый день для хорошего здоровья.Продукты, которые вносят одинаковый питательный вклад, сгруппированы в основные пищевые группы. Он также сообщает вам, сколько еды нужно ежедневно.

MyPlate рекомендует получать наибольшее количество питательных веществ из растительной пищи — овощей, фруктов и цельнозерновых продуктов, таких как хлеб и крупы. Также рекомендуется ежедневно употреблять нежирное или обезжиренное молоко, йогурт или сыр. Хотя продукты животного происхождения вносят важный вклад в наш рацион, они являются источником насыщенных жиров. Ежедневное потребление рекомендованного количества калорий и выбор продуктов с низким содержанием жиров помогут вам избежать слишком большого количества насыщенных жиров в вашем рационе.Нам нужно есть немного мяса и много растительной пищи. Выбирайте растительную пищу с высоким содержанием белка.

Что такое белок?

Белок — один из трех макроэлементов, необходимых вашему организму для выживания.Макроэлементы — это питательные вещества, которые необходимы в больших количествах. Два других макроэлемента — это углеводы и жиры. Белки поставляют столько же энергии, что и углеводы. Один грамм белка обеспечивает четыре калории. Основная потребность организма — в энергии. Он игнорирует особые функции белков, если ему нужна энергия, а другой источник недоступен. Но мы не хотим полагаться на белки для получения энергии. Белки необходимо использовать для других важных функций, таких как построение тела, восстановление и поддержание тканей.Получение необходимого количества углеводов важно, чтобы белки не использовались в качестве источника энергии.

Что делают белки

• Строит и восстанавливает все ткани тела
• Регулировать процессы в организме
• Поддерживать баланс жидкости
• Форма гормонов и ферментов
• Помогает формировать антитела для борьбы с инфекцией
• Энергия

Белки являются частью каждой живой клетки.Многие виды белков образуют жизненно важные части тела. Примеры включают мышцы, кожу, белки крови, ферменты и гормоны.

Если не считать воду, то белок — это самое большое количество веществ в вашем теле. Примерно половину вашего сухого веса составляют белки. Около одной трети белка находится в мышцах, а примерно пятая — в костях и хрящах. Примерно десятая часть находится в коже. Остальное находится в других тканях и жидкостях организма. В крови содержится несколько десятков белков. Гемоглобин, один из белков крови, переносит кислород из легких в ткани и возвращает углекислый газ из тканей в легкие.Большая часть молекулы гемоглобина — это белок.

Рост и поддержание — Нам нужны белки для роста и поддержания. В нашей жизни бывают особые периоды, когда нам нужно больше белка. К ним относятся периоды быстрого роста, например, в младенчестве, детстве, подростковом возрасте, беременности и кормлении грудью. Наша потребность в белке увеличивается, когда мы больны, восстанавливаемся после травмы или операции. Белки в тканях организма находятся в постоянном обменном состоянии. Некоторые молекулы всегда разрушаются, а другие строятся в качестве замены.Этот постоянный оборот объясняет, почему наша диета должна ежедневно обеспечивать достаточное количество белка, даже если он нам больше не нужен для роста.

Баланс жидкости — Белки регулируют процессы в организме для поддержания баланса жидкости. Белки в крови называются , альбумин, и , глобулин, , и они помогают поддерживать водный баланс организма, удерживая воду в крови. Белки крови обладают способностью притягивать и удерживать жидкость в кровотоке. Если человек не ест достаточно белка, со временем количество белка в крови уменьшается.Затем артериальное давление может вытеснить избыточную жидкость из кровеносных сосудов в промежутки между клетками. По мере того, как в этих пространствах скапливается все больше и больше жидкости, возникают отеки или опухоли. Другие состояния, такие как беременность и сердечная недостаточность, также могут привести к отеку. Если человек страдает от белковой недостаточности и получает белок вместе с другими необходимыми питательными веществами, его организм может производить больше белков крови. Затем жидкость притягивается обратно в кровоток, и опухоль или отек исчезают. Белки помогают в обмене питательными веществами между клетками и жидкостями между клетками.

Гормоны и ферменты — Белки образуют гормоны и ферменты. Многие химические вещества, называемые гормонами, являются белками. Гормоны контролируют такие процессы, как рост, развитие и размножение. Гормон щитовидной железы регулирует скорость обмена веществ в организме. Гормон инсулина регулирует концентрацию глюкозы в крови и ее транспортировку в клетки, что необходимо для работы мозга и нервной системы.

Почти все ферменты — это белки. Они ускоряют химические реакции в каждой клетке.Без ферментов клетки не могли бы функционировать.

Иммунная система — Белки помогают формировать антитела для борьбы с инфекцией. Антитела — это белки в крови, которые помогают защитить организм от болезней. Это гигантские белковые молекулы, которые циркулируют в крови и представляют собой защиту от вирусов, бактерий и других чужеродных агентов. Когда в ваше тело вторгается вирус, он проникает в клетки и там размножается. Если бы вирусы могли размножаться и причинять вред вашему организму, они вскоре подавили бы его вызываемой ими болезнью, будь то грипп, корь, оспа или простуда.

Как только организм вырабатывает антитела против определенного возбудителя болезни, такого как грипп, клетки никогда не забывают, как их вырабатывать. В следующий раз, когда вирус вторгнется в организм, антитела ответят еще быстрее. Так организм приобретает иммунитет против болезней, которым он подвержен.

Кровь свертывание — Кровь представляет собой жидкость, но может стать твердой в течение нескольких секунд, когда вы получите порез. Когда вы порезаетесь, быстрая цепочка событий приводит к выработке фибрина , тягучей нерастворимой массы белковых волокон, которая закупоривает порез и останавливает утечку.Позже, более медленно, образуется рубец, который заживает порез.

Видение — Клетки сетчатки глаза содержат светочувствительные пигменты, состоящие из белка. Белок реагирует на свет, изменяя свою форму, тем самым инициируя нервные импульсы, которые несут зрение в высшие центры мозга.

Энергия — Белки могут снабжать ваше тело энергией, но ваше тело предпочитает использовать энергию углеводов и сохранять белок для своих важных функций, как обсуждалось выше.Около 10 процентов энергии тела поступает из белков. Большинство клеток охотнее используют углеводы и жиры для получения энергии. Обязательно получайте калории, необходимые для удовлетворения ваших энергетических потребностей, чтобы вашему телу не приходилось использовать белок в качестве источника энергии.

Аминокислоты в белках

Белки состоят из строительных блоков, называемых аминокислот .Белки в пище и в вашем теле состоят из 20 различных аминокислот. 20 распространенных аминокислот в нашем рационе собраны в тысячи различных белков, необходимых организму. Аминокислоты образуют строительные блоки белков. То, как аминокислоты соединены или расположены, зависит от того, какой белок сделан. Всего в одной клетке вашего тела может существовать 10 000 различных белков. У каждого белка будет разное расположение аминокислот. Все аминокислоты содержат углерод, водород, кислород и азот.Иногда они также содержат серу. Группа аминокислот, скрепленных связями, образует белок.


Белки в пище, которую вы едите, расщепляются внутри вашего тела на аминокислоты. Когда вы едите белковую пищу, белок разделяется на множество скоплений аминокислот. Затем сгустки разделяются на отдельные аминокислоты, которые всасываются из кишечника и переносятся кровью в печень. Как только они покидают печень и переносятся кровью в разные ткани, они снова собираются в особые комбинации, которые заставляют белки заменять изношенный клеточный материал, добавлять в ткани, которые должны расти, или производить какой-либо фермент или гормон. или другое активное соединение.Если какие-либо аминокислоты остались, они не могут быть сохранены в организме для дальнейшего использования. Вместо этого они возвращаются в печень.

Виды и количества аминокислот в белке определяют его питательную ценность. Мы получаем белок как из животных, так и из растительных продуктов. В каменном веке наши предки получали большую часть белка из растений. Много позже наши предки начали есть мясо. Сегодня большая часть белков, которые мы едим, поступает из продуктов животного происхождения.

Некоторые аминокислоты являются «незаменимыми» (необходимы в диете), а некоторые — «несущественными» (не являются обязательной частью диеты).Незаменимые аминокислоты не могут образовываться в организме, поэтому получать их нужно с пищей.

Белки животного происхождения, такие как мышцы животных (мясо), молоко и яйца, могут поставлять все аминокислоты примерно в тех же пропорциях, в которых они необходимы. Они оцениваются как имеющие высокую питательную ценность. Белки животного происхождения считаются высококачественными белками или полноценными белками . Они могут поддерживать рост и поддержание организма, поскольку содержат все незаменимые аминокислоты в достаточном количестве.Продукты животного происхождения, такие как мясо, птица, рыба, молоко, яйца и сыр, считаются полноценными источниками белка.

Растительные белки обычно считаются «белками низкого качества» или неполными белками . Им не хватает одной или нескольких незаменимых аминокислот. Однако соответствующие комбинации растительной пищи могут обеспечить достаточное количество всех незаменимых аминокислот.


Комплементарные белки — это два или более неполных источника белка, которые вместе обеспечивают адекватное количество всех незаменимых аминокислот.Например, рис содержит небольшое количество некоторых незаменимых аминокислот. Однако эти же незаменимые аминокислоты в большем количестве содержатся в сухих бобах. И наоборот, сухие бобы содержат меньшее количество других незаменимых аминокислот, которых нет в рисе в достаточном количестве. Эти два продукта вместе могут обеспечить достаточное количество всех незаменимых аминокислот, в которых нуждается организм. Если продукты животного происхождения не входят в ваш список покупок, то вы можете удовлетворить свои потребности в белке, ежедневно употребляя разнообразную белковосодержащую растительную пищу.Поэтому, когда вы едите красную фасоль и рис, вам не нужен стакан обезжиренного молока, чтобы получить необходимый белок. Также не обязательно есть ветчину или другое мясо с красной фасолью.

Раньше считалось, что дополнительные белки нужно есть за один прием пищи, чтобы ваше тело могло использовать их вместе. Исследования показывают, что ваше тело может комбинировать дополнительные белки, которые потребляются в течение одного дня.

Как правило, поскольку американцы регулярно употребляют в пищу продукты, содержащие белки с высокой питательной ценностью, им не нужно беспокоиться об адекватности получаемых ими аминокислот.Скорее, проблема связана с потреблением слишком большого количества белка из животных источников, которые, как правило, более дороги и содержат больше насыщенных жиров, чем растительные источники. Поскольку в нашем рационе содержится много насыщенных жиров, лучше выбирать нежирные куски мяса.

«Чужая» ДНК впервые создает белки в живых клетках

Последние несколько миллиардов лет жизнь работала с узким словарным запасом.Теперь исследователи нарушили эти правила, добавив лишние буквы к ограниченному лексикону биологии.

Химик Флойд Ромесберг из Исследовательского института Скриппса в Ла-Хойя, Калифорния, и его коллеги манипулировали бактериальными клетками Escherichia coli , чтобы включить в их ДНК два типа чужеродных химических оснований или букв. Затем клетки использовали эту информацию, чтобы вставить неприродные аминокислоты во флуоресцентный белок.

Организмы естественным образом кодируют наследуемую информацию, используя всего четыре основания: аденин (A), тимин (T), цитозин (C) и гуанин (G).Они образуют пары, которые удерживают вместе двойную спираль ДНК, и различные трехбуквенные последовательности кодируют каждую из 20 аминокислот, из которых состоят белки в живых клетках. Новая работа — первая, показывающая, что неестественные основания могут быть использованы для создания белков в живой клетке.

По словам Ромесберга, это достижение показывает, что синтетическая биология — область, сфокусированная на наделении организмов новыми чертами — может достигать своих целей, заново изобретая самые основные аспекты жизни. «Нет биологической системы, столь фундаментальной и более тесно связанной с тем, чем мы являемся, чем хранение и поиск информации», — говорит он.«Мы разработали новую деталь, которая будет работать вместе с существующими и может делать все, что они делают».

Расширения алфавита

Несколько команд пытаются расширить генетический код. Четыре естественных основания ДНК могут быть расположены в 64 различных трехбуквенных комбинациях, называемых кодонами, которые определяют аминокислоты. Но избыточность в этом коде — например, CGC, CGA, CGG и CGT — все обозначают аминокислоту аргинин — означает, что почти все белки, необходимые для жизни, состоят всего из 20 аминокислот.

Исследователи, включая генетика Джорджа Черча из Гарвардской медицинской школы в Бостоне, штат Массачусетс, работают над перепрофилированием избыточных кодонов для определения новых аминокислот. Группа Ромесберга изучает другую стратегию: добавление совершенно новой пары оснований в ДНК. Это значительно увеличило бы количество возможных кодонов, теоретически давая клеткам возможность использовать более 100 дополнительных аминокислот.

Хотя Черч по-прежнему считает, что его собственный подход более практичен для большинства приложений, он описывает новую работу как «веху в исследовании фундаментальных строительных блоков жизни».

Исследователи впервые представили расширенный генетический алфавит в начале 1960-х годов. Первый большой успех пришел в 1989 году, когда группа под руководством химика Стивена Беннера из Швейцарского федерального технологического института в Цюрихе создала молекулы ДНК, содержащие модифицированные формы цитозина и гуанина. Эти «забавные» буквы ДНК, как их назвал Беннер, могут реплицироваться и производить РНК и белки в реакциях в пробирках.

Funnier DNA

За последние два десятилетия команда Ромесберга создала сотни еще более забавных молекул ДНК.В отличие от обычных пар оснований в ДНК и пар оснований, созданных командой Беннера, которые связаны вместе общими атомами водорода, эти чужеродные основания держатся вместе из-за их нерастворимости в воде, в значительной степени имитируя образование комков жира в воде.

Однако для функционирования в живых клетках пары чужеродных оснований должны располагаться рядом с естественными основаниями, не нарушая форму ДНК и не нарушая важные задачи, такие как процессы, которые точно копируют ДНК и транскрибируют ее в информационную РНК — промежуточную молекулу между ДНК. и белки.В 2014 году лаборатория Ромесберга сообщила о прорыве: штамм E. coli с петлей ДНК, содержащей одну неестественную пару оснований. «Чужая ДНК» была сделана из химикатов, названных dNaM и d5SICS (обозначенных X и Y соответственно). Но клетки делились медленно и со временем теряли чужеродную ДНК.

В статье, опубликованной ранее в этом году, команда Ромесберга создала более здоровую полусинтетическую E. coli , которая не так легко отвергала чужеродную ДНК (в этой версии d5SICS был заменен химическим веществом аналогичной формы под названием dTPT3).Однако этот штамм, как и тот, о котором сообщалось в 2014 году, не обладал способностью использовать свои новые кодоны.

В последнем исследовании, опубликованном 29 ноября в журнале Nature , команда создала здоровые клетки, которые, наконец, могут использовать свою чужеродную ДНК. В отдельных экспериментах клетки включали две неприродные аминокислоты (так называемые PrK и pAzF) в белок, излучающий мягкое зеленое свечение. И чужеродные основания, и аминокислоты подавались в клетки, и любой организм, который каким-то образом сбежал из лаборатории, не смог бы их произвести.Чтобы позволить клеткам использовать эти новые компоненты, исследователи создали модифицированные версии молекул, называемых тРНК, которые читают кодоны и переправляют соответствующие аминокислоты на фабрики белков клетки — рибосомы.

Новые аминокислоты не изменили форму или функцию зеленого флуоресцентного белка. Но «теперь, когда мы можем хранить и извлекать информацию, — говорит Ромесберг, — давайте что-нибудь с ней сделаем». В неопубликованной работе его команда вставила пару чужеродных оснований в ключевой сайт гена, ответственного за устойчивость к антибиотикам.Бактерии, которые выделяют чужеродную ДНК, становятся чувствительными к препаратам, связанным с пенициллином.

Магазин сладостей

Ромесберг основал биотехнологическую компанию Synthorx, также в Ла-Хойя, которая пытается включить неестественные аминокислоты в препараты на основе белков, такие как IL-2, белок, регулирующий количество белых кровяных телец. Такой подход можно использовать для создания лекарств, которые, например, легче усваиваются клетками, менее токсичны или быстрее разрушаются.Белки также могут иметь свойства, которых не хватает обычным аминокислотам, например способность сильно притягивать электроны. «Это как быть ребенком в кондитерской, — говорит Ромесберг. Но в данном случае «ребенок 20 лет фантазировал о том, как попасть в эту кондитерскую. Внезапно я задумываюсь, какие конфеты я могу получить».

Команды во главе с Беннером и Ичиро Хирао, химиками-биологами из Института биоинженерии и нанотехнологий в Сингапуре, уже разработали системы пробирок для использования чужеродной ДНК для кодирования неестественных аминокислот.Но Хирао видит преимущества перехода в живые клетки. По его словам, белки, содержащие неприродные аминокислоты, можно было бы производить в больших масштабах и с меньшими затратами, используя бактериальные клетки. Внедрение этой технологии в эукариотические клетки также позволит разработать новые лекарственные препараты на основе антител.

Однако Беннер, который сейчас работает в Фонде прикладной молекулярной эволюции недалеко от Гейнсвилла, Флорида, предполагает, что, поскольку система Ромесберга опирается на относительно слабые гидрофобные силы, удерживающие вместе пары чужеродных оснований, ее потенциал для промышленного применения может быть ограничен.Клетки могут терпеть редкую чужеродную основу, говорит Беннер, но «из них просто невозможно построить целую генетическую систему».

Ромесберг и его коллеги сейчас работают над дальнейшим расширением своего генетического алфавита. На данный момент команда определила еще 12 кодонов, содержащих X и Y, которые являются функциональными, говорит Ромесберг, но «еще многое предстоит сделать».

Эта статья воспроизводится с разрешения и была впервые опубликована 29 ноября 2017 года.

Вехи в правилах жизни — от генов до белков | NSF

Национальный научный фонд (NSF) планирует поддерживать конвергенцию исследований в различных дисциплинах, включая молекулярную биологию, информатику, инженерию и науку о поведении, чтобы проводить исследования того, как функционирует жизнь.Эта смелая инициатива могла бы, например, повысить способность предсказывать наблюдаемые характеристики живого существа на основе генетической и экологической информации. «Понимание правил жизни» — одна из 10 больших идей NSF, обнародованных в 2016 году. Это следующий рубеж в науках о жизни, освоение которых предоставит новые знания о растениях, животных и людях, которые могут помочь прогнозировать риск заболеваний, улучшать сельское хозяйство и укреплять здоровье нации.

Загадка ДНК для белка

Поиски понять фундаментальные правила жизни начались, когда Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик с помощью рентгеновского снимка Розалинды Франклин описали двойную спираль дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в 1953 году и заявили, что ДНК несет в себе генетический код. .Длинные двойные цепи ДНК состоят из нуклеотидных оснований, и было предложено, что три пары оснований на двойной спирали являются кодом (кодоном) для аминокислоты. Аминокислоты — это строительные блоки, которые связаны между собой пептидными связями с образованием пептидов и гораздо более длинных и более сложных белков во всех живых существах.

Подпись под фото: Франсуа Жакоб и Жак Моно с Андре Львоффом (1965).

Изображение: Джейкоб (в белом халате), Моно и Львофф (в белом халате), лауреаты Нобелевской премии 1965 года по физиологии и медицине, стоят и болтают в научной лаборатории Института Пастера.

Кредит: Институт Пастера / Архив Агнес Ульманн

Наши структурные элементы, включая кожу, волосы и мышцы, состоят из белков. Наши внутренние органы и ткани, такие как сердце и печень, а также ферменты, гормоны и рецепторы, которые выполняют физиологические функции нашего тела, являются белками или пептидами. По сути, пептиды и белки делают нас такими, какие мы есть как живые существа и как личности. Итак, после понимания роли ДНК в правилах жизни возник следующий вопрос: как ДНК заставляет живую клетку собирать необходимые аминокислоты и синтезировать определенный пептид или белок?

В конце 1950-х — начале 1960-х годов NSF стимулировал конвергенцию исследований в области биологии, биохимии, органической химии и физики, чтобы раскрыть отдельные этапы, участвующие в синтезе пептидов и белков.Это способствовало рождению молекулярной биологии как научной дисциплины и принесло Нобелевскую премию четырем исследователям, работа которых была напрямую поддержана NSF.

Аппарат для синтеза белка

К 1955 году ученые выяснили, что белки синтезируются в специализированных структурах клетки, называемых рибосомами. Рибосомы состояли из рибонуклеиновых кислот (РНК) и не содержали ДНК. Поэтому маловероятно, что они использовали ДНК непосредственно в качестве матрицы для создания белков.

Надпись: Шаги в правилах жизни от ДНК через мРНК до белка.

Изображение: схематическое изображение открытия Моно транскрипции генетического кода из ДНК в информационную РНК, открытие Джейкоба, что каждый транскрибируемый код транслируется в рибосоме как конкретная аминокислота, описание Холли транспортной РНК и его роль в транспортировке определенных аминокислот к рибосоме и в образовании пептидной связи между растущим пептидом и определенной аминокислотой.Это также показывает взлом генетического кода Ниренбергом и синтез ДНК и РНК Хораной. Красные восьмиугольники идентифицируют Моно, Джейкоба, Холли и Хорана как исследователей, поддерживаемых NSF и получивших Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Кредит: Пол Ларти, AAAS-STPF / NSF

Итак, в 1961 году Жак Моно из Института Пастера и его коллега Франсуа Жакоб, исследования которого поддерживались NSF с 1959 года, предположили существование временного посредника или «посланника», который переносил информацию от ДНК к рибосоме для «трансляции». «в белок.Позже они продемонстрировали, что сообщение, кодирующее аминокислоты, из которых состоят структуры пептидов и белков, было сначала транскрибировано с ДНК на матрицу РНК, которую они назвали информационной РНК (мРНК). Сообщение впоследствии было перенесено с помощью мРНК в рибосомы и транслировалось для создания указанных белков.

Моно и Джейкоб были удостоены Нобелевской премии 1965 года по физиологии и медицине совместно с Андре Львоффом, чья работа была посвящена бактериальным вирусам «за их открытия, касающиеся генетического контроля ферментов и синтеза вирусов.«

Взлом генетического кода

Осталась пара ключевых вопросов: как выглядело сообщение и как аминокислоты были собраны для образования белка? Эти вопросы вызвали волну исследовательской активности в гонке «взломать генетический код».

Подпись: Роберт Холли (слева) и группа исследователей из Службы сельскохозяйственных исследований и Корнельского университета (ок. 1964-1968).

Изображение: Фотография Холли (в белой рубашке) с пятью другими исследователями (в белых халатах) в лаборатории, держащей и исследующей длинную бумажную ленту, представляющую нить рибонуклеиновой кислоты.

Кредит: Соль Голдберг

Большой прорыв произошел, когда Маршалл Ниренберг из Национального института здравоохранения провел эксперимент с использованием синтетической цепи мРНК, полностью состоящей из урацила (U) основания нуклеиновой кислоты. Он использовал цепь для управления синтезом пептидов в клеточном экстракте и продемонстрировал, что вновь полученный пептид полностью состоит из аминокислоты фенилаланина. Это наблюдение в сочетании с гипотезой о том, что генетический код представляет собой серию из трех оснований ДНК, привело к выводу, что кодоном мРНК для фенилаланина был UUU.Таким образом, Ниренберг систематически расшифровал генетические коды всех 20 аминокислот, обнаруженных в пептидах и белках.

Между тем, исследование бывшего научного сотрудника NSF Роберта Холли из Корнельского университета показало, что экстракты пекарских дрожжей или клеток печени крысы содержат 20 различных, но родственных РНК, которые могут катализироваться определенными ферментами для реакции с аминокислотами. Холли предположил, что реакция активирует аминокислоты, позволяя им образовывать пептидные связи.Он предположил, что эти специальные РНК «переносят» определенные аминокислоты в свои кодоны на матрице мРНК, и, следовательно, описал их как транспортную РНК (тРНК). К концу 1964 года при поддержке NSF Холли выделил и определил химическую структуру специфической т-РНК, функция которой заключалась в доставке аминокислоты аланина к рибосоме при кодировании мРНК.

Собираем все вместе

Гобинд Хорана из Висконсинского университета объединил все это воедино, сосредоточив свои исследования при поддержке NSF на химическом синтезе ДНК и РНК.

Хорана синтезировал несколько шаблонов ДНК, чтобы подтвердить, что кодоны действительно состоят из трех пар оснований ДНК. Он продемонстрировал, что экстракты клеток могут использовать синтетическую ДНК для создания ДНК-подобных двойных спиралей и получения пептидов с использованием синтетической мРНК в качестве матриц. Позднее Хорана синтезировал ген дрожжевой аланиловой тРНК, которая переносит аланин на рибосому. Это был первый полный синтез гена, изначально обнаруженного в природе. В 1968 году Хорана разделила Нобелевскую премию по физиологии и медицине с Холли и Ниренбергом «за интерпретацию генетического кода и его функции в синтезе белка.«

Таким образом, за короткий головокружительный период в науке между 1953 и 1964 годами, когда дисциплины сблизились, были открыты фундаментальные жизненные процессы репликации ДНК, ее транскрипции в мРНК и тРНК и трансляции мРНК в белок.

Подпись: Гобинд Хорана в своей лаборатории (ок. 1950-1960).

Изображение: Фотография Хорана в белом лабораторном халате, стоящего за лабораторным столом и работающего с хроматографической колонкой.

Кредит: Коллекция Университета Висконсин-Мэдисон

Следующая важная веха в «Понимании правил жизни» может быть реализована в короткие сроки, поскольку NSF снова поддерживает конвергенцию мощных передовых дисциплин с этой целью.

Анализ взаимодействия белков RAS в живых клетках показывает механизм истощения пан-RAS с помощью мембранно-направленных связывающих RAS

Значение

RAS-белки, критические регуляторы роста и дифференцировки клеток, являются наиболее часто мутирующими онкогенами у людей. РАС действует как димеры / сокластеры на клеточных мембранах. Мы разработали улучшенный анализ комплементации расщепленной люциферазы в сочетании с мощной генетической системой, чтобы показать, что совместная локализация в одном и том же мембранном домене позволяет образовывать димеры / сокластеры RAS с самим собой и с другими ассоциированными с мембранами белками.Взаимодействия, облегчаемые мембранными ассоциациями (MAFI), недостаточны для RBD-опосредованного ингибирования Ras, что дополнительно требует взаимодействий, опосредованных доменом высокой аффинности. Примечательно, что мы показываем, что MAFI усиливает влияние доменных взаимодействий, вызывая опосредованное аутофагией / лизосомами элиминацию нефункциональных комплексов RAS. Эта широко применяемая стратегия позволяет обнаруживать низкоаффинные белковые взаимодействия, опосредованные мембранным связыванием, и анализировать их влияние на биологическую функцию.

Abstract

HRAS, NRAS и KRAS4A / KRAS4B составляют семейство RAS малых GTPases, которые регулируют сигнальные пути, контролирующие пролиферацию, дифференцировку и выживание клеток. Нарушения пути РАС вызывают нарушения развития и рак. Мы обнаружили, что KRAS4B колокализуется на клеточной мембране с другими изоформами RAS и подмножеством пренилированных малых членов семейства GTPase, используя количественный анализ комплементации расщепленной люциферазы живых клеток. Кокластеризация белков RAS в основном опосредуется взаимодействиями, облегчаемыми мембранными ассоциациями (MAFI).Используя взаимодействие RAS-RBD (CRAF-связывающий домен RAS) в качестве модельной системы, мы показали, что одного MAFI недостаточно для индукции RBD-опосредованного ингибирования RAS. Неожиданно мы обнаружили, что высокоаффинные мембранные связывающие белки, нацеленные на RAS, ингибируют активность RAS и истощают белки RAS через путь деградации, опосредованный аутофагосомами и лизосомами. Наши результаты предоставляют механизм для регулирования активности РАС и уровней белка, более подробное понимание которого должно привести к терапевтическим стратегиям ингибирования и истощения онкогенных белков РАС.

Клеточные пути передачи сигнала реализуются посредством множества временных и динамических межбелковых взаимодействий (PPI). Сродство связывания PPI (или константы диссоциации) обычно находится в диапазоне от микромолярного до миллимолярного (1). PPIs в пути RAS-MAPK, одном из наиболее мутировавших онкогенных путей при раке человека, иллюстрируют важность временных и слабых взаимодействий белков для регуляции сети. Семейство малых GTPase RAS состоит из четырех изоформ, KRAS4A / KRAS4B (варианты сплайсинга), HRAS и NRAS, которые имеют 90% сходства в N-концевом каталитическом G-домене (2).Белки RAS могут образовывать гомодимеры или нанокластеры на внутренней поверхности плазматической мембраны (3, 4). Вычислительные и биофизические исследования показывают, что сродство к димеризации KRAS варьируется от миллимолярного до микромолярного (5, 6). Однако клеточная концентрация белков RAS оценивается от 0,033 до ∼0,5 мкМ (7). Это значительно меньше, чем концентрация белка RAS, необходимая для спонтанной димеризации. Следовательно, клетки должны иметь механизм, позволяющий сближать белки RAS с целью увеличения их локальных концентраций и ограничения случайного перемешивания белков (8), чтобы обеспечить образование димера / нанокластера RAS.

Один из возможных механизмов, способствующих близости белков и увеличения эффективной молярности белков с низким содержанием, включает нацеливание и локализацию в двумерной плоскости мембраны (9). Важно отметить, что пренилирование белков на С-терминальном гипервариабельном мотиве RAS-CAAX (HVR-CAAX) одновременно необходимо и достаточно, чтобы способствовать прикреплению RAS к мембране и эффекторному взаимодействию для активации передачи нижестоящего сигнала (10, 11). Совсем недавно было показано, что мотив RAS HVR-CAAX опосредует прикрепление к мембране и делает возможной димеризацию присоединенного флуоресцентного белка (4).Однако еще предстоит определить, является ли слабое внутреннее сродство между независимыми протомерами RAS достаточным, чтобы способствовать и поддерживать образование димера RAS (12). Кроме того, хотя домен димеризации (DD), слитый с KRAS, может усиливать передачу сигналов ниже по течению в присутствии химического димеризатора (4), вопрос о том, регулируются ли функции RAS с помощью слабых взаимодействий между белками RAS в димерах / нанокластерах в клеточной мембране, остается значительным пробелом. в нашем понимании этого важного онкогенного пути.

RAS-белки также временно и обратимо взаимодействуют с различными нижестоящими эффекторными белками, которые связываются с микромолярным и наномолярным сродством (13). Среди них взаимодействие между активированным RAS-GTP и RAS-связывающим доменом (RBD) белков RAF играет центральную роль в регуляции пути передачи сигналов ERK-MAPK (14). Критически важные аминокислоты, которые обеспечивают энергию связи для стабилизации взаимодействия в комплексе RAS-RBD, были четко определены, и были описаны мутации, которые снижают сродство к димеризации и дестабилизируют комплекс RAS-RBD (15, 16).Здесь мы улучшили систему на основе расщепленной люциферазы, чтобы обеспечить обнаружение слабых и временных белковых взаимодействий в пути RAS-MAPK, когда белки экспрессируются на физиологическом уровне, а взаимодействия оцениваются в живых клетках в режиме реального времени. Мы также определяем, может ли внутреннее сродство к димеризации, измеренное с помощью вычислительных и биофизических методологий in vitro, способствовать образованию димеров / нанокластеров RAS in vivo. Этот подход также позволил нам установить, в какой степени локализация клеточной мембраны необходима для димеризации / кластеризации белков RAS в живых клетках.Наконец, мы использовали хорошо изученное взаимодействие RAS-RBD в качестве модельной системы, чтобы исследовать, влияет ли слабое внутреннее сродство между RAS-RAS комплексами на клеточной мембране на передачу сигналов RAS ниже по течению. Наши результаты раскрывают ранее непредвиденный опосредованный аутофагосомами-лизосомами механизм, с помощью которого клетки могут устранять непродуктивные комплексы, образованные взаимодействием RAS и плотно связывающимися RBD или сконструированными RAS-связывающими белками. Эти исследования имеют значение для создания класса антагонистов пан-РАС.

Результаты

Количественный анализ ReBiL2.0.

Анализы комплементации белковых фрагментов, такие как комплементация расщепленной люциферазы (1/2luc) (или комплементация бимолекулярной люциферазы [BiLC]) (17⇓⇓ – 20), позволяют анализировать ИПП в различных биологических процессах. Однако были высказаны опасения по поводу того, может ли остаточная энергия связывания между фрагментами 1/2luc вызывать или способствовать восстановлению фрагментов 1/2luc без необходимости в слитых взаимодействующих белках, взаимодействие которых предполагается анализировать.Учитывая, что конструкция слияния 1 / 2luc количественно восстанавливает константу диссоциации ( K _d ) для известных белковых интеракторов, свободная энергия (Δ G ) очень мала (17). Основываясь на анализе ошибок анализа, мы можем установить нижний предел сродства связывания для пары 1/2luc 600 мМ ( SI Приложение , дополнительное примечание). Поскольку сродство связывания большинства клеточных PPI обычно варьируется от микромолярного до наномолярного (1), чрезвычайно низкое сродство фрагментов 1/2luc вряд ли будет вносить значительный вклад в самосборку.Мы проверили это экспериментально в контрольных исследованиях, используя только фрагменты 1/2luc в качестве отрицательного контроля (см. Ниже). Таким образом, восстановленные люминесцентные сигналы должны управляться слитыми белками-кандидатами или другими клеточными событиями, такими как совместная локализация белков-кандидатов, при которой их эффективная молярность может быть увеличена (9).

Выход люминесцентного сигнала в анализах BiLC зависит не только от аффинности связывания пар кандидатов PPI, слитых с фрагментами 1/2luc, но также от уровней, на которых они экспрессируются.Следовательно, на точное сравнение сигналов BiLC между разными парами PPI могут влиять разные уровни, на которых экспрессируются слитые белки 1/2luc (Fig. 1 A ). Мы преодолели эту потенциальную ловушку, нормализовав люминесцентный сигнал к количеству экспрессированных слитых белков 1/2luc, которые генерируют люминесцентный сигнал (Рис.1 B и C ). Мы называем это усовершенствование оригинального подхода ReBiL (BiLC, усиленного рекомбиназой) (20) как ReBiL2.0 (рис.1 D ; см. Материалы и методы для подробного объяснения ReBiL2.0).

Рис. 1.

Разработка теста ReBiL2.0. ( A ) Необработанный люминесцентный сигнал, сообщаемый исходным анализом ReBiL, не обязательно отражает аффинность пары PPI, поскольку сигналы ReBiL зависят как от аффинности связывания взаимодействующих белков, так и от уровней, на которых они экспрессируются. То есть сигналы, генерируемые низкоаффинным и высокопоставленным белковым взаимодействием (представленные парами светло-зеленых точек), могут генерировать люминесцентные сигналы, аналогичные сигналам, возникающим в результате взаимодействий с высоким сродством и низким содержанием белков (представленных парами темно-зеленых точек).( B ) ReBiL2.0 исправляет эту потенциальную ловушку, нормализуя необработанный люминесцентный сигнал до выраженного уровня каждого слитого белка 1/2luc. Количество каждого слитого белка 1 / 2luc и контроля нагрузки (актина) определяли количественно путем зондирования вестерн-блоттинга антителами против НА и против актина одновременно с использованием двухканальной системы LI-COR Odyssey ( Left ). ( C ) Хотя и контролируется одним и тем же двунаправленным промотором TRE (элемент ответа на тетрациклин), слитые белки 1 / 2luc не всегда экспрессируются в стехиометрическом соотношении 1: 1.Таким образом, максимальный люминесцентный выход, генерируемый восстановленной сплит-люциферазой, определяется наименее обильным слиянием 1 / 2luc [минимум 1 / 2luc], когда слияния 1 / 2luc не выражены в стехиометрии 1: 1. Поскольку каждый слитый белок 1/2luc содержит одну копию метки HA-эпитопа в линкерной области (фиг. 2 A ), количественный вестерн-блоттинг с антителом против HA позволяет точно определить их относительные уровни экспрессии, как показано на В . ( Д ) РЕБИЛ 2.0 формула. Необработанный сигнал ReBiL [Raw ReBiL Luminescence] измеряется люминометром. Затем относительное количество жизнеспособных клеток в каждом образце измеряют с помощью CellTiter Glo [CellTiter Glo Luminescence (Cell #)] после завершения анализа ReBiL2.0. [1 / 2lucleast] и [загрузка ctrl] определяли по соответствующей интенсивности полос в вестерн-блоттинге с использованием системы LI-COR Odyssey ( SI, приложение , фиг. S2, , I и таблица S3).

Мы использовали анализ ReBiL2.0 для изучения взаимодействия между RAS и родственными белками в живых клетках.Поскольку RAS является мембраносвязанным белком, клеточную мембрану нельзя не учитывать при изучении ее взаимодействия с другими клеточными белками. В отличие от большинства биохимических и биофизических исследований in vitro, анализ ReBiL2.0 на основе клеток позволяет проводить количественные исследования взаимодействия белков между RAS и другими клеточными белками в физиологической среде, где также можно измерить активность RAS. Важно отметить, что ReBiL2.0 предлагает платформу для изучения таких сложных взаимодействий в реальном времени в живых клетках.

Мембранная ассоциация способствует совместной локализации KRAS с NRAS, HRAS и другими пренилированными белками.

KRAS4B может образовывать гомодимеры или нанокластеры на клеточных мембранах (3, 4). Сначала мы проверили подход ReBiL2.0 для системы RAS, оценив его способность захватывать димеры KRAS4B, возникающие в результате взаимодействия N-концевой расщепленной люциферазы (nl) и C-концевой расщепленной люциферазы (cl), присоединенной к N-концу KRAS4B (обозначено nl – KRAS4B и cl – KRAS4B соответственно, рис.2 A и B ). Эта конфигурация слияния сохраняет интактный C-концевой мотив HVR-CAAX, необходимый для пренилирования RAS, и сохраняет активность KRAS4B, как определено анализами трансформации роста фибробластов мыши NIH / 3T3 ( SI Приложение , Fig. S1 A ). При экспрессии на физиологически значимых уровнях ( SI Приложение , Рис. S1 B ), nl – KRAS4B и cl – KRAS4B генерировали устойчивые сигналы комплементации 1 / 2luc (Рис. 2 C и SI Приложение , Рис.S2 A ). Поскольку функциональное восстановление фрагментов 1/2luc требует минимального соотношения nl – KRAS4B и cl – KRAS4B 1: 1 (рис. 1 C ), мы интерпретируем эти результаты, чтобы указать, что KRAS4B минимально образует гомодимеры, что согласуется с предыдущими наблюдениями, выполненными с использованием ортогональный подход (4). Однако нельзя исключить образование кокластеров KRAS более высокого порядка (3).

Рис. 2.

Валидация ReBiL2.0 для анализа взаимодействия белков с изоформами RAS. ( A ) На диаграмме изображены конфигурация и номенклатура подмножества проанализированных слитых белков расщепленной люциферазы (1 / 2luc) KRAS4B.N-концевой 1 / 2luc (nl) или C-концевой 1 / 2luc (cl), за которым следовали линкер и метка HA-эпитопа, были слиты с N-концом KRAS для сохранения целостности и функции C-концевого HVR– CAAX домен. ( B ) Мембранная ассоциация облегчает взаимодействие nl-KRAS4B и cl-KRAS4B, которые восстанавливают функциональную люциферазу для генерации люминесцентных сигналов. ( C ) Анализ ReBiL2.0 показывает количественные гомо / гетеромерные образования между KRAS4B и всеми четырьмя изоформами членов семейства RAS (KRAS4B, KRAS4A, HRAS и NRAS).На гистограмме представлены количественные оценки ReBiL2.0, нормализованные к взаимодействию KRAS4B + KRAS4B (установлено на 100%). Один 1 / 2luc без партнеров по слиянию (n1 + cl) служил отрицательным контролем, показывающим фоновые значения для анализа ReBiL2.0, примененного к RAS. CVIM представляет собой последние 20 аминокислот из KRAS (KMSKDGKKKKKKSKTKCVIM). Данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 4).

Предыдущие исследования показали, что одиночная мутация Cys-to-Ser (KRAS4B_C185S) в мотиве фарнезилирования CAAX отменяет ассоциацию белков RAS с мембраной и инактивирует активность клеточной трансформации (21, 22).В соответствии с этим, одиночная мутация цистеина в мотиве nl – KRAS4B CAAX (nl – KRAS4B_C185S) предотвращает комплементацию 1/2luc (рис. 2 C и SI, приложение , рис. S2 B ). Вестерн-блоттинг-анализ показал, что отсутствие люминесцентного сигнала не связано с отсутствием экспрессии белка n1 – KRAS4B_C185S ( SI Приложение , рис. S2 I ). Этот результат подтверждает важность мембранной ассоциации для образования димера / кокластера KRAS4B на клеточных мембранах в живых клетках.Мы пришли к выводу, что слабое внутреннее сродство белков KRAS4B, измеренное с помощью анализов in vitro (5, 6), недостаточно для комплементации 1/2luc и, как следствие, образования димера / кокластера. Важно отметить, что фрагменты 1/2luc (n1 и cl) сами по себе не смогли генерировать люминесцентный сигнал выше фона, что подтверждает их чрезвычайно слабое внутреннее сродство (∼600 мМ) (рис. 2 C и SI Приложение , рис. S2 ). F и дополнительное примечание). Однако добавление каждого фрагмента 1/2luc к последним 20 аминокислотам из KRAS, которые определяют связывание мембраны KRAS4B (обозначенное как nl – CVIM и cl – CVIM), генерировало устойчивые люминесцентные сигналы (рис.2 C и SI Приложение , рис. S2 G ). Сходные результаты наблюдались при фотоактивированном локализационном микроскопическом анализе флуоресцентного белка mCherry, слитого с доменами HVR и CAAX KRAS4B (4). Вместе эти результаты демонстрируют, что очень слабое внутреннее сродство между мономерами KRAS4B, измеренное биохимическими и биофизическими анализами in vitro, недостаточно для стимулирования образования димеров / кокластеров RAS in vivo. Скорее, мы интерпретируем наши исследования, чтобы указать, что в физиологических условиях протомеры KRAS4B образуют тесно колокализованные белковые комплексы, управляемые мембранной ассоциацией.Мы предполагаем, что эта двумерная концентрация белка, обусловленная локализацией на мембране, обеспечивает достаточную энергию для детектируемого восстановления ферментативной люциферазной реакции. Таким образом, мы определяем такие зависимые от близости и внутренние аффинно-независимые взаимодействия белков как взаимодействия, облегчаемые мембранной ассоциацией (или MAFI).

Изоформы

RAS (KRAS4A / KRAS4B, HRAS и NRAS) имеют 90% идентичности последовательностей в своих N-концевых G-доменах, но гипервариабельные области, нацеленные на С-концевую мембрану (HVR), сильно расходятся (идентичность последовательностей 8%) (2 ).Мы спросили, могут ли эти разные HVRs направлять изоформы RAS в проксимальные мембранные домены, где может происходить MAFI-зависимая комплементация 1 / 2luc (см. SI Приложение , Fig. S2 для деталей анализа и необработанных данных). Удивительно, но все три белка cl-KRAS4A, cl-HRAS и cl-NRAS эффективно восстанавливали активность 1/2luc в сочетании с nl-KRAS4B (рис. 2 C и SI Приложение , рис. S2 C — E ). Кроме того, мы слили C-концевой мотив HVR-CAAX из каждой изоформы RAS с слитым белком n1-TagBFP, чтобы определить, достаточно ли одного HVR-CAAX для облегчения их взаимодействия.Действительно, каждая протестированная пара генерировала устойчивое дополнение 1 / 2luc ( SI Приложение , рис. S3 A ). Несколько более низкие сигналы комплементации 1 / 2luc от nl-TagBFP-HVR-CAAX могут быть результатом менее благоприятной белковой конфигурации партнера по взаимодействию n1-TagBFP для комплементации 1 / 2luc. Альтернативно, более высокие сигналы комплементации 1/2luc от полноразмерных изоформ RAS могут отражать вклад слабого сродства связывания между доменами RAS G, когда они привязаны и сконцентрированы в плазматической мембране.Эти результаты показывают, что различные изоформы RAS достаточно близко локализуются на мембранных доменах в клетках, чтобы обеспечить возникновение MAFI. Важно отметить, что индуцированные уровни экспрессии белков RAS в системе ReBiL были скорректированы так, чтобы они были как можно ближе к эндогенным (например, SI Приложение , Рис. S1 B ). Хотя наши результаты, измеренные в физиологически релевантных условиях в живых клетках, могут показаться несовместимыми с более ранними сообщениями о том, что изоформы RAS располагаются на разных мембранных микродоменах (3, 23, 24), более поздний анализ показал, что KRAS и HRAS могут объединяться посредством липид-опосредованного пространственного перекрестия. разговор (25).Таким образом, другая интерпретация состоит в том, что разные белки RAS могут занимать как разные, так и общие домены мембранной локализации in vivo, и что их близость открывает возможности для MAFI.

Значительная часть малых GTPases семейств RAS и RHO (гомологичные RAS) заканчиваются сигнальными мотивами фарнезилирования или геранилгеранилирования CAAX, которые важны для содействия мембранной ассоциации и субклеточной локализации (26). Основываясь на результатах, представленных выше, мы определили, может ли KRAS4B взаимодействовать с другими пренилированными белками через MAFI.ReBiL2.0 легко обнаруживал взаимодействия между KRAS4B и фарнезилированным и ассоциированным с плазматической мембраной DIRAS3, генетически определенным супрессором KRAS (27) ( SI Приложение , рис. S3 B ), а также двумя семьями RHO, ассоциированными с плазматической мембраной. малые GTPases, геранилгеранил-модифицированный RAC1 и RAC2 ( SI Приложение , рис. S3 C ). Все взаимодействия требовали пренилирования, поскольку мутация цистеина к серину в мотиве CAAX отменяла комплементацию 1/2luc ( SI Приложение , рис.S3). Это согласуется с этими взаимодействиями, происходящими через MAFI-зависимые белковые комплексы. Интересно, что связанные с горячими точками мутации драйверной точки KRAS4B_G12D и RAC1_P29S (28) показали более высокие показатели комплементации 1/2luc с RAC1 и KRAS4B, соответственно, что позволяет предположить, что они могут объединяться с более высокой вероятностью, хотя лежащие в основе механизмы остаются неясными ( SI Приложение , рис. S3 C ). Важно отметить, что KRAS4B не проявлял эффективного взаимодействия с малой GTPase RHEB семейства RAS ( SI Приложение , рис.S3 B ), фарнезилированный белок, который локализуется на эндомембранах (29). Более того, KRAS4B существенно не колокализируется с фарнезилированной RHO small GTPase RND3 ( SI Приложение , Fig. S3 B ), которая также локализуется на плазматической мембране (29). Мы пришли к выводу, что либо KRAS4B и RND3 находятся в неперекрывающихся мембранных компартментах, либо что сила их липидных взаимодействий с мембранами недостаточна для MAFI. Взятые вместе, наши результаты демонстрируют, что KRAS4B находится в непосредственной близости от самого себя, KRAS4A, HRAS, NRAS и подмножества пренилированных белков на плазматической мембране, где они находятся достаточно близко, чтобы позволить MAFI-зависимую комплементацию 1/2luc.

Использование взаимодействий RAS – RBD для моделирования PPI и MAFI.

Наши наблюдения поднимают критический вопрос: вносит ли MAFI-зависимая совместная локализация белкового комплекса, такого как RAS-RAS, регуляцию RAS или биологические функции in vivo, или их способность взаимодействовать является просто отражением чувствительности ReBiL2.0. проба? Чтобы ответить на этот важный вопрос, мы воспользовались четко определенным взаимодействием RAS-RBD (RAS-связывающий домен CRAF) (16) в качестве модельной системы, чтобы исследовать, могут ли обычные PPI и белковые комплексы, управляемые MAFI, влиять на регуляцию пути RAS ниже по течению. сигнализация и фенотипический результат.

Мы использовали взаимодействие RAS-RBD дикого типа для моделирования эффектов обычного доменного PPI (Fig. 3 A , Left ). RBD дикого типа (аминокислоты с 51 по 131 CRAF) прочно связывается ( K _d , 0,13 мкМ по физиологической ионной силе) с RAS-GTP (16), тогда как мутация аргинина-89 в лейцин ( RBD_R89L) снижает аффинность связывания с RAS-GTP до микромолярного диапазона (15, 16), который аналогичен диапазону сродства взаимодействия RAS-RAS (5, 6).Если MAFI может вносить значительный вклад во взаимодействия RAS-RBD, мы прогнозируем, что домен HVR-CAAX из KRAS, присоединенный к C-концу cl-RBD_R89L (обозначенный cl-RBD_R89L-CVIM), должен взаимодействовать с RAS-GTP (рис. 3 A , Правый ). Сначала мы подтвердили PPI между KRAS4B и RBD с использованием репортерной линии клеток ReBiL2.0. В соответствии с литературными данными, мы наблюдали устойчивую комплементацию 1/2luc nl – KRAS4B_G12D (представляющую RAS – GTP) и cl – RBD (cl, слитую с аминокислотами 51–220 CRAF) (30) (рис.3 В ). Отрицательный контроль cl-RBD_R89L показал значительно сниженную комплементацию 1 / 2luc в сочетании с nl-KRAS4B_G12D (Fig. 3 B ), подтверждая потерю внутренней способности к димеризации. Напротив, cl-RBD_R89L-CVIM эффективно восстанавливает комплементацию 1 / 2luc с nl-KRAS4B_G12D (Fig. 3 C ). Таким образом, взаимодействие между KRAS4B_G12D и cl – RBD_R89L – CVIM выполняет предсказание, что они будут взаимодействовать через MAFI. Мы предполагаем, что более высокий люминесцентный сигнал, генерируемый этой парой, обусловлен пониженной жесткостью комплекса RAS-RBD, в котором более низкое внутреннее сродство из-за мутации R89L дает больше свободы для лучшего размещения фрагментов 1 / 2luc в этой паре.

Рис. 3.

Модель PPI и MAFI при взаимодействии РАН и РосБР. ( A ) На схемах изображена схема эксперимента. Взаимодействие nl – KRAS4B_G12D и cl – RBD дикого типа представляет собой обычный PPI. Мутант cl – RBD_R89L служит отрицательным контролем. Слабое внутреннее сродство между nl-KRAS4B_G12D и ассоциированным с мембраной cl-RBD_R89L-CVIM д. Имитировать взаимодействие, облегченное мембранной ассоциацией (MAFI). ( B ) Анализ ReBiL2.0 показывает, что KRAS4B_G12D взаимодействует с RBD, но не с RBD_R89L.Гистограмма показывает количественные оценки ReBiL2.0, нормализованные к взаимодействию KRAS4B_G12D + RBD (установлено на 100%). Один 1 / 2luc без партнеров по слиянию (n1 + cl) служил отрицательным контролем. Данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 4). ( C ) Анализ ReBiL2.0 показывает, что RBD_R89L – CVIM восстанавливает взаимодействие с KRAS4B_G12D. Гистограмма показывает количественные оценки ReBiL2.0, нормализованные к взаимодействию KRAS4B_G12D + RBD (установлено на 100%). Один 1 / 2luc без партнеров по слиянию (n1 + cl) служил отрицательным контролем.Данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 4).

Для ингибирования RAS требуется обычное взаимодействие RAS и RBD.

Затем мы спросили, достаточно ли слабого сродства между MAFI-опосредованным RBD_R89L – CVIM и комплексом RAS для снижения функции RAS. Мы использовали фосфорилирование ERK (pERK) в качестве фенотипического считывания для ингибирования RAS, поскольку сверхэкспрессируемый RBD может действовать как доминантно-негативный мутант для ингибирования RAS-RAF-опосредованного фосфорилирования ERK (30, 31). Чтобы проверить, ингибирует ли RBD_R89L – CVIM RAS, мы сконструировали индуцируемые доксициклином клеточные линии U2OS, которые стабильно кодируют трансгены RBD и RBD_R89L дикого типа.Поскольку RBD представляет собой небольшой белок (~ 19,3 кДа), мы добавили EGFP (~ 27 кДа) на его N-конец, чтобы увеличить его размер, чтобы его можно было отличить от эндогенных белков RAS (~ 21 кДа) с помощью вестерн-блоттинга. Мы создали мутацию цистеина в серин (RBD-SVIM) для предотвращения пренилирования белка и локализации на мембране, чтобы можно было оценить эффекты немембранно-ассоциированного RBD. Таким образом, RBD-SVIM и RBD_R89L-CVIM отличаются только двумя аминокислотами (R89L и C185S), которые предотвращают доменное взаимодействие и локализацию близости с помощью MAFI (рис.4 А ). Мы использовали RMCE (опосредованный рекомбиназой обмен кассет) (20, 32) для интеграции однокопийного трансгена RBD в предварительно выбранный хромосомный локус, где экспрессия трансгена строго контролируется индуцируемым доксициклином промотором. Это позволяет минимизировать транскрипцию трансгена RBD во время инженерии и размножения клеточной линии, что важно, поскольку экспрессия RBD ингибирует образование pERK и препятствует росту клеток. Согласно литературным данным, положительный контроль, EGFP – RBD – CVIM и EGFP – RBD – SVIM, вызывал дозозависимое снижение эндогенного pERK (рис.4 B ), что указывает на то, что эндогенная активность RAS ингибируется как RBD – CVIM, так и RBD – SVIM. Важно, что RBD_R89L – CVIM не ингибирует активность RAS (Fig. 4 B , Right ), несмотря на его надежную комплементацию 1/2luc с KRAS_G12D (Fig. 3 C ). Эти результаты ясно демонстрируют, что низкоаффинное взаимодействие, опосредованное MAFI, между RBD_R89L и RAS недостаточно для подавления активности RAS. Скорее, для ингибирования фосфорилирования ERK требуется классический PPI с высоким сродством между RAS и RBD.Однако, как показано ниже, сочетание классических PPI и MAFI порождает непредсказуемый способ регуляции белка RAS.

Рис. 4.

Обычный PPI вызывает ингибирование RAS, тогда как обычный PPI в сочетании с мембранной ассоциацией вызывает как ингибирование, так и истощение RAS. ( A ) Схема изображает экспериментальную схему. Взаимодействие между RBD дикого типа и эндогенным RAS-GTP представляет собой взаимодействие, опосредованное обычным PPI. Напротив, RBD_R89L – CVIM образует управляемый MAFI комплекс с эндогенными белками RAS.( B ) Вестерн-блоттинг показывает, что экспрессия EGFP – RBD – CVIM ингибирует фосфорилирование ERK и истощает изоформы RAS, включая KRAS, HRAS и NRAS, в зависимости от дозы доксициклина. CDC42, который не связывает RBD, не влияет на уровень белка. EGFP – RBD – SVIM взаимодействует с RAS через обычный PPI и ингибирует фосфорилирование ERK, но не влияет на уровни белка pan-RAS. EGFP – RBD_R89L – CVIM не взаимодействует с RAS через обычные PPI и, хотя и локализуется на плазматической мембране, не ингибирует активность RAS, измеряемую фосфорилированием ERK.

Механизм истощения белка RAS, опосредованный мембранно-направленными высокоаффинными связующими RAS через процесс, опосредованный лизосомами.

Хотя RBD_R89L-CVIM не смог подавить активность RAS, мембранно-направленный RBD-CVIM (комбинация обычных PPI и MAFI; рис. 4 A ) продемонстрировал более сильные ингибирующие эффекты в обоих фосфорилированных ERK (рис. 4 B ) ) и рост клеток, чем RBD – SVIM ( SI Приложение , рис. S4). О подобном фенотипе сообщалось ранее при использовании ассоциированного с мембраной внутритела (iDab # 6 -mb), которое, как было показано, проявляет превосходную ингибирующую активность RAS (33).Поэтому мы более подробно изучили разницу между RBD – CVIM и RBD – SVIM. Мы были удивлены, обнаружив, что экспрессия RBD-CVIM не только ингибирует активность RAS, но также существенно снижает количество эндогенных белков HRAS, KRAS и NRAS (рис. 4 B ). Связанные с мембраной малые ГТФазы семейства RHO (34), такие как CDC42 (фиг.4 B и 5 A и B ), RHOA и RAC1 (фиг.5 A ), не уменьшились, поскольку они не связываются с RBD, что указывает на то, что этот эффект обычно не влияет на другие ассоциированные с мембраной белки.Кроме того, индуцированная доксициклином экспрессия EGFP-RBD-CVIM в клетках яичника китайского хомячка (CHO) также вызвала аналогичное истощение белков RAS (рис. 5 B ), что указывает на то, что это общее явление, которое может происходить как у человека, так и у человека клетки грызунов.

Рис. 5.

Нацеленные на мембрану плотные связывающие вещества RAS истощают белки пан-RAS. ( A ) Вестерн-блоттинг показывает, что экспрессия EGFP-R11.1.6-CVIM в клетках U2OS ингибирует фосфорилирование ERK и истощает белки KRAS, HRAS и NRAS.Экспрессия EGFP-R11.1.6-SVIM ингибирует фосфорилирование ERK, но не влияет на уровень белка RAS. Малая GTPase CDC42, RHOA и RAC1 семейства RHO служат в качестве отрицательного контроля. α-Тубулин и GAPDH служат в качестве контроля загрузки. ( B ) Вестерн-блоттинг показывает, что экспрессия EGFP – RBD – CVIM в клетках CHO ингибирует фосфорилирование ERK и истощает белки KRAS, HRAS и NRAS. Экспрессия EGFP – RBD – SVIM этого не делает.

Способность RBD – CVIM, но не RBD_R89L – CVIM, вызывать истощение RAS предполагает, что белки, связывающие RAS с высоким сродством (например.g., RBD – CVIM) может быть необходимо для запуска истощения белка RAS в плазматической мембране, тогда как более слабые связывающие вещества (например, RBD_R89L – CVIM) лишены такого потенциала. Если эта гипотеза верна, тогда другие высокоаффинные RAS-связывающие белки, такие как R11.1.6, сконструированный RAS-связывающий белок (35), основанный на каркасе небольшого белка Sso7D (~ 7 кДа, 63 аминокислоты) (36) (in vitro KRAS K _d = 2,2 ∼50,3 нМ) (35) также должен ингибировать и истощать белки RAS. Мы использовали стратегию RMCE для стабильной интеграции EGFP – R11.1.6 – CVIM или EGFP – R11.1.6 – SVIM в геном U2OS. В соответствии с результатами, представленными выше, индуцированная доксициклином экспрессия любого трансгена ингибировала активность RAS, что продемонстрировано снижением фосфорилирования ERK (фиг. 5 A ). Примечательно, что только связанный с мембраной EGFP – R11.1.6 – CVIM истощает белки K, N и H-RAS (Fig. 5 A ). Наша гипотеза также предсказывает, что слабое связывание RAS не должно ни ингибировать, ни истощать белки RAS. Как и ожидалось, ассоциативный домен RAS (37) (RA) (аминокислоты 202–361) из RASSF5, более слабого связующего вещества RAS ( K _d , 0.2 ∼0,4 мкМ) (13) не ингибировал активность RAS и не снижал уровни белка RAS ( SI Приложение , рис. S5). Взятые вместе, эти результаты подтверждают наше представление о том, что высокоаффинные RAS-связывающие белки могут значительно влиять на активность RAS и гомеостаз белка, когда они нацелены на близость RAS в клеточной мембране в живых клетках. Мы связываем ингибирование RAS с помощью RBD и R11.1.6 с доминантно-негативным механизмом, который конкурирует со связыванием RAS с нижележащими эффекторными белками RAF.

Приведенные выше наблюдения привели нас к исследованию механизма (ов), ответственного за истощение белка RAS с помощью мембранно-направленных высокоаффинных связывающих белков RAS. Анализ уровней мРНК RAS с помощью количественной ОТ-ПЦР показал, что мРНК из трех изоформ RAS не изменились, когда EGFP – RBD – CVIM и EGFP – RBD – SVIM были индуцированы доксициклином ( SI Приложение , Рис. S6 A и B ), что указывает на то, что снижение уровней белка RAS не было связано с изменениями в экспрессии мРНК RAS.Затем мы сосредоточились на механизмах гомеостаза клеточных белков, таких как протеасомная или лизосомная деградация белков. Попытки блокировать истощение белка RAS с использованием ингибиторов протеасом (например, MG132) были безуспешными, поскольку такое лечение вызывало гибель клеток до того, как истощение белка RAS происходило в линиях репортерных клеток U2OS. Ингибирование NEDD8-активирующего фермента антагонистом MLN4924 не смогло предотвратить истощение белка RAS с помощью мембранно-направленного RBD-CVIM ( SI Приложение , Рис. S7).Затем мы исследовали, может ли нарушение пути деградации белков, опосредованного аутофагосомами и лизосомами, предотвратить вызванное RBD-CVIM истощение белка RAS. Мы использовали три ингибитора для блокирования протонного насоса V-АТФазы или ферментативной функции PIKFYVE, чтобы проверить эту идею (рис. 6 A ). Ингибиторы протонной помпы V-АТФазы, такие как бафиломицин A1 и конканамицин A, могут предотвращать слияние аутофагосом и лизосом и нарушать деградацию лизосом (38). Обработка клеток бафиломицином A1 и конканамицином A блокировала вызванное RBD – CVIM истощение белка RAS (рис.6 B и SI Приложение , Рис. S8). В отличие от ингибитора протонной помпы V-АТФазы, недавно идентифицированный низкомолекулярный ингибитор WX8 нарушает функцию лизосом, предотвращая слияние аутофагосом и лизосом, ингибируя ферментативную функцию PIKFYVE (39). Обработка WX8 также блокировала RBD-CVIM-индуцированное истощение белка RAS (Fig. 6 C ). Эти результаты ясно указывают на то, что путь деградации, опосредованный аутофагосомами и лизосомами, в RBD-CVIM-опосредованное истощение белка RAS.

Рис. 6.

Направленное на мембрану RBD-индуцированное истощение пан-RAS опосредуется аутофагосомно-лизосомным путем. ( A ) На диаграмме показаны мишени бафиломицина A1, конканамицина A и WX8 на пути аутофагосома-лизосома. ( B и C ) Вестерн-блоттинг показывает, что RBD – CVIM-зависимое истощение белка RAS блокировалось обработкой бафиломицином A1 ( B ) и WX8 ( C ). Клетки обрабатывали доксициклином для индукции RBD – CVIM или RBD – SVIM в течение 24 часов с последующей обработкой бафиломицином A1 или WX8 в течение еще 24 часов.GAPDH служит контролем нагрузки и LC3B-II, который увеличивается в ответ на лечение бафиломицином A1 (38).

Обсуждение

Мы использовали стратегию живых клеток в реальном времени и обнаружили, что пребывание KRAS4B в клеточной мембране происходит в непосредственной близости от других изоформ RAS. Это позволяет изоформам RAS взаимодействовать, а KRAS4B — взаимодействовать с подмножеством других мембранных белков через MAFI. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями на основе изображений, показывающими, что KRAS образует димеры или нанокластеры на клеточной мембране (3, 4).Однако неспособность KRAS4B_C185S (Рис.2 C и SI Приложение , Рис S2 B ) образовывать димеры показывает, что слабого внутреннего сродства между белками RAS недостаточно для образования димеров в отсутствие прикрепления к мембране. . Это напоминает недавнее биофизическое исследование, показывающее, что KRAS4B не обладает внутренней способностью к димеризации и остается мономерным даже на поддерживаемых липидных бислоях (12). Таким образом, мы определяем такие слабые белковые взаимодействия между протомерами в тесной ассоциации в мембране как MAFI.Важно отметить, что анализ ReBiL2.0 способен обнаруживать как обычные ИПП (17, 20), так и белковые комплексы, опосредованные MAFI, и может различать их, сравнивая изогенные клеточные линии, кодирующие соответствующие мутации в классических доменах взаимодействия белков или в мембранном нацеливании. домен. Без использования таких генетических подходов и экспрессии на физиологическом уровне трудно отличить MAFI от обычных взаимодействий, опосредованных димеризационным доменом. Это ограничение, вероятно, разделяется схожими анализами, основанными на близости, такими как лигирование близости (40) и резонансный перенос энергии флуоресценции (41).

Используя взаимодействие RAS – RBD в качестве модельной системы, мы показали, что MAFI эффективно обеспечивает совместную локализацию RAS и RBD_R89L – CVIM. Однако никакого ингибирующего эффекта не наблюдалось (фиг. 4 B ) из-за очевидной незначительной внутренней способности к димеризации этих двух белков. Точно так же димеризация белка RAF требуется для активации нижестоящего каскада киназ. Однако мутации димерного интерфейса, такие как аргинин 481 (FRAF1_DROME, эквивалентный аргинину 509 в BRAF_HUMAN) и аргинин 401 (CRAF_HUMAN), не смогли эффективно активировать нижестоящую киназу, когда их искусственно заставляли образовывать «димеры» с белком RAF дикого типа (42, 43 ).Эти результаты предоставляют доказательства, подтверждающие наше представление о том, что совместная локализация белков без внутренней аффинности взаимодействия не обязательно приводит к функциональному результату. Стоит отметить, что наши результаты не исключают возможность того, что кластеры белков RAS на мембранах могут привлекать белки RAF для локализации в достаточных концентрациях, а также ограничивать случайное переворачивание белков RAF (8) посредством взаимодействий RAS-RBD, способствуя димеризации RAF (44). . Несколько генетических исследований были интерпретированы как доказательство того, что RAS дикого типа может функционировать как опухолевый супрессор для ингибирования онкогенных мутантов RAS (45–47).Одна из моделей, объясняющих ингибирующий эффект RAS дикого типа, заключается в том, что он образует непродуктивный димер с мутантным RAS посредством прямых взаимодействий. Однако аффинности связывания как RAS – RAS, так и RAS – RBD_R89L находятся в миллимолярном диапазоне. Поскольку мы обнаружили, что RBD_R89L-CVIM не ингибирует активность RAS, мы пришли к выводу, что такое слабое внутреннее сродство между RAS дикого типа и мутантным RAS может быть недостаточным для поддержания ингибирующего эффекта. Если бы одного прямого взаимодействия было достаточно, то можно было бы ожидать наблюдать ингибирующие эффекты между различными изоформами RAS, поскольку наши данные предполагают, что KRAS4B взаимодействует с HRAS и NRAS в анализе ReBiL (рис.2 С ). Однако ингибирующие эффекты RAS дикого типа наблюдаются только в контексте мутации родственной изоформы RAS (48). Взятые вместе, данные показывают, что ингибирование RAS дикого типа мутантного RAS посредством прямой димеризации, вероятно, представляет собой чрезмерное упрощение того, что происходит в контексте необходимой мембранной ассоциации, необходимой для функции RAS. Хотя было предложено и обсуждено много возможных моделей (49), точно не установлено, действует ли РАС дикого типа как опухолевый супрессор и как именно.

Вызывает недоумение то, что связывающий RAS небольшой белок R11.1.6, который имеет наномолярное сродство, не смог ингибировать активность RAS в панели линий раковых клеток человека, несущих KRAS дикого типа и мутантный KRAS, включая онкогенные мутации G12D, G12C и G12V. (50). Мы полагаем, что это может быть частично связано с техническими проблемами, связанными с тем, как были созданы эти клеточные линии, или с тем, что белок R11.1.6 был занесен лентивирусной инфекцией. Создание клеточных линий для стабильной экспрессии RBD или других ингибирующих RAS-связывающих белков нецелесообразно из-за их сильного отрицательного воздействия на активность пути RAS / MAPK, необходимую для роста многих обычно используемых клеточных линий.Применение строгого отбора лекарственных средств к этим клеткам часто приводит к обогащению клеток, ускользающих от экспрессии кодируемых трансгеном ингибирующих белков. Мы преодолели это ограничение, вставив ингибирующий трансген в один предварительно выбранный хромосомный локус с помощью RMCE, а затем предотвратив транскрипцию для обеспечения размножения клеток. Важно отметить, что используемая система, индуцируемая доксициклином, кодирует как репрессор транскрипции TetR-KRAB, так и активатор rtTA2 ^S -M2. Это позволяет подавить транскрипцию в отсутствие доксициклина, тем самым снижая утечку транскрипции до неопределяемого уровня.Комбинация TetR-KRAB и rtTA2 ^S -M2 обеспечивает повышение активности люциферазы в 6000–70 000 раз (32). Чрезвычайно низкий фон в этой двойной системе обеспечивает очень высокую кратность индукции и отношения сигнал / шум. Это намного выше, чем у большинства коммерчески доступных линий клеток, индуцируемых доксициклином, вероятно, из-за высокого фона утечки в системах, кодирующих только трансактиватор rtTA. Мы пришли к выводу, что чрезвычайно низкая фоновая экспрессия в нашей системе значительно облегчила создание клеточных линий, кодирующих ингибирующие рост трансгены.Надежность этой системы позволила нам глубоко проанализировать функциональные последствия экспрессии ингибирующих рост белков в физиологически релевантной клеточной среде.

Мы были удивлены, обнаружив, что нацеленные на мембрану сильные связывающие белки RAS истощают белки K, N и H-RAS. Мы предполагаем, что такие сильные связывающие вещества действуют как ловушки, имитирующие сильное связывание RAF без активации нижестоящих сигнальных путей из-за отсутствия в них киназного домена. Мы обнаружили, что таким образом клетки устраняют такие непродуктивные белковые комплексы посредством пути аутофагосома – лизосома (рис.6). Эти результаты могут иметь клиническое значение, если раковые клетки KRAS_G12C обрабатывают аддукт KRAS_G12C и его ковалентных ингибиторов (51⇓-53) посредством аналогичного аутофагосомно-лизосомозависимого пути для устранения таких непродуктивных аддуктов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы раскрыть лежащий в основе молекулярный механизм (ы) этого типа системы контроля качества, способный различать активные и непродуктивные белковые комплексы RAS-RBD и впоследствии активировать путь деградации аутофагосома-лизосома.Понимание этих механизмов может помочь определить терапевтические пути, способствующие целенаправленному истощению белков RAS. Такие улучшения могут принести большую пользу большому количеству пациентов с раком поджелудочной железы и другими видами рака, которые зависят от онкогенной активации белков RAS.

Материалы и методы

Конструирование плазмид и клеточных линий ReBiL и RMCE.

Методы конструирования плазмид и клеточных линий ReBiL и RMCE были описаны ранее (20, 32).Клеточные линии ReBiL поддерживали в DMEM (Corning; 10-013-CV) с 10% (об. / Об.) FBS, 10 мкг / мл ципрофлоксацина (Corning; 61-277-RG), от 200 до ∼400 мкг / мл G418 ( Corning; 61-234-RG), 1 нг / мл доксициклина (Sigma; D9891) и 4 мкг / мл бластицидина (Thermo Fisher; R21001). Все нацеленные плазмиды и клеточные линии ReBiL и RMCE, использованные в этом отчете, перечислены в приложении SI, приложение , таблицы S1 и S2.

Антитела.

Используемые здесь антитела — это анти-RAS (Pan, мышиные моноклональные; Millipore 05-516; лот № 3072322), анти-KRAS4B (мышиные моноклональные; Sigma; WH0003845M1), анти-HRAS (кроличьи поликлональные; Proteintech; 18295-1- AP; лот № 00022367), анти-NRAS (мышиный моноклональный; Santa Cruz; sc-31; лот № L1115), анти-CDC42 (кроличий моноклональный; Cell Signaling; № 2466), анти-RHOA (кроличий моноклональный, Cell Signaling; № 2117), анти-RAC1 (мышиный моноклональный; Millipore; 05-389; лот № 2727207), анти-β-тубулин (кроличий поликлональный; LI-COR; P / N 926-42211), анти-НА-метка (кролик моноклональный; Cell Signaling; # 3724), анти-β-актин (мышиный моноклональный; LI-COR; P / N 926-42212), антифосфо-ERK1 / 2 (кроличий моноклональный; Cell Signaling; # 4370), анти- ERK1 / 2 (мышиный моноклональный; Cell Signaling; № 4696), анти-α-тубулин (мышиный моноклональный; Sigma), анти-GAPDH (кроличий моноклональный; Cell Signaling; № 5174; или мышиный моноклональный; Proteintech; 60004-1), анти-LC3B (кроличий поликлональный; Cell Signaling; # 2775), анти-p21 (мышиный моноклональный; BD; 610233), козий анти-кроличий вторичные антитела (Alexa Fluor 680; Thermo Fisher; A-21109) и козьих антител против мышиных вторичных (IRDye 800CW; LI-COR; P / N 926-32210; и DyLight 800 4 × PEG; Thermo Fisher; SA5-35521).

ReBiL2.0 Assay.

Этот анализ состоит из 1) анализа BiLC в реальном времени, который был описан ранее ( SI Приложение , рис. S2) (20) и 2) количественного вестерн-блоттинга для определения количества каждого слитого белка 1/2luc ( SI Приложение , Рис. S2 I и Таблица S3). Среда для анализа (I) состоит из DMEM / F12 (Thermo Fisher; без фенолового красного), 10% (об. / Об.) FBS и 10 мкг / мл ципрофлоксацина. Среда для анализа (II) основана на среде (I) со свежим добавлением 40 нг / мл доксициклина и от 400 до 600 мкМ d-люциферина (Biosynth; L-8200 или L-8220).В 384-луночные (Corning; 3570; белые, плоские, обработанные культурой ткани) и 6-луночные планшеты сначала загружали 20 мкл и 1,6 мл среды (II) для каждой лунки, соответственно. Клетки ReBiL обрабатывали трипсином, и количество клеток определяли с помощью Cellometer Auto T4. Требуемое количество клеток собирали, центрифугировали (200 rcf, 5 мин при комнатной температуре) для удаления супернатанта и ресуспендировали до 250 клеток на мкл в среде (I). Затем 20 мкл или 1,6 мл клеток ReBiL засевали в каждую лунку 384-луночного планшета (5000 клеток на лунку) или каждую лунку 6-луночного планшета (400000 клеток на лунку) соответственно.Конечная концентрация каждого компонента составляла 1 × среда DMEM / F12 (без фенолового красного), 10% (об. / Об.) FBS, 10 мкг / мл ципрофлоксацина, 20 нг / мл доксициклина и от 200 до 300 мкМ d-люциферина. 384-луночный планшет герметизировали оптической адгезивной пленкой MicroAmp (Thermo Fisher), и люминесценцию считывали на считывающем устройстве для микропланшетов Tecan M200 (время интегрирования 2 с; 15 мин на цикл в общей сложности 24 ч при 37 ° C). Шестилуночный планшет инкубировали при 37 ° C в инкубаторе с 7% CO ₂ . Каждый эксперимент ReBiL содержит отрицательный контроль (nl + cl).По окончании анализа ReBiL (24 ч) оптическую адгезивную пленку удаляли и количество жизнеспособных клеток оценивали с помощью CellTiter-Glo (Promega; 1: 5, разведенный PBS, 35 мкл на 384 лунки) ( SI Приложение , Рис. S2 H ). Для количественного определения слитых белков 1 / 2luc клетки ReBiL из шестилуночных планшетов собирали с буфером для лизиса RIPA (50 мМ Tris⋅HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,25% [вес / объем] дезоксихолевой кислоты, 1% [об. / об.] IGEPAL CA-630, 1 мМ EDTA, 2 мМ Na ₃ VO ₄ , 20 мМ NaF и смесь 1 × cOmplete ингибиторов протеазы; Roche) через 24 часа.Прозрачный лизат смешивали с буфером для образцов LDS (Thermo Fisher) с 10% (об. / Об.) Β-меркаптоэтанолом и денатурировали при 70 ° C в течение 5 мин. Денатурированные лизаты разделяли электрофорезом в 10% додецилсульфат натрия в полиакриламидном геле и переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (Millipore; № IPFL00010), как описано ранее (20). Затем мембрану PVDF зондировали антителами против НА и против актина в 0,5-кратном блокирующем буфере Odyssey PBS (LI-COR; номер по каталогу 927-40000; 1: 1, разбавленный PBS или 0.5 × блокирующий буфер Odyssey TBS; LI-COR; часть нет. 927-50000; 1: 1, разбавленный TBS) 0,05% Tween 20 при 4 ° C в течение ночи. После инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Flour 680 (Thermo Fisher) и IRDye 800 (LI-COR), мембрану сканировали в LI-COR Odyssey Imaging System (Odyssey Application Software 3.0) со следующими параметрами: разрешение, 84 мкм; качество, высокое; смещение фокуса 0,0 мм; интенсивность, 700 5,0 и 800 5,0. Были определены относительные интенсивности полос [1 / 2luc Least] и контроль нагрузки актина [load ctrl] ( SI Приложение , рис.S2 I ) и экспортировали в Microsoft Excel с помощью программного обеспечения ImageStudio (версия 2.1.10; LI-COR) и затем рассчитали [1 / 2luc Least] / [Actin] ( SI Приложение , Таблица S3). Необработанные люминесцентные данные, собранные люминометром Tecan, были импортированы в Prism 8 (GraphPad). Больше клеток генерировало более высокие люминесцентные сигналы. Этот эффект количества клеток был сначала скорректирован путем расчета процента [Raw ReBiL Luminescence] / [CellTiter Glo Luminescence]. [Raw ReBiL Luminescence] было люминесцентным показанием в 24-часовой временной точке ( SI Приложение , рис.S2 A — G ) и [Cell # by CellTiter Glo] — люминесцентное считывание из анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo, выполненного в конце кинетического анализа ReBiL ( SI Приложение , рис. S2 H ) . Затем была рассчитана оценка ReBiL2.0 путем деления значения ([Raw ReBiL Luminescence] / [CellTiter Glo Luminescence]) на соответствующее ([1 / 2luc Least] / [Actin]) (Рис. 1 D ). Результаты представлены в виде гистограмм с осью x , представляющей процент взаимодействия положительного контроля (установленный на 100%) ( SI Приложение , рис.S2 J ).

Анализ роста клеток Syto60.

Syto60 представляет собой краситель красной флуоресценции, проникающий в клетки, который окрашивает нуклеиновую кислоту. Таким образом, интенсивность флуоресцентного окрашивания Syto60 пропорциональна количеству клеток. Клетки U2OS, несущие TRE – EGFP – RBD – CVIM и TRE – EGFP – RBD – SVIM, высевали в 96-луночный планшет (1000 клеток и 200 мкл среды [DMEM, 10% FBS, 10 мкг / мл ципрофлоксацина, 200 мкг / мл G418] на лунку) с указанной концентрацией доксициклина в день 0. В указанное время клетки фиксировали 100 мкл 10% забуференного формалина (протокол 67-56-1) в течение 10 мин при комнатной температуре, дважды промывали PBS. и один раз с TBS (20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.4). Затем клетки окрашивали 1 мкМ красителем Syto60 (Thermo Fisher; S11342, приготовленный в TBS) в течение 10 минут в темноте. Клетки промывали трижды TBS. Средняя интенсивность флуоресценции Syto60 была определена количественно с помощью системы LI-COR Odyssey и нанесена на график с помощью Prism 8 (GraphPad).

Анализ RT-qPCR.

РНК

выделяли с использованием наборов RNeasy Micro Plus и Mini (Qiagen; 74034) и преобразовывали в кДНК с помощью iScript RT Supermix (Bio-Rad; 1708840). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени QuantStudio 5 (Thermo Fisher) путем смешивания кДНК, SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher; 4309155) и специфичных для генов праймеров.Последовательности праймеров доступны в SI Приложение , Таблица S4. Все данные RT-qPCR были нормализованы до GAPDH.

Лечение ингибиторами.

Клетки в шестилуночных планшетах (DMEM, 10% FBS, 10 мкг / мл ципрофлоксацина, 200 мкг / мл G418) обрабатывали доксициклином (400 нг / мл) или без него в течение 24 часов с последующим добавлением ингибитора или носителя. (ДМСО или ацетонитрил) в среду для культивирования клеток еще на 24 часа. Клетки дважды промывали ледяным PBS и собирали лизирующим буфером RIPA. В этом исследовании использовались ингибиторы MLN4924 (Selleckchem; S7109; Batch No.02; ресуспендированный в ДМСО), бафиломицин А1 (BioViotica; каталог № BVT-0252; ресуспендированный в ДМСО), конканамицин А (Кайман; товар 11050; партия 0564072-5; 100 мкг в 1 мл ацетонитрила) и WX8 (ресуспендированный в ДМСО; щедрый подарок от лаборатории M. DePamphilis, NIH, Bethesda, MD).

Доступность данных.

Все протоколы описаны в Материалы и методы или в ссылках в нем. Все плазмиды и клеточные линии, использованные в этом исследовании, перечислены в приложении SI , и они доступны по запросу у соответствующего автора G.M.W.

Благодарности

Мы благодарим E. Stites, M. Philips, N. Rosen и Z. Yao за конструктивные комментарии. Мы также благодарим M. DePamphilis и A. Buchwalter за обмен реагентами. Работа в лаборатории G.M.W. была частично поддержана основным грантом онкологического центра CA014195, Фондом Сьюзан Г. Комен (грант SAC110036), Национальным институтом здравоохранения / Национальным институтом рака (грант R35 CA197687), Благотворительным фондом Леоны М. и Гарри Б. Хелмсли (грант 2012- PG-MED002), Фондом Фриберга, Greenfields, Sorrento Biosciences и Genentech.

Сноски

• Вклад авторов: Y.-C.L., F.M., and G.M.W. спланированное исследование; Y.-C.L., N.K.L., L.W. и T.K.H. проведенное исследование; S.T.G., M.N.S., R.C.B., C.J.D., D.P.-W. и F.M. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Y.-C.L. и Н.К.Л. проанализированные данные; и Y.-C.L. и G.M.W. написал газету.

• Рецензенты: M.M., Институт рака Хантсмана; и K.D.W., Юго-западный медицинский центр Техасского университета в Далласе.

• Отчет о конкурирующих интересах: F.М. является консультантом следующих компаний: Aduro Biotech, Amgen, Daiichi Ltd., Ideaya Biosciences, Kura Oncology, Leidos Biomedical Research, Inc., PellePharm, Pfizer, Inc., PMV Pharma, Portola Pharmaceuticals и Quanta Therapeutics. F.M. получил исследовательские гранты от Daiichi Ltd. и Gilead Sciences. F.M. является консультантом и соучредителем следующих компаний (с долей владения, включая опционы на акции): BridgeBio, DNAtrix, Inc., Olema Pharmaceuticals, Inc. и Quartz. Ф.М. является научным руководителем NCI Ras Initiative в Национальной лаборатории исследования рака им. Фредерика / Leidos Biomedical Research, Inc. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2000848117/-/DCSupplemental.

Что такое мРНК? Молекула-посланник, которая присутствует в каждой живой клетке в течение миллиардов лет, является ключевым ингредиентом некоторых вакцин против COVID-19

.

Удивительной звездой пандемического ответа на коронавирус стала молекула, называемая мРНК.Это ключевой ингредиент вакцин Pfizer и Moderna от COVID-19. Но сама мРНК — не новое изобретение лаборатории. Он возник миллиарды лет назад и естественным образом присутствует в каждой клетке вашего тела. Ученые считают, что РНК возникла у самых ранних форм жизни, еще до того, как появилась ДНК.

Вот краткий курс того, что такое мРНК и какую важную работу она выполняет.

Познакомьтесь с генетическим посредником

Вы, наверное, знаете о ДНК. Это молекула, которая содержит все ваши гены, обозначенные четырехбуквенным кодом — A, C, G и T.

Информационная РНК передает генетическую информацию от ДНК в хорошо защищенном ядре к остальной части клетки, где структуры, называемые рибосомами, могут создавать белки в соответствии с планом ДНК. ttsz / iStock через Getty Images Plus

ДНК находится внутри клеток каждого живого существа. Он защищен частью клетки, называемой ядром. Гены — это детали в схеме ДНК для всех физических характеристик, которые делают вас уникальным.

Но информация от ваших генов должна поступать от ДНК в ядре к основной части клетки — цитоплазме, где собираются белки. Клетки полагаются на белки для выполнения многих процессов, необходимых для функционирования организма. Вот где на помощь приходит информационная РНК, или для краткости мРНК.

Разделы кода ДНК транскрибируются в сокращенные сообщения, которые представляют собой инструкции по созданию белков. Эти сообщения — мРНК — транспортируются в основную часть клетки.Как только мРНК прибывает, клетка может производить определенные белки из этих инструкций.

Последовательность двухцепочечной ДНК транскрибируется в код мРНК, поэтому инструкции можно транслировать в белки. Алков / iStock через Getty Images Plus

Структура РНК похожа на ДНК, но имеет некоторые важные отличия. РНК представляет собой однонитку кодовых букв (нуклеотидов), а ДНК — двухцепочечную. Код РНК содержит U вместо Т-урацила вместо тимина.И РНК, и структуры ДНК имеют основу, состоящую из молекул сахара и фосфата, но сахар РНК — это рибоза, а ДНК — дезоксирибоза. Сахар ДНК содержит на один атом кислорода меньше, и это различие отражено в их названиях: ДНК — это прозвище дезоксирибонуклеиновой кислоты, РНК — рибонуклеиновая кислота.

Идентичные копии ДНК находятся в каждой отдельной клетке организма, от клетки легкого до мышечной клетки и нейрона. РНК вырабатывается по мере необходимости в ответ на динамическую клеточную среду и насущные потребности организма.Задача мРНК — помочь запустить клеточный аппарат для создания белков, кодируемых ДНК, подходящих для того времени и места.

Процесс преобразования ДНК в мРНК в белок является основой функционирования клетки.

[ Исследования коронавируса и другие научные новости Подпишитесь на научный бюллетень The Conversation.]

Запрограммирован на самоуничтожение

Как посредник, мРНК является важным механизмом безопасности в клетке.Он не позволяет захватчикам захватить клеточный аппарат для производства чужеродных белков, потому что любая РНК вне клетки мгновенно подвергается разрушению ферментами, называемыми РНКазами. Когда эти ферменты распознают структуру и U в коде РНК, они стирают сообщение, защищая клетку от ложных инструкций.

мРНК также дает клетке возможность контролировать скорость производства белка, включая или выключая схемы по мере необходимости. Ни одна клетка не хочет производить каждый белок, описанный во всем вашем геноме, одновременно.

Инструкции

Messenger RNA рассчитаны на самоуничтожение, как исчезающий текст или сообщение Snapchat. Структурные особенности мРНК — буква U в коде, ее одноцепочечная форма, сахар рибоза и ее специфическая последовательность — гарантируют, что мРНК имеет короткий период полужизни. Сочетание этих функций позволяет «прочитать» сообщение, преобразовать его в белки, а затем быстро уничтожить — в течение нескольких минут для некоторых белков, которые необходимо строго контролировать, или до нескольких часов для других.

Как только инструкции исчезают, производство белка прекращается до тех пор, пока белковые фабрики не получат новое сообщение.

Использование мРНК для вакцинации

Все характеристики мРНК вызвали большой интерес у разработчиков вакцин. Цель вакцины — заставить вашу иммунную систему реагировать на безвредную версию или часть микроба, чтобы, столкнувшись с настоящей вещью, вы были готовы с ней бороться. Исследователи нашли способ ввести и защитить сообщение мРНК с кодом для части белка-шипа на поверхности вируса SARS-CoV-2.

Вакцины с матричной РНК заставляют организм реципиента производить вирусный белок, который затем стимулирует желаемый иммунный ответ. Trinset / iStock через Getty Images Plus

Вакцина обеспечивает ровно столько мРНК, чтобы синтезировать достаточное количество спайкового белка для иммунной системы человека, чтобы генерировать антитела, которые защищают его, если он позже подвергнется воздействию вируса. МРНК вакцины вскоре разрушается клеткой, как и любая другая мРНК. МРНК не может попасть в ядро ​​клетки и не может повлиять на ДНК человека.

Хотя это новые вакцины, основная технология была первоначально разработана много лет назад и постепенно улучшалась с течением времени. В результате вакцины прошли тщательную проверку на безопасность. Успех этих мРНК-вакцин против COVID-19 с точки зрения безопасности и эффективности предсказывает светлое будущее для новых вакцинных методов лечения, которые можно быстро адаптировать к новым возникающим угрозам. Клинические испытания на ранней стадии с использованием мРНК-вакцин уже были проведены против гриппа, вируса Зика, бешенства и цитомегаловируса.Конечно, творческие ученые уже рассматривают и разрабатывают методы лечения других заболеваний или расстройств, которые могут выиграть от подхода, аналогичного тому, который используется для вакцин против COVID-19.

Обзор систем экспрессии белков | Thermo Fisher Scientific

Экспрессия белка относится к способу, которым белки синтезируются, модифицируются и регулируются в живых организмах. В исследованиях белков этот термин может применяться либо к объекту исследования, либо к лабораторным методам, необходимым для производства белков.В этой статье основное внимание уделяется последнему значению выражения белка. Однако с практической точки зрения производство рекомбинантного белка зависит от использования клеточного аппарата.

Просмотр и выбор продуктов

Введение в экспрессию белков

Белки синтезируются и регулируются в зависимости от функциональной потребности клетки. Чертежи белков хранятся в ДНК и декодируются с помощью строго регулируемых процессов транскрипции для производства информационной РНК (мРНК).Сообщение, закодированное мРНК, затем транслируется в белок. Транскрипция — это передача информации от ДНК к мРНК, а трансляция — это синтез белка на основе последовательности, указанной мРНК.

Простая схема транскрипции и перевода. Это описывает общий поток информации от последовательности пар оснований ДНК (гена) к последовательности аминокислотного полипептида (белка).

---

У прокариот процессы транскрипции и трансляции происходят одновременно.Трансляция мРНК начинается еще до полного синтеза зрелого транскрипта мРНК. Эта одновременная транскрипция и трансляция гена называется сопряженной транскрипцией и трансляцией. У эукариот процессы пространственно разделены и происходят последовательно: транскрипция происходит в ядре, а трансляция или синтез белка происходит в цитоплазме.

Сравнение транскрипции и трансляции у прокариот и эукариот.

Справочник по экспрессии белков

Это 118-страничное руководство содержит исчерпывающую информацию об экспрессии белков и поможет вам выбрать правильную систему экспрессии и технологии очистки для вашего конкретного применения и потребностей.Получите советы и рекомендации перед началом эксперимента и найдите ответы на повседневные проблемы, связанные с экспрессией белка.

Справочник по экспрессии белков

›


---

Транскрипция и перевод

Транскрипция происходит в три этапа как у прокариот, так и у эукариот: инициация, удлинение и завершение. Транскрипция начинается, когда двухцепочечная ДНК разматывается для связывания РНК-полимеразы. Как только транскрипция инициируется, РНК-полимераза высвобождается из ДНК.Транскрипция регулируется на различных уровнях активаторами и репрессорами, а также структурой хроматина у эукариот. У прокариот не требуется специальной модификации мРНК, и трансляция сообщения начинается еще до завершения транскрипции. У эукариот, однако, мРНК дополнительно обрабатывается для удаления интронов (сплайсинг), добавления кэпа на 5´ конце и множественных аденинов на 3´ конце мРНК с образованием полиА-хвоста. Затем модифицированная мРНК экспортируется в цитоплазму, где она транслируется.

Трансляция или синтез белка — это многоступенчатый процесс, для которого требуются макромолекулы, такие как рибосомы, транспортная РНК (тРНК), мРНК и белковые факторы, а также небольшие молекулы, такие как аминокислоты, АТФ, ГТФ и другие кофакторы. Для каждого шага трансляции существуют определенные белковые факторы (см. Таблицу ниже). Общий процесс похож как у прокариот, так и у эукариот, хотя существуют определенные различия.

Во время инициации малая субъединица рибосомы, связанная с инициаторной т-РНК, сканирует мРНК, начиная с 5’-конца, для идентификации и связывания инициирующего кодона (AUG).Большая субъединица рибосомы присоединяется к малой субъединице рибосомы, чтобы генерировать комплекс инициации в кодоне инициации. Белковые факторы, а также последовательности мРНК участвуют в распознавании кодона инициации и формировании комплекса инициации. Во время элонгации тРНК связываются со своими назначенными аминокислотами (так называемая зарядка тРНК) и доставляют их к рибосоме, где они полимеризуются с образованием пептида. Последовательность аминокислот, добавленных к растущему пептиду, зависит от последовательности мРНК транскрипта.Наконец, возникающий полипептид высвобождается на стадии терминации, когда рибосома достигает терминального кодона. В этот момент рибосома высвобождается из мРНК и готова начать следующий раунд трансляции.

---

Аппарат для синтеза белка

Краткое изложение основных компонентов и характеристик прокариотического и эукариотического трансляционного аппарата.

Компонент	Прокариоты	Эукариоты
Рибосомы 50000 Субъединицы	Матрица или мРНК	После транскрипции не происходит дальнейшей обработки транскрипта мРНК. мРНК является полицистронной и содержит несколько сайтов инициации.	После транскрипции транскрипт мРНК сплайсируется для удаления некодирующих областей (интронов), и кэп-структура (M7метилгуанозин) и последовательность полиаденозина добавляются в 5 ‘и 3’ конце сообщения соответственно. Структура Cap и поли A важны для экспорта мРНК в цитоплазму, правильной инициации трансляции и стабильности мРНК среди других функций.МРНК обычно моноцистронная.
Особенности трансляции	Последовательность Шайна-Далгарно присутствует в транскрипте мРНК, а комплементарная последовательность присутствует в рибосомной субъединице. Это облегчает связывание и выравнивание рибосомы на мРНК в сайте инициации трансляции (AUG). Первая аминокислота возникающего полипептида — формилированный метионин.	Инициирование трансляции происходит двумя способами: Кэп-зависимая трансляция: структура кэпа и связывающие кэп белки отвечают за правильное связывание рибосомы с мРНК и распознавание правильного инициирующего кодона.Первый кодон AUG на 5’-конце мРНК функционирует как кодон инициации. Иногда последовательность Козака может присутствовать вокруг инициирующего кодона. Cap-независимая трансляция: Связывание рибосомы с мРНК происходит через «внутренний сайт входа в рибосому» (IRES) на мРНК.
Факторы инициации	Известны три фактора инициации, IF1, IF2 и IF3	Более трех факторов инициации, которые регулируются фосфорилированием.Этап инициации — это этап, ограничивающий скорость трансляции эукариот.
Факторы удлинения	EF-Tu и EF-Ts, EF-G	EF1 (α, β, γ) и EF2
967 908 Коэффициенты прерывания или разъединения РФ1 и РФ-2	ЭРФ-1

---

Посттрансляционная модификация

После трансляции полипептиды модифицируются различными способами для завершения своей структуры, определения их местоположения или регулирования их активности в клетке.Посттрансляционные модификации (ПТМ) — это различные дополнения или изменения химической структуры, которые являются критическими характеристиками общей биологии клетки.

Типы посттрансляционных модификаций включают:

• Сворачивание полипептида в глобулярный белок с помощью белков-шаперонов для достижения самого низкого энергетического состояния
• Модификации присутствующих аминокислот, такие как удаление первого остатка метионина
• Образование или восстановление дисульфидного мостика
• Модификации белка, облегчающие связывающие функции:
  • Гликозилирование
  • Пренилирование белков для локализации на мембране
  • Ацетилирование гистонов для модификации взаимодействия ДНК-гистонов
• Добавление функциональных групп, регулирующих активность белка:
  • Фосфорилирование
  • Нитрозилирование
  • Связывание GTP

---

Способы экспрессии рекомбинантных белков

В общем, протеомные исследования включают изучение любого аспекта белка, такого как структура, функция, модификации, локализация или взаимодействия белков.Чтобы изучить, как определенные белки регулируют биологию, исследователям обычно требуются средства производства (производства) представляющих интерес функциональных белков.

Учитывая размер и сложность белков, химический синтез не является жизнеспособным вариантом для этой цели. Вместо этого живые клетки и их клеточные механизмы обычно используются как фабрики для создания и конструирования белков на основе предоставленных генетических шаблонов.

В отличие от белков, ДНК просто построить синтетически или in vitro с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов рекомбинантной ДНК.Следовательно, ДНК-матрицы конкретных генов с дополнительными репортерными последовательностями или последовательностями аффинных меток или без них могут быть сконструированы в качестве матриц для экспрессии белка. Белки, полученные из таких шаблонов ДНК, называются рекомбинантными белками.

Традиционные стратегии экспрессии рекомбинантного белка включают трансфекцию клеток ДНК-вектором, который содержит матрицу, а затем культивирование клеток, чтобы они транскрибировали и транслировали желаемый белок. Обычно затем клетки лизируют, чтобы извлечь экспрессированный белок для последующей очистки.Как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии белка in vivo широко используются. Выбор системы зависит от типа белка, требований к функциональной активности и желаемого выхода. Эти системы экспрессии приведены в таблице ниже и включают в себя млекопитающих, насекомых, дрожжи, бактерии, водоросли и бесклеточные. Каждая система имеет свои преимущества и проблемы, и выбор правильной системы для конкретного применения важен для успешной экспрессии рекомбинантного белка.В следующей таблице представлен обзор систем экспрессии рекомбинантных белков.

Системы экспрессии рекомбинантных белков.

---

Экспрессия белков млекопитающих

Экспрессионные системы млекопитающих могут быть использованы для получения белков млекопитающих, которые имеют наиболее естественную структуру и активность благодаря своей физиологически релевантной среде. Это приводит к высокому уровню посттрансляционной обработки и функциональной активности. Системы экспрессии млекопитающих являются предпочтительной системой для экспрессии белков млекопитающих и могут использоваться для продукции антител, сложных белков и белков для использования в функциональных клеточных анализах.Однако эти преимущества сочетаются с более требовательными условиями выращивания.

Экспрессионные системы млекопитающих могут использоваться для временной продукции белков или через стабильные клеточные линии, где экспрессионная конструкция интегрирована в геном хозяина. В то время как стабильные клеточные линии можно использовать в нескольких экспериментах, временная продукция может генерировать большое количество белка за одну-две недели. Эти временные высокопроизводительные экспрессионные системы млекопитающих используют суспензионные культуры и могут давать выход в граммах на литр.Кроме того, эти белки имеют больше нативных фолдинговых и посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, по сравнению с другими системами экспрессии. В следующем примере для экспрессии рекомбинантных белков использовали 3 различных экспрессионных системы млекопитающих.

Выход рекомбинантного белка. Системы экспрессии Gibco FreeStyle CHO, Expi293 и ExpiCHO использовали для временной экспрессии человеческого IgG, кроличьего IgG и EPO (эритропоэтина) с использованием pcDNA 3.4 вектор экспрессии. Протокол Max Titer использовался для ExpiCHO, и белки собирали на 10–12 день. Для FreeStyleCHO и Expi293 белки собирали на 6 или 7 день. Все белки количественно определяли с помощью ForteBio Octet или ELISA. Использование ExpiCHO приводит к более высоким титрам белка по сравнению с FreeStyle CHO и Expi293.

Посмотрите это видео о том, как производить рекомбинантные белки с помощью системы экспрессии ExpiCHO.

---

Экспрессия белка насекомых

Клетки насекомых можно использовать для экспрессии белка высокого уровня с модификациями, аналогичными системам млекопитающих.Существует несколько систем, которые можно использовать для получения рекомбинантного бакуловируса, который затем можно использовать для экспрессии представляющего интерес белка в клетках насекомых. Эти системы можно легко масштабировать и адаптировать к суспензионной культуре высокой плотности для крупномасштабной экспрессии белка, который более функционально подобен нативному белку млекопитающих. Хотя выходы могут достигать 500 мг / л, получение рекомбинантного бакуловируса может занять много времени, а условия культивирования более сложны, чем прокариотические системы.

Сводка протокола системы экспрессии бакуловирусов. Система экспрессии бакуловирусов Invitrogen BaculoDirect использует технологию Invitrogen Gateway для клонирования. После 1-часовой реакции рекомбиназы и трансфекции клеток насекомых продуцируется бакуловирус, содержащий интересующий ген. Затем можно провести быстрый тест на экспрессию, прежде чем увеличивать вирусный запас и увеличивать экспрессию. Использование этой системы позволяет экспрессировать бакуловирус в клетках насекомых.

---

Экспрессия бактериального белка

Системы экспрессии бактериального белка популярны, потому что бактерии легко культивируются, быстро растут и производят высокие выходы рекомбинантного белка. Однако мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны, потому что клетки не оснащены для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного фолдинга. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые очень трудно восстановить без резких денатурирующих агентов и последующих громоздких процедур рефолдинга белков.В следующем примере систему на основе бактериальных клеток использовали для экспрессии 8 различных рекомбинантных белков.

Экспрессия белка в бактериальных клетках. Клонирование шлюза использовали для клонирования 8 белков человека в вектор Invitrogen Champion pET300 / NT-DEST. BL21 (DE3) E. coli использовали для экспрессии положительных клонов либо в LB + IPTG (1), либо в готовой к использованию среде Invitrogen MagicMedia (2), либо в среде MagicMedia, приготовленной из порошка (3). Образцы лизировали и анализировали на окрашенном красителем кумасси синим красителем Invitrogen NuPAGE 4-12% геле с белком бис-трис.M = стандарт протеина Invitrogen SeeBlue. Использование среды MagicMedia E. coli приводит к более высокому выходу белка для разных образцов.

---

Внеклеточная экспрессия белка

Внеклеточная экспрессия белка — это синтез белка in vitro с использованием совместимых с трансляцией экстрактов целых клеток. В принципе, экстракты целых клеток содержат все макромолекулы и компоненты, необходимые для транскрипции, трансляции и даже посттрансляционной модификации.Эти компоненты включают РНК-полимеразу, регуляторные белковые факторы, факторы транскрипции, рибосомы и тРНК. При добавлении кофакторов, нуклеотидов и специфической генной матрицы эти экстракты могут синтезировать интересующие белки за несколько часов.

Хотя и не является устойчивым для крупномасштабного производства, бесклеточные системы экспрессии белка или системы экспрессии белка in vitro трансляции (IVT) in vitro, имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными системами in vivo . Бесклеточная экспрессия позволяет быстро синтезировать рекомбинантные белки без хлопот с культивированием клеток.Бесклеточные системы позволяют маркировать белки модифицированными аминокислотами, а также экспрессировать белки, которые подвергаются быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. Кроме того, бесклеточный метод упрощает одновременную экспрессию множества различных белков (например, тестирование мутаций белка путем экспрессии в небольшом масштабе из множества различных матриц рекомбинантной ДНК). В этом репрезентативном эксперименте использовали систему IVT для экспрессии белка каспазы 3 человека.

Экспрессия каспазы-3 в системе IVT человека. Каспаза-3 была экспрессирована с использованием набора Thermo Scientific для одностадийной человеческой высокопроизводительной IVT (Human IVT) и в E. coli (рекомбинантный). Активность каспазы-3 определяли с использованием равных количеств белка. Белок каспазы-3, экспрессируемый с помощью системы IVT, был более активен по сравнению с белком, экспрессируемым в бактериях.

---

Химический синтез белка

Химический синтез белков может использоваться для приложений, требующих белков, меченных неприродными аминокислотами, белков, меченных в определенных местах, или белков, токсичных для биологических систем экспрессии.Химический синтез дает очень чистый белок, но работает только с небольшими белками и пептидами. При химическом синтезе выход часто бывает довольно низким, а для более длинных полипептидов этот метод непомерно дорог.

---

1. Иматака Х., Миками С. (2009) Преимущества систем бесклеточного синтеза белков, полученных из клеток человека. Seikagaku 81 (4): 303–7.
2. Mikami S et al. (2008) Полученная из клеток человека связанная in vitro система транскрипции / трансляции, оптимизированная для продукции рекомбинантных белков. Protein Expr Purif 62 (2): 190–8.
3. Кобаяши Т. и др. (2007) Улучшенная бесклеточная система синтеза пикорнавирусов. J Virol Methods 142 (1-2): 182–8.
4. Mikami S et al. (2006) Основанная на гибридоме система трансляции in vitro , которая эффективно синтезирует гликопротеины. J Biotechnol 127 (1): 65–78.
5. Mikami S et al. (2006) Эффективная бесклеточная система трансляции млекопитающих, дополненная факторами трансляции. Protein Expr Purif 46 (2): 348–57.

Что такое мРНК? — Техас A&M Сегодня

МРНК

является важным посланником, несущим инструкции для жизни от ДНК к остальной части клетки.

---

Getty Images

Удивительной звездой пандемического ответа на коронавирус стала молекула, называемая мРНК. Это ключевой ингредиент вакцин Pfizer и Moderna от COVID-19. Но сама мРНК — не новое изобретение лаборатории. Он возник миллиарды лет назад и естественным образом присутствует в каждой клетке вашего тела.Ученые считают, что РНК возникла у самых ранних форм жизни, еще до того, как появилась ДНК.

Вот краткий курс того, что такое мРНК и какую важную работу она выполняет.

Познакомьтесь с генетическим посредником

Вы, наверное, знаете о ДНК. Это молекула, которая содержит все ваши гены, обозначенные четырехбуквенным кодом — A, C, G и T.

ДНК находится внутри клеток каждого живого существа. Он защищен частью клетки, называемой ядром. Гены — это детали в схеме ДНК для всех физических характеристик, которые делают вас уникальным.

Но информация от ваших генов должна поступать от ДНК в ядре к основной части клетки — цитоплазме, где собираются белки. Клетки полагаются на белки для выполнения многих процессов, необходимых для функционирования организма. Вот где на помощь приходит информационная РНК, или для краткости мРНК.

Разделы кода ДНК транскрибируются в сокращенные сообщения, которые представляют собой инструкции по созданию белков. Эти сообщения — мРНК — транспортируются в основную часть клетки.Как только мРНК прибывает, клетка может производить определенные белки по этим инструкциям.

Структура РНК похожа на ДНК, но имеет некоторые важные отличия. РНК представляет собой однонитку кодовых букв (нуклеотидов), а ДНК — двухцепочечную. Код РНК содержит U вместо Т-урацила вместо тимина. И РНК, и структуры ДНК имеют основу, состоящую из молекул сахара и фосфата, но сахар РНК — это рибоза, а ДНК — дезоксирибоза. Сахар ДНК содержит на один атом кислорода меньше, и это различие отражено в их названиях: ДНК — это прозвище дезоксирибонуклеиновой кислоты, РНК — рибонуклеиновая кислота.

Идентичные копии ДНК находятся в каждой отдельной клетке организма, от клетки легкого до мышечной клетки и нейрона. РНК вырабатывается по мере необходимости в ответ на динамическую клеточную среду и насущные потребности организма. Задача мРНК — помочь запустить клеточный аппарат для создания белков, кодируемых ДНК, подходящих для того времени и места.

Процесс преобразования ДНК в мРНК в белок является основой функционирования клетки.

Запрограммирован на самоуничтожение

Как посредник, мРНК является важным механизмом безопасности в клетке.Он не позволяет захватчикам захватить клеточный аппарат для производства чужеродных белков, потому что любая РНК вне клетки мгновенно подвергается разрушению ферментами, называемыми РНКазами. Когда эти ферменты распознают структуру и U в коде РНК, они стирают сообщение, защищая клетку от ложных инструкций.

мРНК также дает клетке возможность контролировать скорость производства белка, включая или выключая схемы по мере необходимости. Ни одна клетка не хочет производить каждый белок, описанный во всем вашем геноме, одновременно.

Инструкции

Messenger RNA рассчитаны на самоуничтожение, как исчезающий текст или сообщение Snapchat. Структурные особенности мРНК — буква U в коде, ее одноцепочечная форма, сахар рибоза и ее специфическая последовательность — гарантируют, что мРНК имеет короткий период полужизни. Сочетание этих функций позволяет «прочитать» сообщение, преобразовать его в белки, а затем быстро уничтожить — в течение нескольких минут для некоторых белков, которые необходимо строго контролировать, или до нескольких часов для других.

Как только инструкции исчезают, производство белка прекращается до тех пор, пока белковые фабрики не получат новое сообщение.

Использование мРНК для вакцинации

Все характеристики мРНК вызвали большой интерес у разработчиков вакцин. Цель вакцины — заставить вашу иммунную систему реагировать на безвредную версию или часть микроба, чтобы, столкнувшись с настоящей вещью, вы были готовы с ней бороться. Исследователи нашли способ ввести и защитить сообщение мРНК с кодом для части белка-шипа на поверхности вируса SARS-CoV-2.

Вакцина обеспечивает ровно столько мРНК, чтобы производить ровно столько белка-спайка, чтобы иммунная система человека вырабатывала антитела, которые защищают его, если он позже подвергнется воздействию вируса.МРНК вакцины вскоре разрушается клеткой, как и любая другая мРНК. МРНК не может попасть в ядро ​​клетки и не может повлиять на ДНК человека.

Хотя это новые вакцины, основная технология была первоначально разработана много лет назад и постепенно улучшалась с течением времени. В результате вакцины прошли тщательную проверку на безопасность. Успех этих мРНК-вакцин против COVID-19 с точки зрения безопасности и эффективности предсказывает светлое будущее для новых вакцинных методов лечения, которые можно быстро адаптировать к новым возникающим угрозам.Клинические испытания на ранней стадии с использованием мРНК-вакцин уже были проведены против гриппа, вируса Зика, бешенства и цитомегаловируса. Конечно, творческие ученые уже рассматривают и разрабатывают методы лечения других заболеваний или расстройств, которые могут выиграть от подхода, аналогичного тому, который используется для вакцин против COVID-19.

.