Липолитики для похудения живота: Липолитики для лица и похудения живота в Тюмени — цены на услуги

( A ) Экспрессия генов, кодирующих миелоидно-макрофагальные белки в перигонадальной жировой ткани. Черные столбцы представляют мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которым в течение различных интервалов времени подвергались ограничения в калориях. Белые столбики представляют контрольных худых мышей, которых кормили пищевой диетой (CD) и которые не подвергались ограничению калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в перигонадальных срезах жировой ткани мышей во время потери веса после указанного количества дней ограничения калорийности.Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( C ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани. n = 5–6 мышей / группа. ( D ) Взаимосвязь между содержанием макрофагов и массой тела у мышей в течение первых 7 дней потери веса (левая панель) и в течение 14-60 дней потери веса (правая панель). Показаны квадратные значения коэффициентов корреляции Пирсона. Каждая точка данных представляет собой% макрофагов в перигонадальной жировой ткани мышей при разном весе тела во время ограничения калорийности.( E ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в срезах подкожной жировой ткани. Масштабные линейки: 50 мкм. ( F ) Макрофаги в процентах от всех клеток подкожной жировой ткани мышей во время потери веса. n = 5–6 мышей / группа. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по сравнению с днем ​​0.

Раннее первоначальное увеличение содержания ATM не было уникальным для перигонадальной жировой ткани.В соответствии с предыдущими данными у мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, в подкожной жировой ткани содержание ATM было ниже, чем в перигонадной жировой ткани (2, 32). Однако после 3 дней ограничения калорий содержание АТМ удвоилось в подкожных депо (макрофаги в процентах от всех клеток: 10,0 ± 3,1% против 20,2 ± 7,4%; P <0,05; рис. E и F) . Как в перигонадных, так и в подкожных депо количество АТМ постепенно уменьшалось после 3 дней отрицательного энергетического баланса, так что после 42 дней ограничения калорий содержание АТМ было значительно ниже, чем в жировой ткани мышей с высоким содержанием жира, которые никогда не ограничивались калорийностью ( Рисунок, B, C, E и F).

Было высказано предположение, что во время набора веса накопление АТМ вызвано некрозом адипоцитов, ремоделированием ткани или микрогипоксией. Первоначальное увеличение ATM в ответ на потерю веса не было связано со снижением количества адипоцитов, как можно было бы ожидать, если некроз адипоцитов приводил к накоплению ATM (дополнительный рисунок 1F). Также пик в ATM не совпал с активацией транскрипционной программы ремоделирования жировой ткани (дополнительный рисунок 8).

Показатели липолиза коррелируют с содержанием АТМ.

Первоначальное увеличение количества банкоматов было связано с изменениями концентрации циркулирующих FFA и показателей липолиза. Базальный липолиз в жировой ткани — это высвобождение FFA из адипоцитов, которое происходит при отсутствии отрицательного энергетического баланса. Базальный липолиз увеличивается в жировой ткани у лиц с ожирением и положительно коррелирует с размером адипоцитов (25). Липолиз по требованию — это гормонально и автономно управляемое высвобождение FFA из триглицеридов адипоцитов, которое активируется отрицательным энергетическим балансом, когда FFA мобилизуются из жировой ткани для системного использования в качестве субстратов (25).Модель, в которой липолиз регулирует накопление АТМ, согласуется с предыдущими наблюдениями за людьми со стабильным весом или набором веса: у тучных мышей с большими адипоцитами наблюдается более высокий базальный липолиз жировой ткани и большее содержание АТМ, чем у тощих животных. Во время ранней потери веса, когда размер адипоцитов существенно не изменился, базальный липолиз остается высоким, а потребность в липолизе увеличивается, и, таким образом, мы прогнозируем чистое увеличение общего липолиза. Но по мере уменьшения массы жировой ткани и размера адипоцитов также уменьшается базальный липолиз и уменьшается чистый отток липидов из жировой ткани.Концентрации FFA в сыворотке коррелируют с общей скоростью липолиза и потоками жирных кислот в жировой ткани (25, 35). Следовательно, если липолиз действительно играет роль в накоплении ATM, мы предсказали, что FFA в сыворотке будет коррелировать с содержанием ATM у наших мышей с ограничением калорийности. Действительно, сывороточные концентрации FFA были выше на 3-й день ограничения калорий, до значительной потери веса, и совпадали с пиком содержания макрофагов (Рисунок A). В соответствии с нашей гипотезой существовала положительная корреляция между концентрацией FFA в сыворотке и процентом ATM в перигонадной жировой ткани на протяжении всего периода ограничения калорийности (Рисунок B).

( A ) Концентрации FFA в сыворотке во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. Черные столбцы представляют мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которым в течение различных интервалов времени подвергались ограничения в калориях. Белая полоса представляет контрольных худых мышей, которых кормили кормовой диетой и которые не подвергались ограничению калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Корреляция содержания макрофагов (% макрофагов) и концентрации FFA в сыворотке у мышей во время потери веса; показано квадратное значение коэффициента корреляции Пирсона. n = 5–6 мышей / группа. Каждая точка данных представляет собой% макрофагов в перигонадальной жировой ткани мыши при различных концентрациях FFA в сыворотке. ( C ) Экспрессия в перигонадной жировой ткани гена, кодирующего липазу ATGL, у мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( D ) Высвобождение FFA из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, инкубированных в базовых условиях. Эксплантаты были изолированы от мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или которые подвергались ограничению калорийности в течение 3 или 42 дней.( E ) Высвобождение глицерина из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, инкубированных в базовых условиях. Эксплантаты были изолированы от мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или которые подвергались ограничению калорийности в течение 3 или 42 дней. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с днем ​​0.

В жировой ткани лимитирующая стадия как базального липолиза, так и липолиза по потребности регулируется ферментом, кодируемым Atgl / Pnpla2 . Экспрессия Atgl / Pnpla2 регулируется нутриционным статусом и тесно коррелирует со скоростью липолиза жировой ткани (36).В соответствии с пиком липолиза жировой ткани на 3-й день ограничения калорийности экспрессия Atgl / Pnpla2 в жировой ткани увеличивалась на 3-й день ограничения калорийности и возвращалась к исходному уровню на 42-й день (Рисунок C). Напротив, экспрессия гормоночувствительной липазы, кодируемой Hsl / Lipe , не коррелирует со статусом питания. Уровни мРНК Hsl / Lipe подавляются во время острого голодания и повышаются только после длительного голодания (36).В соответствии с этими данными, мы не наблюдали никаких изменений в уровнях Hsl / Lipe во время ограничения калорийности (дополнительный рисунок 9A).

Циркулирующие концентрации FFA и экспрессия Atgl / Pnpla2 обеспечивали косвенные измерения липолиза жировой ткани. Для прямого измерения липолиза в жировой ткани во время ограничения калорийности скорости высвобождения неэтерифицированных FFA и глицерина измеряли в перигонадальной жировой ткани мышей во время ограничения калорийности.В соответствии с нашими косвенными измерениями, липолиз увеличивался в жировой ткани мышей после 3 дней ограничения калорий по сравнению с жировой тканью мышей, получавших ad libitum (рисунок, D и E). Высвобождение FFA и глицерина снизилось через 42 дня. Эти данные демонстрируют положительную корреляцию между липолизом жировой ткани и содержанием АТМ. Чтобы напрямую определить, влияет ли увеличение или уменьшение липолиза на накопление АТМ, мы провели ряд диетических, фармакологических и генетических манипуляций.

Липолиз вызывает накопление АТМ.

Если липолиз вызывает накопление АТМ в жировой ткани, то голодание, которое быстро увеличивает гидролиз триглицеридов жировой тканью, также должно увеличивать содержание АТМ. Перигонадную жировую ткань собирали у мышей C57BL / 6J с ожирением, получавших пищу с высоким содержанием жира, которые либо не голодали в течение 24 часов, либо кормились ad libitum. Голодание вызывало увеличение концентрации FFA в сыворотке (рис. A) и приводило к быстрому накоплению ATM. По сравнению с жировой тканью мышей, получавших ad libitum, жировая ткань голодных мышей содержала на 65% больше ATM (процент макрофагов на общее количество клеток: 22.9% ± 6% против 37,9% ± 3,5%; P <0,01; Рисунок, Б – Г). Накопление ATM, вызванное голоданием, не ограничивалось тучными мышами. У худых мышей экспрессия генов, специфичных для макрофагов, Emr1 и Csf1r , увеличивалась в 3 и 4 раза соответственно после 24-часового голодания (Рисунок E). В соответствии с нашими наблюдениями, что ограничение калорийности не вызывает накопление ATM CD11c ⁺ , экспрессия Itgax ( Cd11c ) не изменяется при голодании (Рисунок E).

( A ) Концентрации FFA в сыворотке у мышей с ожирением ad libitum, получавших пищу ad libitum и голодавших 24 часа в сутки, вызванных диетой с высоким содержанием жиров. n = 5–6 мышей / группа. ** P <0,01, по сравнению с кормлением ad libitum (кормление Ad lib). ( B и C ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1) в перигонадальных срезах жировой ткани от мышей с ожирением, индуцированного диетой с высоким содержанием жиров, получавших ad libitum ( B ) и мышей, голодавших 24 часа (). С ).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( D ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадной жировой ткани от мышей с ожирением ad libitum, получавших пищу ad libitum и голодавших 24 часа в сутки, вызванного диетой с высоким содержанием жиров. n = 5–6 мышей / группа. ** P <0,01 по сравнению с кормлением ad libitum. ( E ) Экспрессия генов, кодирующих белки, специфичные для миелоидных макрофагов, у мышей, получавших постное питание ad libitum и голодавших 24 часа в сутки. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05 по сравнению с кормлением ad libitum.( F ) Протокол фармакологически индуцированного липолиза адипоцитов с помощью β3-адренергического агониста (CL316,243) у худых мышей. ( G — I ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1) в перигонадальных срезах жировой ткани от тощих мышей, получавших носитель ( G ) или CL316,243 ( H и I ) ). Многоядерные гигантские клетки, содержащие липидные капли, видны на некоторых участках ( I ). Стрелки указывают банкоматы.Масштабные линейки: 50 мкм. ( J ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани от мышей, обработанных носителем и CL316,243. n = 5 мышей / группа. *** P <0,001, по сравнению с носителем. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Активация β3-адренергического рецептора ( Adrb3 ), который у мышей почти исключительно экспрессируется адипоцитами, увеличивает липолиз адипоцитов. Граннеман и его коллеги ранее отмечали, что β3-адренергическая стимуляция приводит к накоплению миелоидных клеток в жировой ткани (37).Чтобы определить, будет ли фармакологическая активация липолиза увеличивать накопление ATM, мы дважды вводили мышам C57BL / 6J (масса тела = 24,5 ± 0,8 г) β3-адренергический агонист CL316,243 с интервалом в 4 часа. Депо жировой ткани собирали через 14 часов после последней инъекции (Рисунок F). По сравнению с контрольными мышами, фармакологическая индукция липолиза быстро увеличивала содержание ATM в перигонадальной жировой ткани более чем в 5 раз, до уровней, типичных для мышей с ожирением (рисунок, G – J).Макрофаги были видны как изолированно, так и в скоплениях (Рисунок, G – I). Таким образом, среди гормональных сигналов, активируемых голоданием, β3-адренергическая индукция липолиза адипоцитов достаточна для индукции быстрого рекрутирования макрофагов. Подобно нашим наблюдениям при ранней потере веса и голодании, рекрутированные β3-адренергические рецепторы макрофаги не увеличивают воспалительный фенотип жировой ткани (дополнительный рисунок 9E)

Уменьшение липолиза во время похудания или голодания снижает накопление АТМ.

Если наша гипотеза верна, то манипуляции, ингибирующие липолиз во время раннего похудания или голодания, должны уменьшить или предотвратить накопление АТМ. Хотя диета с высоким содержанием жиров увеличивает количество пищевых липидов, они также являются кетогенными при отрицательном энергетическом балансе. По сравнению с диетами с высоким содержанием жиров при отрицательном энергетическом балансе, диеты с высоким содержанием углеводов увеличивают соотношение циркулирующего инсулина / глюкагона и снижают мобилизацию липидов и скорость липолиза в жировой ткани (38). Поэтому мы повторили интервенцию по ограничению калорийности, добавив группу мышей соответствующего веса, которые были ограничены в калориях на изокалорийной высокоуглеводной диете (дополнительная таблица 1).Мышей поддерживали ограничение калорийности в течение 3 дней, и мышей в обеих группах в равной степени ограничивали (на 30% меньше калорий, чем их потребление ad libitum). В конце ограничения калорийности не было никакой разницы в весе между группами с ограничением калорийности диеты с высоким и высоким содержанием углеводов. Однако, как и ожидалось, концентрация FFA в сыворотке мышей с ограничением калорийности рациона с высоким содержанием углеводов была на 36% ниже, чем у мышей с ограничением калорийности рациона с высоким содержанием жиров (0,38 ± 0,11 против 0.59 ± 0,07 ммоль / л; P <0,05) (Рисунок A). В соответствии с нашей гипотезой, во время потери веса содержание ATM было на 35% ниже (31,1% ± 4,1% против 20,1% ± 5,2%; P <0,05) в перигонадальной жировой ткани у мышей, получавших высокоуглеводную диету, по сравнению с таковыми. питались диетой с высоким содержанием жиров (Рисунок, B и C).

Протокол ограничения калорийности использовался, чтобы вызвать потерю веса с более низкой скоростью липолиза по сравнению с ограничением калорийности мышей на диете с высоким содержанием жиров.Мышей с ожирением, вызванным высокожировой диетой, кормили 70% от их калорийности ad libitum в течение 3 дней в виде диеты с высоким содержанием углеводов или жиров. ( A ) Сыворотка FFA у мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности диеты с высоким содержанием жиров или углеводов. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Срезы перигонадной жировой ткани мышей во время потери веса, вызванной диетой с высоким содержанием жиров (левая панель) или высоким содержанием углеводов (правая панель).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( C ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности диеты с высоким содержанием жиров или углеводов. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05, по сравнению с ограничением калорийности HFD. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Жировая триглицерид липаза (также известная как деснутрин или протеин 2, содержащий пататин-подобный домен фосфолипазы) ( Atgl / Pnpla2 ) регулирует как базальный, так и необходимый липолиз в жировой ткани.Животные с дефицитом ATGL / PNPLA2 серьезно нарушены в их способности мобилизовать FFA, имеют очень низкий базальный липолиз и неспособны повышать потребность в липолизе в ответ на голодание, несмотря на сохранность гормонального и вегетативного ответа на голодание (36). Чтобы предоставить генетические доказательства того, что липолиз является критическим детерминантом содержания ATM, мы изучили эффекты голодания на мышах Atgl / Pnpla2 ^{— / —} . В соответствии с нашей гипотезой, мы обнаружили, что ad libitum — кормил Atgl / Pnpla2 ^{— / —} мышей имеет менее 3% банкоматов и что после голодания не было увеличения количества банкоматов (рисунок, A и B). или экспрессия генов, специфичных для макрофагов (рис. C).Эти данные свидетельствуют о том, что липаза ATGL / PNPLA2 необходима для рекрутирования и накопления ATM в жировой ткани.

( A ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в перигонадальных срезах жировой ткани из Atgl ^{+ / +} (верхняя панель) и Atgl ^{— / —} (нижняя панель) мышей, которых кормили ad libitum (слева) или голодали (справа).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 100 мкм. ( B ) Макрофаги в процентах от всех клеток у мышей Atgl ^{+ / +} , получавших постное питание ad libitum, и мышей Atgl ^{— / —} , получавших голодное питание. n = 4–5 мышей / группа. *** P <0,001 по сравнению с кормлением ad libitum. ( C ) Экспрессия генов, специфичных для макрофагов, в перигонадальной жировой ткани мышей Atgl ^{— / —} , получавших без ограничений и голодавших без пищи. n = 4–5 мышей / группа. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Липолиз жировой ткани вызывает миграцию макрофагов.

Скорость митоза в жировой ткани голодных мышей была очень низкой (<2%) и не отличалась от скорости митоза в жировой ткани у мышей, получавших ad libitum (дополнительные рисунки 9, B и C), что позволяет предположить, что липолиз -зависимое увеличение ATM было не из-за пролиферации, а следствием рекрутирования миелоидных клеток. Чтобы определить, увеличивает ли липолиз высвобождение хемоаттрактантов жировой ткани для макрофагов, мы выполнили анализ миграции с эксплантатами жировой ткани от голодных и получающих неограниченное питание мышей.Эксплантаты перигонадной жировой ткани собирали у тощих мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали в базовых условиях или с добавлением изопротеренола для индукции липолиза. Как и ожидалось, по сравнению с жировой тканью, выделенной от мышей, получавших ad libitum, жировая ткань от голодных мышей или жировая ткань, обработанная изопротеренолом, увеличивала липолиз, о чем свидетельствует увеличение высвобождения FFA (Рисунок A). При таком увеличении липолиза пропорционально увеличивалась хемотаксическая активность жировой ткани по отношению к макрофагам, происходящим из костного мозга (BMDM).Это увеличение активности хемоаттрактанта жировой ткани было сопоставимо с таковым, индуцированным MCP-1 / CCL2 (Рисунок B). Мы также обнаружили, что в отличие от голодных мышей дикого типа, голодные CCR2-дефицитные мыши не увеличивали экспрессию генов, специфичных для макрофагов (дополнительная фигура 9D). Однако не наблюдалось увеличения экспрессии в жировой ткани известных лигандов CCR2 во время голодания (данные не показаны). Эти данные согласуются с набором банкоматов во время быстрого многоступенчатого процесса, в котором накопление предшественников ATM в кровотоке зависит от CCR2, но для перехода в депо жира действительно требуется CCR2 или его лиганд.

Эксплантаты перигонадальной жировой ткани выделяли от тощих мышей, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от голодных животных инкубировали в базовых условиях, тогда как эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) или без нее. ( A ) Концентрацию FFA измеряли в среде, кондиционированной эксплантатом. ( B ) Хемотаксическую активность контрольной среды, среды с добавлением MCP-1 / CCL2 (50 нг / мл) и среды, кондиционированной эксплантатом, измеряли с использованием стандартного анализа миграции для BMDM.Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 4, 5–8 повторов на образец. * P <0,05; ** P <0,01.

Снижение веса и липолиз активируют программу поглощения липидов банкоматами.

Основная функция макрофагов — фагоцитоз тканеспецифических продуктов таким образом, чтобы поддерживать гомеостаз ткани. Например, в кости, остеокласте (многоядерный макрофаг кости) резорбция матрикса необходима для поддержания здоровья кости (39).По аналогии, накопление ATM в периоды повышенного липолиза может способствовать поглощению или фагоцитозу избыточных местных липидов и участвовать в обмене липидов в жировой ткани. Действительно, отличительной особенностью АТМ при ожирении является накопление внутриклеточных липидов (19, 29). В жировой ткани людей с ожирением есть банкоматы с множеством липидных капель и другие, которые образуют многоядерные гигантские клетки, содержащие большие одноглазные капли. В соответствии с основной функцией АТМ, заключающейся в поглощении липидов в периоды повышенного высвобождения FFA из адипоцитов, экспрессия в жировой ткани 2 рецепторов транспорта липидов макрофагов, Cd36 и Msr1 , увеличивается в начальный период веса. потеря (рисунок А).К 42 дню ограничения калорийности, когда липолиз жировой ткани снижается, экспрессия этих 2 генов возвращается к уровням, наблюдаемым у мышей, никогда не снижавших веса. Чтобы определить, действительно ли липолиз вызывает накопление липидов в банкоматах, мы исследовали содержание липидных капель в макрофагсодержащих стромальных сосудистых клетках (SVC) после 24-часового голодания. Голодание резко индуцировало образование липидных капель в банкоматах и ​​увеличивало количество липидсодержащих пузырьков на 39% в банкоматах, выделенных натощак, по сравнению с ATM, полученными от тучных мышей C57BL / 6J, получавших ad libitum (17.3 ± 3 против 24,1 ± 4,7 липидных везикул на клетку; P <0,001; Рисунок, Б и В). Голодание также увеличивало экспрессию генов, участвующих в захвате, хранении липидов ( Adfp , aP2 , Cd36 ) и экспорте ( Abca1 и ApoE ) в стромальной сосудистой фракции жировой ткани (Рисунок D). .

( A ) Экспрессию в жировой ткани генов, продукты которых, CD36 (Cd36) и рецептор скавенджера A (Msr1), участвуют в захвате липидов макрофагами, измеряли в перигонадальной жировой ткани во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05; *** P <0,001, по сравнению с нулевым днем ​​( B ) Стромальные сосудистые клетки (SVC), выделенные из перигонадальной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum (левая панель) или голодали. в течение 24 часов (правая панель) окрашивали на нейтральный липид масляным красным О. Масштабные полосы: 50 мкм. ( C ) Количество липидных капель в макрофагах из перигонадной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. n = 5 мышей / группа. *** P <0,001. ( D ) Экспрессия генов (в стромальной сосудистой фракции), кодирующих белки, участвующие в захвате, утилизации и экспорте липидов. n = 5 мышей / группа. * P <0,05. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Чтобы более точно определить, поглощают ли АТМ липиды в ответ на липолиз как таковой, мы создали систему in vitro для оценки эффектов стимулированного адренергическим действием липолиза адипоцитов на функцию АТМ.Мы совместно культивировали SVC, которые включают макрофаги с жировой тканью от тощих мышей C57BL / 6J в присутствии адренергического стимула (изопротеренол). В отсутствие жировой ткани лечение изопротеренолом не влияло на экспрессию гена SVC или накопление липидов (фигура, A и C, и дополнительная фигура 10A). Однако в присутствии жировой ткани изопротеренол индуцировал экспрессию гена Adfp , который кодирует белок липидных капель, покрывающий липидные капли в банкоматах (19).Кроме того, экспрессия Cd36 увеличилась ( P = 0,09) (Рисунок A). Не было активации программы дифференцировки адипоцитов, то есть не было увеличения экспрессии адипонектина или лептина и снижения экспрессии Pparg (дополнительная фигура 10B). Кроме того, совместное культивирование с жировой тканью и, в большей степени, с добавлением стимуляции изопротеренолом, индуцировало экспрессию гена Ccr2 во фракции SVC, потенциально отражая активацию программы хемотаксических макрофагов (Рисунок B).Гистологически индукция липолиза привела к накоплению липидов в SVC (Рисунок, C и D) и увеличила появление многоядерных нагруженных липидами макрофагов, которые обычно наблюдаются в жировой ткани у людей с ожирением (Рисунок E).

( A ) SVC, выделенные из перигонадальной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, культивировали либо отдельно, либо с кусочками перигонадальной жировой ткани (полученными от тощих животных) с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) или без нее для индукции липолиза. во фракции жировой ткани.Измеряли экспрессию генов Adfp и Cd36 в SVC. n = 5 мышей / группа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. ( B ) Экспрессию хемокинового рецептора Ccr2 измеряли в SVC, обработанных, как описано в A . Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 5 мышей / группа. ( C ) SVC, обработанные изопротеренолом, культивированные отдельно (левая панель) или с жировой тканью (правая панель), окрашивали на нейтральный липид масляным красным О. Липидсодержащие клетки отмечены стрелками.Масштабные линейки: 50 мкм. ( D ) Процент липидсодержащих клеток среди SVC, обработанных, как описано в A . n = 5 мышей / группа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; ^† P = 0,09. ( E ) Присутствие насыщенных липидами многоядерных гигантских клеток среди SVC, сокультивированных с жировой тканью в присутствии изопротеренола. Масштабная линейка: 15 мкм.

Истощение макрофагов увеличивает липолиз жировой ткани.

Привлечение ATM и поглощение липидов во время периодов липолиза привело нас к гипотезе о том, что ATM играют роль в регулировании локальных концентраций FFA. Чтобы определить, влияют ли ATM на липолиз или высвобождение липидов, мы удалили ATM из жировой ткани, которая содержала высокую концентрацию макрофагов. Эксплантаты эпидидимальной жировой ткани собирали у мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которые голодали в течение 24 часов. Эксплантаты обрабатывали инкапсулированным в липосомы клодронатом для истощения ATM, а контрольные эксплантаты от тех же животных обрабатывали инкапсулированным в липосомы PBS.Клодронат представляет собой бифосфонат, который вызывает апоптоз макрофагов при фагоцитозе в липосомах. Как и ожидалось, обработка клодронатом снижала примерно на 80% содержание макрофагов, что измерялось по экспрессии маркера макрофагов Emr1 и экспрессируемого макрофагами рецептора скавенджера Msr1 . Истощение макрофагов увеличивает экспрессию липазы Atgl / Pnpla2 в 2,5 раза и увеличивает экспрессию регулируемых жирными кислотами генов Fabp4 / aP2 , Acadl и Dgat1 .Индукция липазы и генов, необходимых для метаболизма жирных кислот, предполагает, что истощение макрофагов увеличивает липолиз и субстраты FFA. Действительно, по сравнению с обработанными контрольными эксплантами жировой ткани, истощенные макрофагами эксплантаты имели на 27% более высокую скорость липолиза, измеренную по высвобождению глицерина. Чтобы оценить, может ли истощение макрофагов иметь аналогичный эффект на метаболизм FFA in vivo, мы внутрибрюшинно вводили худым мышам C57BL / 6J клодронат, инкапсулированный в липосомы, чтобы истощить ATM из депо внутрибрюшной жировой ткани, а затем голодали их в течение 24 часов.Обработка клодронатом по сравнению с контрольной обработкой (инкапсулированный в липосомы PBS) снижала экспрессию генов, специфичных для макрофагов, более чем на 90% (дополнительная фигура 10C). Интраабдоминальное истощение АТМ увеличивало сыворотку натощак (FFA) на 69% по сравнению с контрольными мышами, которым инъецировали липосомы (Рисунок C). Эти данные предоставляют предварительные доказательства того, что функция макрофагов частично ослабляет вызванное липолизом высвобождение FFA.

Затем эксплантаты обрабатывали либо инкапсулированным в липосомы клодронатом, либо инкапсулированным в липосомы PBS. Эксплантаты от одних и тех же мышей обрабатывали в обоих экспериментальных условиях. ( A ) Экспрессия генов, специфичных для макрофагов, и генов, участвующих в метаболизме липидов в эксплантах. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 4 мыши / группа. ( B ) Высвобождение глицерина из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, обработанных либо инкапсулированным в липосомы клодронатом, либо инкапсулированным в липосомы PBS.Клодронат, инкапсулированный в липосомы, вводили внутрибрюшинно худым мышам C57BL / 6J. Мышей не кормили в течение 24 часов, начиная с 3 дня после инъекции, и истощение макрофагов в перигонадной жировой ткани было подтверждено в конце периода голодания (день 4). Инкапсулированный в липосомы PBS также вводили в качестве контроля. ( C ) Концентрация FFA в сыворотке у мышей, получавших клодронат или PBS, после 24-часового голодания. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 8 мышей / группа. * P <0.05; ** P <0,01 по сравнению с обработкой PBS.

Обсуждение

Ожирение порождает сложный иммунный ответ, характерным признаком которого является накопление макрофагов в жировой ткани. Факторы, которые регулируют накопление ATM, четко не определены, и действительно, эффекты других метаболических нарушений на накопление и функцию ATM в значительной степени не исследованы. В других условиях рекрутирование предшественников миелоидных макрофагов происходит в ответ на нарушение функции ткани, обычно в ответ на повреждение или чужеродный патоген, но также в ответ на нарушения липидных потоков (40).Например, в стенке артерии локальный избыток холестерина и липопротеинов через двухэтапный процесс рекрутирования и захвата липидов приводит к накоплению нагруженных липидами макрофагов (пенистых клеток) (41). Заполненные липидами макрофаги также являются характерной находкой в ​​жировой ткани людей с ожирением (19, 29). Поэтому мы предположили, что повышенный поток липидов может также регулировать накопление ATM в депо жировой ткани. Здесь мы показали, что накопление макрофагов в жировой ткани является острой реакцией на потерю веса и регулируется липолизом жировой ткани.Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями липолиза при ожирении. Общий базальный липолиз хронически повышен в жировой ткани у людей с ожирением по сравнению с жировой тканью у худых людей (25) и в интраабдоминальном по сравнению с подкожной жировой тканью (30, 31). Именно в этих условиях и в депо, в которых липолиз выше, содержание АТМ также повышается (2, 5, 18, 33).

Роль банкоматов в развитии воспаления жировой ткани, вызванного ожирением, и связанных с ним патологических последствий, включая инсулинорезистентность, интенсивно изучается.Наши данные о том, что ATM быстро увеличивают захват липидов в ответ на липолиз адипоцитов, предполагают, что ATM могут выполнять адаптивную функцию, по крайней мере, в течение коротких периодов времени, поглощая избыток FFA (рисунок). Подобный процесс лежит в основе развития атером, когда повышенные концентрации холестерина в стенках сосудов приводят к привлечению предшественников макрофагов в субэндотелиальные пространства. Эффективный захват и клиренс липидов из сосудистой сети является адаптивным, пока макрофагальный клиренс холестерина не нарушен.Однако при развитии атером накопление холестерина опережает способность макрофагов очищать липиды; макрофаги поглощают холестерин, но не мигрируют из своего анатомического местоположения. Таким образом, нагруженные холестерином макрофаги со временем образуют пенистые клетки, которые остаются в стенке сосуда и становятся центральным патогенным компонентом атеросклеротических поражений (41). Во время похудания как повышение липолиза, так и увеличение АТМ являются временными. Это говорит о том, что ATM участвуют в поглощении избыточного липида и его выходе из ткани.Однако при ожирении хроническое повышение липолиза и местных концентраций FFA обеспечивает постоянный сигнал для накопления макрофагов. Со временем фенотип АТМ при ожирении, в отличие от того, что наблюдается при потере веса, изменяется так, что популяция CD11c ⁺ , которая описывается как более воспалительная, преобладает и приводит к нарушению местного метаболизма.

Активация липолиза во время ранней потери веса и голодания увеличивает локальное высвобождение FFA (а также глицерина и других побочных продуктов липолиза), вызывая рекрутмент ATM.Однажды задействованные, ATMs фагоцитируют избыток липидов и потенциально секретируют антилиполитические факторы, которые вместе снижают локальные концентрации FFA.

Чтобы понять функции банкоматов, было предпринято множество попыток описать производство воспалительных молекул в банкоматах. Однако, как «профессиональные» фагоциты, макрофаги также эффективны в поглощении замечательного набора молекул, от небольших липидов и колоний патогенов до умирающих и мертвых клеток (42). Присутствие липидных капель в банкоматах, в том числе крупных однокамерных капель в многоядерных гигантских клетках, показало некоторым, что ATM в первую очередь функционируют для фагоцитоза некротических адипоцитов (19).Быстрое появление липидных капель в банкоматах во время голодания, даже у худых животных, предполагает, что привлечение макрофагов к жировой ткани, по крайней мере, во время отрицательного энергетического баланса, является частью скоординированного ответа, который может снизить локальные внеклеточные концентрации FFA.

Было обнаружено, что FFA и другие липиды регулируют состояние активации и иммунную функцию миелоидных клеток и макрофагов. В качестве внеклеточных сигналов жирные кислоты, особенно насыщенные жирные кислоты, активируют классические воспалительные реакции в макрофагах и других иммунных клетках посредством задействования рецепторов распознавания образов, включая TLR (43–45).Наши результаты показывают, что липолиз и повышенные концентрации FFA могут также регулировать накопление макрофагов и делать это без активации провоспалительного или M1-поляризованного состояния. Увеличение количества макрофагов более чем на 40% во время начальной фазы потери веса происходит без увеличения экспрессии воспалительных генов или концентрации циркулирующих адипокинов и поддерживает модель, в которой липиды, помимо их участия в активации ATM, играют важную и особую роль в ATM. набор персонала.

Накопление банкоматов в жировой ткани — это только часть иммунного ответа на ожирение. Т-клетки также рекрутируются в жировую ткань во время развития ожирения (1, 7–9, 11). Если Т-клетки играют роль в жировой ткани, сравнимую с той, что играет в атеромах, субпопуляции Т-клеток могут регулировать набор и функцию ATM и других миелоидных клеток. Сложность иммунного ответа жировой ткани на метаболические нарушения дополнительно увеличивается из-за неоднородности популяций АТМ.Два крупнейших класса ATM можно выделить на основе экспрессии антигенов F4 / 80, CD11b и CD11c; одна популяция экспрессирует все 3 антигена (клетки FBC), а вторая — только F4 / 80 и CD11b (клетки FB) (46, 47). Представленные здесь данные свидетельствуют о том, что в основном клетки FB накапливаются во время отрицательного энергетического баланса. Это контрастирует с развитием ожирения, когда преобладают клетки FBC, и может объяснить, почему накопление ATM во время ранней потери веса не сопровождается увеличением воспаления жировой ткани и резистентности к инсулину.Онтогенез, функции и, в частности, метаболизм свободных жирных кислот и других липидов отдельных субпопуляционных АТМ еще предстоит определить и, вероятно, предоставят механистическое понимание различий в иммунном ответе на ожирение и потерю веса.

Наши результаты подтверждают модель, в которой липолиз жировой ткани способствует привлечению ATM и захвату липидов (рисунок). Эти данные предполагают, что ATM могут играть роль в сдерживании внеклеточного увеличения концентраций FFA в периоды высокого липолиза и, таким образом, могут защищать локальную функцию адипоцитов.В худом состоянии адипоциты накапливают мало липидов, базальный липолиз ограничен, а банкоматов мало. Когда липолиз активируется и концентрации FFA резко увеличиваются, макрофаги быстро накапливаются в жировой ткани без значительного начального увеличения воспаления. После набора, ATMs фагоцитируют избыток липидов, возможно, снижая стресс адипоцитов. Во время потери веса увеличение потребности в липолизе увеличивает локальную концентрацию FFA и, таким образом, рекрутмент ATM. Однако постепенно, по мере уменьшения запасов триглицеридов и снижения базального липолиза, содержание АТМ снижается.При ожирении избыточное накопление липидов большими адипоцитами увеличивает базальный липолиз и, таким образом, чистое высвобождение FFA. Макрофаги привлекаются к жировой ткани, но в отличие от потери веса, при которой липолиз в конечном итоге уменьшается, хроническая стимуляция банкоматов приводит к локальному воспалению и изменению метаболической функции.

Методы

Мыши и протокол потери веса.

Самцов мышей C57BL / 6J были получены из лаборатории Джексона в возрасте 9 недель и размещены индивидуально в вентилируемых клетках из оргстекла в пределах барьера, свободного от патогенов, который поддерживает цикл 12 часов света / 12 часов темноты.Мышей кормили диетой с высоким содержанием жиров (D12492; Research Diets Inc.) (подробности о составе рациона см. В дополнительной таблице 1). Пищевые гранулы помещали на кормушки (Wenzel) для повышения точности измерений потребления пищи. Потребление пищи измеряли ежедневно для каждой мыши индивидуально в течение 1 месяца до начала ограничения калорийности. Ограничение калорийности начинали, когда мышей весили 40–41 г. Мы изменили распределение мышей по разным группам с ограничением калорий, чтобы возраст каждой группы существенно не отличался при умерщвлении (дополнительный рисунок 2).Во время ограничения калорийности каждая мышь получала 70% от своего потребления ad libitum (среднее потребление пищи 70% / средний вес). Контрольная постная группа получала стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc.). Для эксперимента по ограничению калорийности высокоуглеводной диеты мышей переводили на D12450B (Research Diets Inc.) (см. Дополнительную таблицу 1 для получения подробной информации о составе диеты). Потребление пищи корректировали ежедневно в зависимости от веса мыши. Мышей кормили в начале цикла темноты и света (они получали две трети пищи в темноте и одну треть во время светового цикла.Измерения состава тела проводились с помощью анализатора ЯМР miniSpec TD (Bruker). Образцы крови для измерения исходного уровня инсулина были получены при поднижнечелюстном кровотечении. Уровень глюкозы в крови измеряли с помощью глюкометра FLASH FreeStyle (Abbott). Мышей умерщвляли асфиксией CO ₂ и смещением шейного отдела после 4-часового голодания в течение пятого и шестого часов светового цикла. Образцы сыворотки для окончательных измерений инсулина, свободных жирных кислот и цитокинов собирали путем сердечной пункции.Подкожную брюшную, эпидидимальную, периренальную и брыжеечную жировые ткани иссекали, и правые депо жировой ткани и все брыжеечные депо взвешивали для каждого животного. Образцы тканей замораживали в жидком азоте и хранили при –80 ° C перед экстракцией РНК и иммуногистохимическим анализом. Эксперимент проводился в 2 отдельных случаях ( n = 40 на эксперимент). Все эксперименты на животных были одобрены IACUC Колумбийского университета.

Голодные эксперименты.

Постных мышей C57BL / 6J (возраст от 8 до 9 недель), получавших стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc.), не кормили в течение 24 часов, начиная со второго часа светового цикла. В качестве контроля использовали мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum по весу и возрасту. Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

Для экспериментов натощак на мышах с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, использовали мышей в возрасте от 24 до 28 недель. Мышей помещали на диету с высоким содержанием жиров (D12492 / Research Diets Inc.) начиная с 6-недельного возраста. Они прошли 24-часовое голодание, начиная со второго часа светового цикла.

Пять 8-недельных мышей Ccr2 ^{— / —} и пять 8-недельных Ccr2 ^{+ / +} мышей (однопометников), получавших стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc. ) голодали в течение 24 часов, начиная со второго часа светового цикла. Пять одинаковых по весу и возрасту мышей Ccr2 ^{— / —} и 5 Ccr2 ^{+ / +} (однопометники) использовали в качестве контроля.Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

CL316,243 для лечения мышей.

Десять 8-недельных мышей C57BL / 6J, получавших стандартную гранулированную диету (см. Выше), вводили внутрибрюшинно 1 мг / кг CL316,243 или физиологического раствора дважды (4 часа между каждой инъекцией). Мышей умерщвляли через 14 часов после второй инъекции. Перигонадную жировую ткань иссекали и образцы хранили, как описано выше.

Обработка мышей BrdU.

Десять 8-недельных мышей C57BL / 6J, получавших стандартную гранулированную диету (см. Выше), вводили внутрибрюшинно 0,133 мг / г BrdU (Sigma-Aldrich) или носитель дважды (3 часа между каждой инъекцией). Через 1,5 часа после первой инъекции мы убрали еду из опытной группы. Контрольную группу кормили без ограничений. Обе группы были принесены в жертву 24 часа спустя. Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

Мыши Atgl

Образцы перигонадальной жировой ткани от Atgl ^{+ / +} и Atgl ^{— / —} мышей были собраны у худых мышей в возрасте 8–9 недель, которых кормили ad libitum или голодали в течение 16 часов.

Метаболические анализы.

Уровни инсулина в сыворотке определяли с помощью сверхчувствительного инсулинового ELISA (Mercodia Inc.). PAI-1 и резистин в сыворотке измеряли с использованием панели мышиного адипокина LINCOplex (Millipore). Уровень лептина в сыворотке измеряли с использованием количественного анализа лептина мыши ELISA (системы R&D).FFA измеряли с использованием серии HR NEFA (Wako Diagnostics). Образцы крови для выделения сыворотки собирали после 4-часового голодания в течение пятого и шестого часов светового цикла. Образцы сыворотки, собранные, представленные на рисунке A, также были проанализированы на несколько гормонов и цитокинов и поэтому были помещены на влажный лед перед дальнейшей обработкой. Образцы сыворотки, представленные на рисунке A и рисунке A, использовались только для анализа FFA и были немедленно заморожены в жидком азоте перед анализом (для минимизации липолиза триглицеридов).

Иммуногистохимия.

Образцы жировой ткани фиксировали в течение 48 часов при комнатной температуре в цинк-формалиновом фиксаторе (Anatech Ltd.), инкубировали в 70% этаноле в течение 24 часов и затем заливали парафином. Срезы размером 5 мкм с интервалами 50 мкм помещали на заряженные предметные стекла, депарафинизировали в ксилоле и окрашивали на экспрессию F4 / 80 крысиным моноклональным антителом против F4 / 80 мыши (Abd Serotec). Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 80 минут при комнатной температуре (разведение 1: 100).Крысиный IgG2a (Invitrogen) использовали в качестве изотипического контроля (разведение 1:50). Затем использовали биотинилированное вторичное антитело против крыс в разведении 1: 200, затем комплекс Avidin DH: биотинилированная пероксидаза H хрена (Vector Laboratories) и развитие в хромогенном субстрате 3,3′-диаминобензидин (Vector Laboratories). Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для каждого отдельного депо жировой ткани было проанализировано 5–10 различных мощных полей из каждого из 3 различных срезов. Общее количество ядер и количество ядер клеток, экспрессирующих F4 / 80, подсчитывали для каждого поля.Долю клеток, экспрессирующих F4 / 80, для каждого образца рассчитывали как сумму количества ядер клеток, экспрессирующих F4 / 80, деленное на общее количество ядер в срезах образца. Площадь поперечного сечения определяли для каждого адипоцита в каждом поле с использованием программного обеспечения для анализа изображений Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.). Для каждой мыши подсчитывали 800–1000 адипоцитов. Число адипоцитов рассчитывали исходя из веса жировой подушечки и объема адипоцитов (48).

Для обнаружения BrdU-положительных клеток готовили срезы, как описано выше, и проводили иммуногистохимию с использованием моноклонального биотинилированного анти-BrdU (набор для окрашивания BrdU; Invitrogen).Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для каждого отдельного депо жировой ткани было проанализировано 10 различных мощных полей из каждого из 3 различных срезов. Общее количество ядер и количество ядер BrdU-положительных клеток подсчитывали для каждого поля. Долю BrdU-положительных клеток для каждого образца рассчитывали как сумму количества ядер BrdU-положительных клеток, деленную на общее количество ядер в срезах образца.

Для обнаружения CD11c-положительных клеток использовали замороженные срезы (10 мкм).Срезы окрашивали на экспрессию CD11c антителом хомяка против CD11c мыши (Abd Serotec). Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 60 минут при комнатной температуре (разведение 1: 100). IgG хомяка использовали в качестве изотипического контроля (разведение 1: 100) (Abd Serotec). Затем использовали биотинилированное вторичное антитело против хомяка в разведении 1: 200 (30 минут), затем использовали комплекс Avidin DH: биотинилированная пероксидаза H хрена (Vector Laboratories) и проявили в хромогенном субстрате 3,3′-диаминобензидин (Vector Laboratories). .Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Общее количество ядер и количество CD11c-положительных CLS подсчитывали для каждого поля. Долю CD11c-положительных CLS для каждого образца рассчитывали как сумму количества положительных CLS, деленную на общее количество ядер в срезах образца.

Для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, экспрессирующих F4 / 80 и CD11c, использовали замороженные срезы. Срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C (разведение 1: 100).Затем добавляли ослиный IgG против Cy3 крысы (Jackson ImmunoResearch) и козий IgG против хомяка Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Срезы инкубировали 45 минут при комнатной температуре (разведение 1: 300). Флуоресцентную микроскопию выполняли с использованием Nikon Eclipse 80i, оснащенного камерой Retiga Exi и системой флуоресцентного освещения X-Cite 120.

Количественная ОТ-ПЦР.

экстрагировали из замороженной жировой ткани с использованием кислотно-фенольного реагента (TRIzol; Invitrogen). РНК выделяли из SVC с использованием QIAGEN RNeasy Minikit (QIAGEN) и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen) и случайных гексамерных праймеров.Количественные анализы RT-PCR проводили с использованием системных инструментов DNA Engine Opticon 2 (Bio-Rad) и PCR SYBR Green I QuantiTect Master Mix (QIAGEN). Экспрессия мРНК всех указанных генов нормализована к экспрессии гена циклофилина B ( Ppib ). Каждую реакцию проводили в двух экземплярах, и данные анализировали методом 2-DDCT (49). Все использованные праймеры перечислены в дополнительной таблице 3.

Липолиз in vitro изолированной перигонадальной жировой ткани (эксплантаты).

Перигонадные жировые подушечки были удалены хирургическим путем у мышей C57BL / 6J, получавших с высоким содержанием жира ( n = 5 / группа), которые либо получали питание ad libitum, либо подвергались ограничению калорийности. Впоследствии их несколько раз промывали PBS. Кусочки ткани (общий вес ~ 100 мг) инкубировали в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 2% БСА, не содержащий жирных кислот (Sigma-Aldrich), при 37 ° C. Аликвоты собирали через 120 минут и исследовали на содержание FFA и глицерина. FFA и глицерин измеряли с использованием серии HR NEFA (Wako Diagnostics) и набора для определения свободного глицерина (Sigma-Aldrich) соответственно.Мы измерили количество адипоцитов в параллельных образцах от мышей, получавших ad libitum с одинаковым весом и жиром, и мышей с ограничением калорийности.

Опыты по совместительству.

Чтобы изолировать SVC, перигонадальную жировую ткань выделяли у самцов мышей C57BL / 6J с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, сразу после удушья CO ₂ . Ткани обрабатывали стерильными методами и измельчали ​​на мелкие (<10 мг) кусочки. Для выделения SVC измельченные образцы помещали в DMEM (Invitrogen) с добавлением 10 мг / мл BSA (Sigma-Aldrich).К суспензии ткани добавляли коктейль с обедненной ЛПС коллагеназой (Liberase 3; Roche Applied Science) в концентрации 0,03 мг / мл, и образцы инкубировали при 37 ° C на орбитальном шейкере (3 г ) в течение 45 минут. минут. После завершения разложения образцы пропускали через стерильную нейлоновую сетку 250 мкм (Sefar America Inc.). Суспензию центрифугировали при 500 г в течение 5 минут. Осажденные клетки собирали в виде SVC. SVC ресуспендировали в буфере для лизиса эритроцитов (BD Biosciences) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты.SVC высевали в концентрации 650 000 клеток / лунку на вкладыши для клеточных культур с размером пор 1 мкм (BD). Каждую вставку помещали в лунку 12-луночного планшета для культуры ткани (BD), содержащего 100 мг тонко измельченной жировой ткани. Чтобы выделить небольшие неповрежденные кусочки жировой ткани для культивирования, перигонадную жировую ткань удаляли у тучных мышей C57BL / 6J, получавших пищу с высоким содержанием жира, и измельчали ​​до кусочков размером примерно 10 мг. SVC совместно культивировали с кусочками жировой ткани в течение 24 часов в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин и 2% BSA, не содержащий жирных кислот.Изопротеренол (Sigma-Aldrich) добавляли в выбранные лунки в концентрации 10 мкмоль / л. Фракцию стромальных сосудов собирали для экспрессии гена или окрашивания масляным красным О через 24 часа.

Масляное красное окрашивание О. SVC

сушили на воздухе и фиксировали цинк-формалиновым фиксатором (см. Выше) в течение 10 минут и окрашивали масляным красным О, как описано ранее (50).

Анализ миграции макрофагов.

BMDM мыши были дифференцированы in vitro из клеток-предшественников костного мозга.Вкратце, клетки костного мозга вымывали из бедренных и большеберцовых костей 9-недельных мышей C57BL / 6J, промывали в DMEM (Invitrogen) и выращивали в течение 7 дней в чашках Петри, содержащих DMEM с 10% FBS, 20% кондиционированных клеток L929. среды, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина и 1% пирувата натрия. На седьмой день среды заменяли на DMEM, содержащую 10% FBS, 10% среды, кондиционированные клетками L929, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина и 1% пирувата натрия; макрофаги выращивали еще 3 дня. Дифференциация подтверждена анализом FACS.Миграцию BMDM оценивали с использованием 96-луночного анализа миграции клеток с 5 мкм хемотаксисом QCM (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя. В нижнюю камеру добавляли среду, кондиционированную эксплантатом, простую среду или среду, содержащую рекомбинантный MCP-1 (50 нг / мл) (PeproTech). Для получения среды, кондиционированной эксплантами, эксплантаты выделяли от тощих 10-недельных мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от голодных животных инкубировали в базовых условиях, как описано выше, тогда как эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) (Sigma-Aldrich) или без нее.Содержание FFA в эксплантатах оценивали с помощью серии HR NEFA (Wako Diagnostics). Планшеты с миграционной камерой инкубировали в течение 15 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . В конце инкубации клетки детектировали зеленым флуоресцентным красителем (краситель CyQUANT), включенным в анализ. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью Infinite 500 (Tecan). Количество клеток определяли на основании показаний флуоресценции и стандартной кривой.

Препарат клодроната, инкапсулированный в липосомы.

24 мг холестерина и 258 мг фосфатидилхолина (Sigma-Aldrich) растворяли в хлороформе в круглодонной колбе. Хлороформ упаривали при 37 ° C в роторном испарителе в вакууме до образования тонкой липидной пленки. Три грамма клодроната (динатриевая соль дихлорметилендифосфоновой кислоты) (Sigma-Aldrich) растворяли в 15 мл PBS. Раствор клодронат-PBS или контрольный раствор PBS добавляли к липидной пленке и встряхивали при 4 г в течение 30 минут.Раствор обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при комнатной температуре в ультразвуковом устройстве с водяной баней (50 Вт). Липосомы центрифугировали при 49 400 g в течение 1 часа и ресуспендировали в 12 мл PBS.

Истощение макрофагов инкапсулированным в липосомы клодронатом.

Клодронат, инкапсулированный в липосомы, вводили внутрибрюшинно мышам C57BL / 6J. Каждой мыши вводили липосомы, содержащие 115 мг / кг клодроната или эквивалентный объем липосом, содержащих PBS.Мышей не кормили в течение 24 часов, начиная с 3 дня после инъекции, и истощение макрофагов в перигонадной жировой ткани было подтверждено в конце периода голодания (день 4). Для экспериментов in vitro перигонадные жировые подушечки были хирургически удалены у мышей C57BL / 6J, получавших пищу с высоким содержанием жира ( n = 4 / группа), которые не голодали в течение 24 часов. Впоследствии их несколько раз промывали PBS. Кусочки ткани (общий вес ~ 75 мг) инкубировали в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 1% антибиотиков, без добавления сыворотки.Через 6 часов в свежую среду добавляли 20% липосом, содержащих либо клодронат, либо PBS, до конечного объема 1 мл. Эксплантаты выдерживали в течение 48 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . Затем среды, содержащие липосомы, перемещали и добавляли DMEM, содержащую 2% БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich). Аликвоты собирали через 120 минут и исследовали на содержание глицерина. Глицерин измеряли с помощью набора для определения свободного глицерина (Sigma-Aldrich). Эксплантаты также использовали для выделения РНК.

Статистика.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Все значения P были рассчитаны с использованием двухстороннего распределения, двухвыборочного теста с неравной дисперсией t Стьюдента. Все расчеты были выполнены с использованием Microsoft Excel и Statistica (Statsoft Inc.).

Потеря веса и липолиз способствуют динамическому иммунному ответу в жировой ткани мышей

Abstract

Ожирение вызывает иммунный ответ, характеризующийся привлечением миелоидных клеток к ключевым органам обмена веществ, включая жировую ткань.Однако реакция иммунных клеток на непатологические метаболические стимулы менее изучена, а факторы, регулирующие метаболически-зависимое накопление иммунных клеток, изучены не полностью. Здесь мы охарактеризовали реакцию макрофагов жировой ткани (ATM) на потерю веса и голодание у мышей и определили роль липолиза в рекрутинге и накоплении ATM. Мы обнаружили, что иммунный ответ на потерю веса был динамичным; ограничение калорийности мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, привело к первоначальному увеличению набора ATM, тогда как содержание ATM снизилось после продолжительного периода потери веса.Пик числа АТМ совпал с пиком циркулирующих концентраций СЖК и липолиза жировой ткани, что позволяет предположить, что липолиз вызывает накопление АТМ. Действительно, голодание или фармакологически индуцированный липолиз быстро увеличивал накопление ATM, активность хемоаттрактанта жировой ткани и захват липидов ATM. И наоборот, диетические и генетические манипуляции, снижающие липолиз, уменьшали накопление АТМ. Истощение макрофагов в культурах жировой ткани увеличивает экспрессию липазы триглицеридов жиров и генов, регулируемых FFA, и увеличивает липолиз.Эти данные предполагают, что локальные потоки липидов являются центральными регуляторами рекрутирования ATM и что после рекрутирования ATMs образуют нагруженные липидами макрофаги, которые могут буферизовать локальное повышение концентрации липидов.

Введение

Ожирение активирует сложную иммунную программу, центральными особенностями которой являются дифференциация, активация и рекрутирование лимфоидных и миелоидных клеток в ключевые метаболические ткани (1–11). У млекопитающих увеличение массы жировой ткани вызывает накопление макрофагов жировой ткани (ATM), которые продуцируют провоспалительные молекулы, включая TNF-α, SAA3 и CCL2 (MCP-1) (2, 12).Банкоматы способствуют как местному, так и системному воспалению и модулируют метаболические фенотипы, включая резистентность к инсулину (13). Генетические и фармакологические манипуляции, которые уменьшают содержание АТМ или изменяют их воспалительное состояние у тучных грызунов, модулируют местное воспаление и связаны со снижением инсулинорезистентности (14). Например, дефицит или антагонизм Ccr2 снижает рекрутирование ATM и частично защищает мышей от инсулинорезистентности, вызванной ожирением (15). Сходным образом, миелоидная клеточно-специфическая делеция IKK-β, регулирующая воспалительный путь, снижает вызванное ожирением воспаление и индуцированную диетой инсулинорезистентность (6, 16).

Метаболические факторы, регулирующие иммунный ответ на ожирение и накопление макрофагов и других иммунных клеток в жировой ткани, остаются плохо изученными. У людей со стабильным весом и грызунов или тех, кто набирает вес, существует сильная положительная корреляция между размером адипоцитов и содержанием АТМ (2, 17, 18). Эта корреляция предполагает, что накопление макрофагов происходит в ответ на процесс, связанный с увеличением объема адипоцитов. Чинти и его коллеги предположили, что некротическая смерть адипоцитов, которая, по их гипотезе, вызвана гипертрофией и ускоряется ожирением, является основным стимулом, регулирующим накопление АТМ (19).Действительно, массивный апоптоз адипоцитов в трансгенной модели индуцибельной липоатрофии приводит к быстрому накоплению ATM (20) и предполагает, что гибель адипоцитов может управлять накоплением ATM. Однако недавние исследования показывают, что скорость гибели адипоцитов не увеличивается у лиц с ожирением (21). Другая убедительная гипотеза заключается в том, что гипоксия влияет на набор сотрудников банкоматов. В этой модели гипертрофия адипоцитов создает области микрогипоксии, которые активируют воспалительные программы, важные для ремоделирования сосудистой сети.Эти пути включают регулируемое JNK1 высвобождение хемокинов (22-24). Однако в недавнем исследовании экспрессия в жировой ткани Hif1a , основного фактора, опосредующего реакцию гипоксии, и Vegfa , ключевой нижестоящей мишени Hifa , отрицательно коррелировала с содержанием ATM (17).

Увеличение массы жировой ткани и объема адипоцитов имеет другие широкие метаболические последствия, включая снижение митохондриальной функции, повышенный стресс ER, нарушение передачи сигналов инсулина и более высокую скорость базального липолиза (25–28).Ключ к разгадке функции ATM и их регуляции может быть получен из наблюдения, что с увеличением ожирения ATMs образуют многоядерные синцитии, которые содержат большие липидные капли (19, 29), что позволяет предположить, что при ожирении ATMs фагоцитируют или поглощают избыток липидов. Тесная связь размера адипоцитов с накоплением макрофагов и захватом липидов предполагает, что избыток липидов может иметь решающее значение для накопления ATM. Поэтому мы предположили, что иммунная система и макрофаги напрямую реагируют на изменения в метаболической функции и потоках субстратов и, в частности, что вызванное ожирением увеличение базального липолиза (за счет увеличения объема жировых клеток) (25) увеличит локальные концентрации внеклеточных липидов и приведет к АТМ. накопление.В соответствии с этой гипотезой депо висцеральной жировой ткани — по сравнению с подкожными депо брюшной полости — имеют повышенную базальную скорость липолиза и содержат больше банкоматов (18, 30, 31). Если усиленный липолиз вызывает накопление АТМ, то изменение липолиза должно изменить накопление АТМ предсказуемым образом. Общий липолиз представляет собой сумму (а) базального липолиза, который в значительной степени определяется содержанием триглицеридов в адипоцитах, и (б) липолиза по требованию, который представляет собой гормонально регулируемое высвобождение FFA в ответ на потребности в питании.Ожирение увеличивает размер адипоцитов и, следовательно, базальный липолиз. Отрицательный энергетический баланс приводит к мобилизации запасов триглицеридов жировой ткани и активирует липолиз по требованию; следовательно, у лиц с ожирением во время ранней потери веса, когда содержание триглицеридов в адипоцитах остается высоким, как базальный, так и требуемый липолиз высоки, и, если наша гипотеза верна, содержание АТМ должно быть повышено.

Несмотря на то, что подробные исследования динамики накопления макрофагов в жировой ткани во время набора веса были выполнены, кинетика накопления ATM во время похудания остается плохо определенной.Постоянное увеличение веса и массы жировой ткани приводит к пропорциональному увеличению содержания АТМ (2, 5, 18). После стойкой потери веса содержание макрофагов снижается (32). Однако наша гипотеза предсказывает, что достижение отрицательного энергетического баланса за счет увеличения липолиза потребности должно нарушить корреляцию между массой жировой ткани / объемом адипоцитов и содержанием макрофагов во время ранней потери веса, когда объем адипоцитов и базальный липолиз существенно не снижаются, но потребность в липолизе высока.

Чтобы определить, влияет ли липолиз, вызванный потерей веса, накопление АТМ в жировой ткани, мы измерили содержание АТМ у мышей с ожирением, получавших пищу с высоким содержанием жира, которым проводилось умеренное ограничение калорийности, и контролировали кинетику накопления макрофагов в течение 2-месячного периода. Мы непосредственно определили, увеличивает ли накопление АТМ липолиз жировой ткани натощак и фармакологически. Напротив, мы снизили скорость липолиза жировой ткани за счет изокалорийной замены углеводов пищевым жиром и изучили эффекты голодания у мышей с дефицитом Atgl / Pnlap2 , чтобы оценить, снижает ли снижение липолиза накопление ATM.Мы изучили эффекты индукции липолиза на банкоматах in vivo и в интактной жировой ткани in vitro, чтобы определить, активирует ли липолиз сам по себе поглощение свободных жирных кислот в банкоматах. Наконец, мы удалили макрофаги из жировой ткани in vitro и обнаружили, что в отсутствие ATM экспрессия липазы Atgl / Pnpla2 в жировой ткани и липолиз увеличиваются. Наши результаты подтверждают модель, в которой липолиз жировой ткани приводит к накоплению АТМ и рекрутированию макрофагов в буфер, локальное увеличение концентрации липидов за счет фагоцитоза и, возможно, за счет модуляции метаболизма адипоцитов.

Результаты

Потеря веса вызывает кратковременное скопление банкоматов.

Чтобы понять, как иммунная система — и в частности банкоматы — реагирует на потерю веса, мы охарактеризовали метаболический и воспалительный фенотипы мышей с ожирением, которые подвергались умеренному ограничению калорийности. Девятинедельных самцов мышей C57BL / 6J кормили диетой с высоким содержанием жиров (60% калорий приходилось на жир; дополнительная таблица 1; дополнительные материалы доступны в Интернете вместе с этой статьей; doi: 10.1172 / JCI42845DS1), пока они не достигнут массы тела 40 граммов. Затем эти животные были подвергнуты ограничению калорийности (они получали 70% корма ad libitum), чтобы вызвать постепенную потерю веса. Мышей умерщвляли и собирали ткани через 0, 3, 7, 14, 21, 42 и 60 дней ограничения калорийности. Группа мышей соответствующего возраста, получавших постную пищу, была изучена в качестве контроля (дополнительный рисунок 1A). В начале ограничения калорийности все мыши, получавшие диету с высоким содержанием жиров, имели одинаковый состав тела, уровень глюкозы в крови натощак и концентрации инсулина в сыворотке (дополнительная таблица 2).Мы чередовали распределение мышей по разным группам ограничения калорийности, гарантируя, что средний возраст каждой умерщвленной группы существенно не отличался (дополнительный рисунок 2A). Как и ожидалось, этот протокол умеренного ограничения калорийности вызывал постепенное снижение веса и жировой массы без значительного влияния на мышечную массу (дополнительный рисунок 1, B и C и дополнительный рисунок 2B). Общая жировая масса, измеренная с помощью ЯМР-спектроскопии, заметно снизилась к 14 дню. Мыши продолжали терять вес на протяжении всего вмешательства, и в конце ограничения калорийности они потеряли 27.9% от исходной массы тела (40,8 ± 0,3 г против 29,4 ± 3,8 г; P <0,001). Все жировые отложения уменьшались в массе с одинаковой скоростью (дополнительный рисунок 1D), и уменьшение жировой массы было связано с уменьшением размера адипоцитов, а не с уменьшением количества адипоцитов (дополнительный рисунок 1, C – F). Уменьшение размера адипоцитов, как и ожидалось, сопровождалось снижением экспрессии гена лептина и концентрации лептина в сыворотке (дополнительные рисунки 3, A и B).

Во время набора веса и в поперечных исследованиях людей со стабильным весом наблюдается положительная, почти линейная зависимость между ожирением и маркерами местного и системного воспаления (13).После потери веса примерно на 17% у пациентов через 3 месяца после бариатрической операции содержание АТМ и воспаление жировой ткани уменьшаются, а чувствительность к инсулину улучшается (32, 33). Однако исследований связи между ожирением и показателями воспаления во время динамической потери веса было немного. Недавнее исследование Лангина и его коллег предполагает, что во время ранней потери веса у людей экспрессия воспалительных генов не снижается (34).

Чтобы обеспечить большее временное разрешение взаимосвязи между ожирением и метаболическими и воспалительными фенотипами во время похудания, мы измерили уровень глюкозы в крови натощак, сывороточный инсулин и экспрессию воспалительных генов в жировой ткани в нашей когорте мышей в течение 2 месяцев непрерывной потери веса.Концентрации глюкозы в крови натощак и сывороточного инсулина оставались повышенными в течение первой недели потери веса, но после этого значительно снизились, одновременно со снижением процента жира в организме (дополнительный рисунок 4). Напротив, снижение экспрессии воспалительных генов в перигонадной жировой ткани не было равномерным, и несколько классов генов были идентифицированы на основе их характера экспрессии во время потери веса. Экспрессия некоторых воспалительных генов, таких как Saa3 , снизилась на ранних этапах похудания, что предшествовало улучшению гомеостаза глюкозы, тогда как экспрессия других прототипных воспалительных генов M1, включая Tnf ( Tnfa ), оставалась повышенной в течение всего периода. когда животные находились в отрицательном энергетическом балансе (дополнительный рисунок 5).Циркулирующие воспалительные белки также подразделяются на несколько классов в ответ на отрицательный энергетический баланс, при этом концентрации некоторых воспалительных молекул, например резистина, рано падают во время потери веса и до улучшения метаболизма, в то время как концентрации других, например, PAI-1 оставался неизменным во время ограничения калорийности и потери веса (дополнительный рисунок 3, C и D).

В отличие от других классов генов, экспрессия в жировой ткани генов, специфичных для макрофагов / миелоидных клеток, Emr1 (F4 / 80), Cd68 и Csf1r увеличивалась после 3 дней ограничения калорийности (Рисунок A ).Однако к 60 дням потери веса экспрессия Emr1 и Cd68 снижалась до уровней ниже тех, которые присутствовали до начала потери веса. Позднее снижение экспрессии генов, специфичных для макрофагов, соответствовало предыдущим исследованиям, в которых изучались эффекты долгосрочной потери веса. Чтобы определить, было ли начальное увеличение и окончательное снижение экспрессии генов, специфичных для макрофагов / миелоидов, связано с изменениями экспрессии генов или с изменением количества макрофагов, мы провели иммуногистохимию с использованием антитела, которое распознает антиген макрофагов F4 / 80 (EMR1).В соответствии с исследованиями экспрессии генов, количество макрофагов в перигонадальной жировой ткани увеличивалось в течение первой недели потери веса. Через три дня после начала ограничения калорийности в перигонадальной жировой ткани было на 47% больше макрофагов, чем в жировой ткани контрольных мышей, получавших ad libitum (процент макрофагов на общее количество клеток: 38,6% ± 4,1% против 26,3% ± 7,4%; P <0,01; Рисунок, B и C). Мы и другие ранее показали, что существует сильная положительная корреляция между ожирением и содержанием банкоматов (2, 18).Однако при похудании эта связь теряется. Вместо этого в начальный период потери веса (дни 0–7 в нашем исследовании) у более стройных мышей обнаруживается больше банкоматов (рис. D), тогда как позже, во время похудания, обнаруживается более типичная положительная корреляция (рис. D). Идентичные отношения были обнаружены при построении графика зависимости содержания АТМ от размера адипоцитов (данные не показаны). Банкоматы, в частности банкоматы CD11c ⁺ и короноподобные структуры (CLS) CD11c ⁺ , наиболее тесно связаны с воспалением жировой ткани и системной инсулинорезистентностью.Почти все клетки CD11c ⁺ в перигонадальной жировой ткани мышей во время ранней потери веса также были F4 / 80 ⁺ (CD11c ⁺ ATM) (дополнительная фигура 6). Хотя общее количество банкоматов увеличивалось во время ранней потери веса, количество банкоматов CD11c ⁺ и CLS не увеличивалось (дополнительный рисунок 7), что соответствует накоплению популяции банкоматов CD11c ^— во время ранней потери веса и отсутствию увеличения маркеров воспаления или нарушения инсулинорезистентности в этот же период (дополнительные рисунки 4 и 5).

( A ) Экспрессия генов, кодирующих миелоидно-макрофагальные белки в перигонадальной жировой ткани. Черные столбцы представляют мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которым в течение различных интервалов времени подвергались ограничения в калориях. Белые столбики представляют контрольных худых мышей, которых кормили пищевой диетой (CD) и которые не подвергались ограничению калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в перигонадальных срезах жировой ткани мышей во время потери веса после указанного количества дней ограничения калорийности.Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( C ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани. n = 5–6 мышей / группа. ( D ) Взаимосвязь между содержанием макрофагов и массой тела у мышей в течение первых 7 дней потери веса (левая панель) и в течение 14-60 дней потери веса (правая панель). Показаны квадратные значения коэффициентов корреляции Пирсона. Каждая точка данных представляет собой% макрофагов в перигонадальной жировой ткани мышей при разном весе тела во время ограничения калорийности.( E ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в срезах подкожной жировой ткани. Масштабные линейки: 50 мкм. ( F ) Макрофаги в процентах от всех клеток подкожной жировой ткани мышей во время потери веса. n = 5–6 мышей / группа. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по сравнению с днем ​​0.

Раннее первоначальное увеличение содержания ATM не было уникальным для перигонадальной жировой ткани.В соответствии с предыдущими данными у мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, в подкожной жировой ткани содержание ATM было ниже, чем в перигонадной жировой ткани (2, 32). Однако после 3 дней ограничения калорий содержание АТМ удвоилось в подкожных депо (макрофаги в процентах от всех клеток: 10,0 ± 3,1% против 20,2 ± 7,4%; P <0,05; рис. E и F) . Как в перигонадных, так и в подкожных депо количество АТМ постепенно уменьшалось после 3 дней отрицательного энергетического баланса, так что после 42 дней ограничения калорий содержание АТМ было значительно ниже, чем в жировой ткани мышей с высоким содержанием жира, которые никогда не ограничивались калорийностью ( Рисунок, B, C, E и F).

Было высказано предположение, что во время набора веса накопление АТМ вызвано некрозом адипоцитов, ремоделированием ткани или микрогипоксией. Первоначальное увеличение ATM в ответ на потерю веса не было связано со снижением количества адипоцитов, как можно было бы ожидать, если некроз адипоцитов приводил к накоплению ATM (дополнительный рисунок 1F). Также пик в ATM не совпал с активацией транскрипционной программы ремоделирования жировой ткани (дополнительный рисунок 8).

Показатели липолиза коррелируют с содержанием АТМ.

Первоначальное увеличение количества банкоматов было связано с изменениями концентрации циркулирующих FFA и показателей липолиза. Базальный липолиз в жировой ткани — это высвобождение FFA из адипоцитов, которое происходит при отсутствии отрицательного энергетического баланса. Базальный липолиз увеличивается в жировой ткани у лиц с ожирением и положительно коррелирует с размером адипоцитов (25). Липолиз по требованию — это гормонально и автономно управляемое высвобождение FFA из триглицеридов адипоцитов, которое активируется отрицательным энергетическим балансом, когда FFA мобилизуются из жировой ткани для системного использования в качестве субстратов (25).Модель, в которой липолиз регулирует накопление АТМ, согласуется с предыдущими наблюдениями за людьми со стабильным весом или набором веса: у тучных мышей с большими адипоцитами наблюдается более высокий базальный липолиз жировой ткани и большее содержание АТМ, чем у тощих животных. Во время ранней потери веса, когда размер адипоцитов существенно не изменился, базальный липолиз остается высоким, а потребность в липолизе увеличивается, и, таким образом, мы прогнозируем чистое увеличение общего липолиза. Но по мере уменьшения массы жировой ткани и размера адипоцитов также уменьшается базальный липолиз и уменьшается чистый отток липидов из жировой ткани.Концентрации FFA в сыворотке коррелируют с общей скоростью липолиза и потоками жирных кислот в жировой ткани (25, 35). Следовательно, если липолиз действительно играет роль в накоплении ATM, мы предсказали, что FFA в сыворотке будет коррелировать с содержанием ATM у наших мышей с ограничением калорийности. Действительно, сывороточные концентрации FFA были выше на 3-й день ограничения калорий, до значительной потери веса, и совпадали с пиком содержания макрофагов (Рисунок A). В соответствии с нашей гипотезой существовала положительная корреляция между концентрацией FFA в сыворотке и процентом ATM в перигонадной жировой ткани на протяжении всего периода ограничения калорийности (Рисунок B).

( A ) Концентрации FFA в сыворотке во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. Черные столбцы представляют мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которым в течение различных интервалов времени подвергались ограничения в калориях. Белая полоса представляет контрольных худых мышей, которых кормили кормовой диетой и которые не подвергались ограничению калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Корреляция содержания макрофагов (% макрофагов) и концентрации FFA в сыворотке у мышей во время потери веса; показано квадратное значение коэффициента корреляции Пирсона. n = 5–6 мышей / группа. Каждая точка данных представляет собой% макрофагов в перигонадальной жировой ткани мыши при различных концентрациях FFA в сыворотке. ( C ) Экспрессия в перигонадной жировой ткани гена, кодирующего липазу ATGL, у мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( D ) Высвобождение FFA из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, инкубированных в базовых условиях. Эксплантаты были изолированы от мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или которые подвергались ограничению калорийности в течение 3 или 42 дней.( E ) Высвобождение глицерина из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, инкубированных в базовых условиях. Эксплантаты были изолированы от мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или которые подвергались ограничению калорийности в течение 3 или 42 дней. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с днем ​​0.

В жировой ткани лимитирующая стадия как базального липолиза, так и липолиза по потребности регулируется ферментом, кодируемым Atgl / Pnpla2 . Экспрессия Atgl / Pnpla2 регулируется нутриционным статусом и тесно коррелирует со скоростью липолиза жировой ткани (36).В соответствии с пиком липолиза жировой ткани на 3-й день ограничения калорийности экспрессия Atgl / Pnpla2 в жировой ткани увеличивалась на 3-й день ограничения калорийности и возвращалась к исходному уровню на 42-й день (Рисунок C). Напротив, экспрессия гормоночувствительной липазы, кодируемой Hsl / Lipe , не коррелирует со статусом питания. Уровни мРНК Hsl / Lipe подавляются во время острого голодания и повышаются только после длительного голодания (36).В соответствии с этими данными, мы не наблюдали никаких изменений в уровнях Hsl / Lipe во время ограничения калорийности (дополнительный рисунок 9A).

Циркулирующие концентрации FFA и экспрессия Atgl / Pnpla2 обеспечивали косвенные измерения липолиза жировой ткани. Для прямого измерения липолиза в жировой ткани во время ограничения калорийности скорости высвобождения неэтерифицированных FFA и глицерина измеряли в перигонадальной жировой ткани мышей во время ограничения калорийности.В соответствии с нашими косвенными измерениями, липолиз увеличивался в жировой ткани мышей после 3 дней ограничения калорий по сравнению с жировой тканью мышей, получавших ad libitum (рисунок, D и E). Высвобождение FFA и глицерина снизилось через 42 дня. Эти данные демонстрируют положительную корреляцию между липолизом жировой ткани и содержанием АТМ. Чтобы напрямую определить, влияет ли увеличение или уменьшение липолиза на накопление АТМ, мы провели ряд диетических, фармакологических и генетических манипуляций.

Липолиз вызывает накопление АТМ.

Если липолиз вызывает накопление АТМ в жировой ткани, то голодание, которое быстро увеличивает гидролиз триглицеридов жировой тканью, также должно увеличивать содержание АТМ. Перигонадную жировую ткань собирали у мышей C57BL / 6J с ожирением, получавших пищу с высоким содержанием жира, которые либо не голодали в течение 24 часов, либо кормились ad libitum. Голодание вызывало увеличение концентрации FFA в сыворотке (рис. A) и приводило к быстрому накоплению ATM. По сравнению с жировой тканью мышей, получавших ad libitum, жировая ткань голодных мышей содержала на 65% больше ATM (процент макрофагов на общее количество клеток: 22.9% ± 6% против 37,9% ± 3,5%; P <0,01; Рисунок, Б – Г). Накопление ATM, вызванное голоданием, не ограничивалось тучными мышами. У худых мышей экспрессия генов, специфичных для макрофагов, Emr1 и Csf1r , увеличивалась в 3 и 4 раза соответственно после 24-часового голодания (Рисунок E). В соответствии с нашими наблюдениями, что ограничение калорийности не вызывает накопление ATM CD11c ⁺ , экспрессия Itgax ( Cd11c ) не изменяется при голодании (Рисунок E).

( A ) Концентрации FFA в сыворотке у мышей с ожирением ad libitum, получавших пищу ad libitum и голодавших 24 часа в сутки, вызванных диетой с высоким содержанием жиров. n = 5–6 мышей / группа. ** P <0,01, по сравнению с кормлением ad libitum (кормление Ad lib). ( B и C ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1) в перигонадальных срезах жировой ткани от мышей с ожирением, индуцированного диетой с высоким содержанием жиров, получавших ad libitum ( B ) и мышей, голодавших 24 часа (). С ).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( D ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадной жировой ткани от мышей с ожирением ad libitum, получавших пищу ad libitum и голодавших 24 часа в сутки, вызванного диетой с высоким содержанием жиров. n = 5–6 мышей / группа. ** P <0,01 по сравнению с кормлением ad libitum. ( E ) Экспрессия генов, кодирующих белки, специфичные для миелоидных макрофагов, у мышей, получавших постное питание ad libitum и голодавших 24 часа в сутки. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05 по сравнению с кормлением ad libitum.( F ) Протокол фармакологически индуцированного липолиза адипоцитов с помощью β3-адренергического агониста (CL316,243) у худых мышей. ( G — I ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1) в перигонадальных срезах жировой ткани от тощих мышей, получавших носитель ( G ) или CL316,243 ( H и I ) ). Многоядерные гигантские клетки, содержащие липидные капли, видны на некоторых участках ( I ). Стрелки указывают банкоматы.Масштабные линейки: 50 мкм. ( J ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани от мышей, обработанных носителем и CL316,243. n = 5 мышей / группа. *** P <0,001, по сравнению с носителем. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Активация β3-адренергического рецептора ( Adrb3 ), который у мышей почти исключительно экспрессируется адипоцитами, увеличивает липолиз адипоцитов. Граннеман и его коллеги ранее отмечали, что β3-адренергическая стимуляция приводит к накоплению миелоидных клеток в жировой ткани (37).Чтобы определить, будет ли фармакологическая активация липолиза увеличивать накопление ATM, мы дважды вводили мышам C57BL / 6J (масса тела = 24,5 ± 0,8 г) β3-адренергический агонист CL316,243 с интервалом в 4 часа. Депо жировой ткани собирали через 14 часов после последней инъекции (Рисунок F). По сравнению с контрольными мышами, фармакологическая индукция липолиза быстро увеличивала содержание ATM в перигонадальной жировой ткани более чем в 5 раз, до уровней, типичных для мышей с ожирением (рисунок, G – J).Макрофаги были видны как изолированно, так и в скоплениях (Рисунок, G – I). Таким образом, среди гормональных сигналов, активируемых голоданием, β3-адренергическая индукция липолиза адипоцитов достаточна для индукции быстрого рекрутирования макрофагов. Подобно нашим наблюдениям при ранней потере веса и голодании, рекрутированные β3-адренергические рецепторы макрофаги не увеличивают воспалительный фенотип жировой ткани (дополнительный рисунок 9E)

Уменьшение липолиза во время похудания или голодания снижает накопление АТМ.

Если наша гипотеза верна, то манипуляции, ингибирующие липолиз во время раннего похудания или голодания, должны уменьшить или предотвратить накопление АТМ. Хотя диета с высоким содержанием жиров увеличивает количество пищевых липидов, они также являются кетогенными при отрицательном энергетическом балансе. По сравнению с диетами с высоким содержанием жиров при отрицательном энергетическом балансе, диеты с высоким содержанием углеводов увеличивают соотношение циркулирующего инсулина / глюкагона и снижают мобилизацию липидов и скорость липолиза в жировой ткани (38). Поэтому мы повторили интервенцию по ограничению калорийности, добавив группу мышей соответствующего веса, которые были ограничены в калориях на изокалорийной высокоуглеводной диете (дополнительная таблица 1).Мышей поддерживали ограничение калорийности в течение 3 дней, и мышей в обеих группах в равной степени ограничивали (на 30% меньше калорий, чем их потребление ad libitum). В конце ограничения калорийности не было никакой разницы в весе между группами с ограничением калорийности диеты с высоким и высоким содержанием углеводов. Однако, как и ожидалось, концентрация FFA в сыворотке мышей с ограничением калорийности рациона с высоким содержанием углеводов была на 36% ниже, чем у мышей с ограничением калорийности рациона с высоким содержанием жиров (0,38 ± 0,11 против 0.59 ± 0,07 ммоль / л; P <0,05) (Рисунок A). В соответствии с нашей гипотезой, во время потери веса содержание ATM было на 35% ниже (31,1% ± 4,1% против 20,1% ± 5,2%; P <0,05) в перигонадальной жировой ткани у мышей, получавших высокоуглеводную диету, по сравнению с таковыми. питались диетой с высоким содержанием жиров (Рисунок, B и C).

Протокол ограничения калорийности использовался, чтобы вызвать потерю веса с более низкой скоростью липолиза по сравнению с ограничением калорийности мышей на диете с высоким содержанием жиров.Мышей с ожирением, вызванным высокожировой диетой, кормили 70% от их калорийности ad libitum в течение 3 дней в виде диеты с высоким содержанием углеводов или жиров. ( A ) Сыворотка FFA у мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности диеты с высоким содержанием жиров или углеводов. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Срезы перигонадной жировой ткани мышей во время потери веса, вызванной диетой с высоким содержанием жиров (левая панель) или высоким содержанием углеводов (правая панель).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( C ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности диеты с высоким содержанием жиров или углеводов. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05, по сравнению с ограничением калорийности HFD. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Жировая триглицерид липаза (также известная как деснутрин или протеин 2, содержащий пататин-подобный домен фосфолипазы) ( Atgl / Pnpla2 ) регулирует как базальный, так и необходимый липолиз в жировой ткани.Животные с дефицитом ATGL / PNPLA2 серьезно нарушены в их способности мобилизовать FFA, имеют очень низкий базальный липолиз и неспособны повышать потребность в липолизе в ответ на голодание, несмотря на сохранность гормонального и вегетативного ответа на голодание (36). Чтобы предоставить генетические доказательства того, что липолиз является критическим детерминантом содержания ATM, мы изучили эффекты голодания на мышах Atgl / Pnpla2 ^{— / —} . В соответствии с нашей гипотезой, мы обнаружили, что ad libitum — кормил Atgl / Pnpla2 ^{— / —} мышей имеет менее 3% банкоматов и что после голодания не было увеличения количества банкоматов (рисунок, A и B). или экспрессия генов, специфичных для макрофагов (рис. C).Эти данные свидетельствуют о том, что липаза ATGL / PNPLA2 необходима для рекрутирования и накопления ATM в жировой ткани.

( A ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в перигонадальных срезах жировой ткани из Atgl ^{+ / +} (верхняя панель) и Atgl ^{— / —} (нижняя панель) мышей, которых кормили ad libitum (слева) или голодали (справа).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 100 мкм. ( B ) Макрофаги в процентах от всех клеток у мышей Atgl ^{+ / +} , получавших постное питание ad libitum, и мышей Atgl ^{— / —} , получавших голодное питание. n = 4–5 мышей / группа. *** P <0,001 по сравнению с кормлением ad libitum. ( C ) Экспрессия генов, специфичных для макрофагов, в перигонадальной жировой ткани мышей Atgl ^{— / —} , получавших без ограничений и голодавших без пищи. n = 4–5 мышей / группа. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Липолиз жировой ткани вызывает миграцию макрофагов.

Скорость митоза в жировой ткани голодных мышей была очень низкой (<2%) и не отличалась от скорости митоза в жировой ткани у мышей, получавших ad libitum (дополнительные рисунки 9, B и C), что позволяет предположить, что липолиз -зависимое увеличение ATM было не из-за пролиферации, а следствием рекрутирования миелоидных клеток. Чтобы определить, увеличивает ли липолиз высвобождение хемоаттрактантов жировой ткани для макрофагов, мы выполнили анализ миграции с эксплантатами жировой ткани от голодных и получающих неограниченное питание мышей.Эксплантаты перигонадной жировой ткани собирали у тощих мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали в базовых условиях или с добавлением изопротеренола для индукции липолиза. Как и ожидалось, по сравнению с жировой тканью, выделенной от мышей, получавших ad libitum, жировая ткань от голодных мышей или жировая ткань, обработанная изопротеренолом, увеличивала липолиз, о чем свидетельствует увеличение высвобождения FFA (Рисунок A). При таком увеличении липолиза пропорционально увеличивалась хемотаксическая активность жировой ткани по отношению к макрофагам, происходящим из костного мозга (BMDM).Это увеличение активности хемоаттрактанта жировой ткани было сопоставимо с таковым, индуцированным MCP-1 / CCL2 (Рисунок B). Мы также обнаружили, что в отличие от голодных мышей дикого типа, голодные CCR2-дефицитные мыши не увеличивали экспрессию генов, специфичных для макрофагов (дополнительная фигура 9D). Однако не наблюдалось увеличения экспрессии в жировой ткани известных лигандов CCR2 во время голодания (данные не показаны). Эти данные согласуются с набором банкоматов во время быстрого многоступенчатого процесса, в котором накопление предшественников ATM в кровотоке зависит от CCR2, но для перехода в депо жира действительно требуется CCR2 или его лиганд.

Эксплантаты перигонадальной жировой ткани выделяли от тощих мышей, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от голодных животных инкубировали в базовых условиях, тогда как эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) или без нее. ( A ) Концентрацию FFA измеряли в среде, кондиционированной эксплантатом. ( B ) Хемотаксическую активность контрольной среды, среды с добавлением MCP-1 / CCL2 (50 нг / мл) и среды, кондиционированной эксплантатом, измеряли с использованием стандартного анализа миграции для BMDM.Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 4, 5–8 повторов на образец. * P <0,05; ** P <0,01.

Снижение веса и липолиз активируют программу поглощения липидов банкоматами.

Основная функция макрофагов — фагоцитоз тканеспецифических продуктов таким образом, чтобы поддерживать гомеостаз ткани. Например, в кости, остеокласте (многоядерный макрофаг кости) резорбция матрикса необходима для поддержания здоровья кости (39).По аналогии, накопление ATM в периоды повышенного липолиза может способствовать поглощению или фагоцитозу избыточных местных липидов и участвовать в обмене липидов в жировой ткани. Действительно, отличительной особенностью АТМ при ожирении является накопление внутриклеточных липидов (19, 29). В жировой ткани людей с ожирением есть банкоматы с множеством липидных капель и другие, которые образуют многоядерные гигантские клетки, содержащие большие одноглазные капли. В соответствии с основной функцией АТМ, заключающейся в поглощении липидов в периоды повышенного высвобождения FFA из адипоцитов, экспрессия в жировой ткани 2 рецепторов транспорта липидов макрофагов, Cd36 и Msr1 , увеличивается в начальный период веса. потеря (рисунок А).К 42 дню ограничения калорийности, когда липолиз жировой ткани снижается, экспрессия этих 2 генов возвращается к уровням, наблюдаемым у мышей, никогда не снижавших веса. Чтобы определить, действительно ли липолиз вызывает накопление липидов в банкоматах, мы исследовали содержание липидных капель в макрофагсодержащих стромальных сосудистых клетках (SVC) после 24-часового голодания. Голодание резко индуцировало образование липидных капель в банкоматах и ​​увеличивало количество липидсодержащих пузырьков на 39% в банкоматах, выделенных натощак, по сравнению с ATM, полученными от тучных мышей C57BL / 6J, получавших ad libitum (17.3 ± 3 против 24,1 ± 4,7 липидных везикул на клетку; P <0,001; Рисунок, Б и В). Голодание также увеличивало экспрессию генов, участвующих в захвате, хранении липидов ( Adfp , aP2 , Cd36 ) и экспорте ( Abca1 и ApoE ) в стромальной сосудистой фракции жировой ткани (Рисунок D). .

( A ) Экспрессию в жировой ткани генов, продукты которых, CD36 (Cd36) и рецептор скавенджера A (Msr1), участвуют в захвате липидов макрофагами, измеряли в перигонадальной жировой ткани во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05; *** P <0,001, по сравнению с нулевым днем ​​( B ) Стромальные сосудистые клетки (SVC), выделенные из перигонадальной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum (левая панель) или голодали. в течение 24 часов (правая панель) окрашивали на нейтральный липид масляным красным О. Масштабные полосы: 50 мкм. ( C ) Количество липидных капель в макрофагах из перигонадной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. n = 5 мышей / группа. *** P <0,001. ( D ) Экспрессия генов (в стромальной сосудистой фракции), кодирующих белки, участвующие в захвате, утилизации и экспорте липидов. n = 5 мышей / группа. * P <0,05. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Чтобы более точно определить, поглощают ли АТМ липиды в ответ на липолиз как таковой, мы создали систему in vitro для оценки эффектов стимулированного адренергическим действием липолиза адипоцитов на функцию АТМ.Мы совместно культивировали SVC, которые включают макрофаги с жировой тканью от тощих мышей C57BL / 6J в присутствии адренергического стимула (изопротеренол). В отсутствие жировой ткани лечение изопротеренолом не влияло на экспрессию гена SVC или накопление липидов (фигура, A и C, и дополнительная фигура 10A). Однако в присутствии жировой ткани изопротеренол индуцировал экспрессию гена Adfp , который кодирует белок липидных капель, покрывающий липидные капли в банкоматах (19).Кроме того, экспрессия Cd36 увеличилась ( P = 0,09) (Рисунок A). Не было активации программы дифференцировки адипоцитов, то есть не было увеличения экспрессии адипонектина или лептина и снижения экспрессии Pparg (дополнительная фигура 10B). Кроме того, совместное культивирование с жировой тканью и, в большей степени, с добавлением стимуляции изопротеренолом, индуцировало экспрессию гена Ccr2 во фракции SVC, потенциально отражая активацию программы хемотаксических макрофагов (Рисунок B).Гистологически индукция липолиза привела к накоплению липидов в SVC (Рисунок, C и D) и увеличила появление многоядерных нагруженных липидами макрофагов, которые обычно наблюдаются в жировой ткани у людей с ожирением (Рисунок E).

( A ) SVC, выделенные из перигонадальной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, культивировали либо отдельно, либо с кусочками перигонадальной жировой ткани (полученными от тощих животных) с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) или без нее для индукции липолиза. во фракции жировой ткани.Измеряли экспрессию генов Adfp и Cd36 в SVC. n = 5 мышей / группа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. ( B ) Экспрессию хемокинового рецептора Ccr2 измеряли в SVC, обработанных, как описано в A . Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 5 мышей / группа. ( C ) SVC, обработанные изопротеренолом, культивированные отдельно (левая панель) или с жировой тканью (правая панель), окрашивали на нейтральный липид масляным красным О. Липидсодержащие клетки отмечены стрелками.Масштабные линейки: 50 мкм. ( D ) Процент липидсодержащих клеток среди SVC, обработанных, как описано в A . n = 5 мышей / группа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; ^† P = 0,09. ( E ) Присутствие насыщенных липидами многоядерных гигантских клеток среди SVC, сокультивированных с жировой тканью в присутствии изопротеренола. Масштабная линейка: 15 мкм.

Истощение макрофагов увеличивает липолиз жировой ткани.

Привлечение ATM и поглощение липидов во время периодов липолиза привело нас к гипотезе о том, что ATM играют роль в регулировании локальных концентраций FFA. Чтобы определить, влияют ли ATM на липолиз или высвобождение липидов, мы удалили ATM из жировой ткани, которая содержала высокую концентрацию макрофагов. Эксплантаты эпидидимальной жировой ткани собирали у мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которые голодали в течение 24 часов. Эксплантаты обрабатывали инкапсулированным в липосомы клодронатом для истощения ATM, а контрольные эксплантаты от тех же животных обрабатывали инкапсулированным в липосомы PBS.Клодронат представляет собой бифосфонат, который вызывает апоптоз макрофагов при фагоцитозе в липосомах. Как и ожидалось, обработка клодронатом снижала примерно на 80% содержание макрофагов, что измерялось по экспрессии маркера макрофагов Emr1 и экспрессируемого макрофагами рецептора скавенджера Msr1 . Истощение макрофагов увеличивает экспрессию липазы Atgl / Pnpla2 в 2,5 раза и увеличивает экспрессию регулируемых жирными кислотами генов Fabp4 / aP2 , Acadl и Dgat1 .Индукция липазы и генов, необходимых для метаболизма жирных кислот, предполагает, что истощение макрофагов увеличивает липолиз и субстраты FFA. Действительно, по сравнению с обработанными контрольными эксплантами жировой ткани, истощенные макрофагами эксплантаты имели на 27% более высокую скорость липолиза, измеренную по высвобождению глицерина. Чтобы оценить, может ли истощение макрофагов иметь аналогичный эффект на метаболизм FFA in vivo, мы внутрибрюшинно вводили худым мышам C57BL / 6J клодронат, инкапсулированный в липосомы, чтобы истощить ATM из депо внутрибрюшной жировой ткани, а затем голодали их в течение 24 часов.Обработка клодронатом по сравнению с контрольной обработкой (инкапсулированный в липосомы PBS) снижала экспрессию генов, специфичных для макрофагов, более чем на 90% (дополнительная фигура 10C). Интраабдоминальное истощение АТМ увеличивало сыворотку натощак (FFA) на 69% по сравнению с контрольными мышами, которым инъецировали липосомы (Рисунок C). Эти данные предоставляют предварительные доказательства того, что функция макрофагов частично ослабляет вызванное липолизом высвобождение FFA.

Затем эксплантаты обрабатывали либо инкапсулированным в липосомы клодронатом, либо инкапсулированным в липосомы PBS. Эксплантаты от одних и тех же мышей обрабатывали в обоих экспериментальных условиях. ( A ) Экспрессия генов, специфичных для макрофагов, и генов, участвующих в метаболизме липидов в эксплантах. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 4 мыши / группа. ( B ) Высвобождение глицерина из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, обработанных либо инкапсулированным в липосомы клодронатом, либо инкапсулированным в липосомы PBS.Клодронат, инкапсулированный в липосомы, вводили внутрибрюшинно худым мышам C57BL / 6J. Мышей не кормили в течение 24 часов, начиная с 3 дня после инъекции, и истощение макрофагов в перигонадной жировой ткани было подтверждено в конце периода голодания (день 4). Инкапсулированный в липосомы PBS также вводили в качестве контроля. ( C ) Концентрация FFA в сыворотке у мышей, получавших клодронат или PBS, после 24-часового голодания. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 8 мышей / группа. * P <0.05; ** P <0,01 по сравнению с обработкой PBS.

Обсуждение

Ожирение порождает сложный иммунный ответ, характерным признаком которого является накопление макрофагов в жировой ткани. Факторы, которые регулируют накопление ATM, четко не определены, и действительно, эффекты других метаболических нарушений на накопление и функцию ATM в значительной степени не исследованы. В других условиях рекрутирование предшественников миелоидных макрофагов происходит в ответ на нарушение функции ткани, обычно в ответ на повреждение или чужеродный патоген, но также в ответ на нарушения липидных потоков (40).Например, в стенке артерии локальный избыток холестерина и липопротеинов через двухэтапный процесс рекрутирования и захвата липидов приводит к накоплению нагруженных липидами макрофагов (пенистых клеток) (41). Заполненные липидами макрофаги также являются характерной находкой в ​​жировой ткани людей с ожирением (19, 29). Поэтому мы предположили, что повышенный поток липидов может также регулировать накопление ATM в депо жировой ткани. Здесь мы показали, что накопление макрофагов в жировой ткани является острой реакцией на потерю веса и регулируется липолизом жировой ткани.Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями липолиза при ожирении. Общий базальный липолиз хронически повышен в жировой ткани у людей с ожирением по сравнению с жировой тканью у худых людей (25) и в интраабдоминальном по сравнению с подкожной жировой тканью (30, 31). Именно в этих условиях и в депо, в которых липолиз выше, содержание АТМ также повышается (2, 5, 18, 33).

Роль банкоматов в развитии воспаления жировой ткани, вызванного ожирением, и связанных с ним патологических последствий, включая инсулинорезистентность, интенсивно изучается.Наши данные о том, что ATM быстро увеличивают захват липидов в ответ на липолиз адипоцитов, предполагают, что ATM могут выполнять адаптивную функцию, по крайней мере, в течение коротких периодов времени, поглощая избыток FFA (рисунок). Подобный процесс лежит в основе развития атером, когда повышенные концентрации холестерина в стенках сосудов приводят к привлечению предшественников макрофагов в субэндотелиальные пространства. Эффективный захват и клиренс липидов из сосудистой сети является адаптивным, пока макрофагальный клиренс холестерина не нарушен.Однако при развитии атером накопление холестерина опережает способность макрофагов очищать липиды; макрофаги поглощают холестерин, но не мигрируют из своего анатомического местоположения. Таким образом, нагруженные холестерином макрофаги со временем образуют пенистые клетки, которые остаются в стенке сосуда и становятся центральным патогенным компонентом атеросклеротических поражений (41). Во время похудания как повышение липолиза, так и увеличение АТМ являются временными. Это говорит о том, что ATM участвуют в поглощении избыточного липида и его выходе из ткани.Однако при ожирении хроническое повышение липолиза и местных концентраций FFA обеспечивает постоянный сигнал для накопления макрофагов. Со временем фенотип АТМ при ожирении, в отличие от того, что наблюдается при потере веса, изменяется так, что популяция CD11c ⁺ , которая описывается как более воспалительная, преобладает и приводит к нарушению местного метаболизма.

Активация липолиза во время ранней потери веса и голодания увеличивает локальное высвобождение FFA (а также глицерина и других побочных продуктов липолиза), вызывая рекрутмент ATM.Однажды задействованные, ATMs фагоцитируют избыток липидов и потенциально секретируют антилиполитические факторы, которые вместе снижают локальные концентрации FFA.

Чтобы понять функции банкоматов, было предпринято множество попыток описать производство воспалительных молекул в банкоматах. Однако, как «профессиональные» фагоциты, макрофаги также эффективны в поглощении замечательного набора молекул, от небольших липидов и колоний патогенов до умирающих и мертвых клеток (42). Присутствие липидных капель в банкоматах, в том числе крупных однокамерных капель в многоядерных гигантских клетках, показало некоторым, что ATM в первую очередь функционируют для фагоцитоза некротических адипоцитов (19).Быстрое появление липидных капель в банкоматах во время голодания, даже у худых животных, предполагает, что привлечение макрофагов к жировой ткани, по крайней мере, во время отрицательного энергетического баланса, является частью скоординированного ответа, который может снизить локальные внеклеточные концентрации FFA.

Было обнаружено, что FFA и другие липиды регулируют состояние активации и иммунную функцию миелоидных клеток и макрофагов. В качестве внеклеточных сигналов жирные кислоты, особенно насыщенные жирные кислоты, активируют классические воспалительные реакции в макрофагах и других иммунных клетках посредством задействования рецепторов распознавания образов, включая TLR (43–45).Наши результаты показывают, что липолиз и повышенные концентрации FFA могут также регулировать накопление макрофагов и делать это без активации провоспалительного или M1-поляризованного состояния. Увеличение количества макрофагов более чем на 40% во время начальной фазы потери веса происходит без увеличения экспрессии воспалительных генов или концентрации циркулирующих адипокинов и поддерживает модель, в которой липиды, помимо их участия в активации ATM, играют важную и особую роль в ATM. набор персонала.

Накопление банкоматов в жировой ткани — это только часть иммунного ответа на ожирение. Т-клетки также рекрутируются в жировую ткань во время развития ожирения (1, 7–9, 11). Если Т-клетки играют роль в жировой ткани, сравнимую с той, что играет в атеромах, субпопуляции Т-клеток могут регулировать набор и функцию ATM и других миелоидных клеток. Сложность иммунного ответа жировой ткани на метаболические нарушения дополнительно увеличивается из-за неоднородности популяций АТМ.Два крупнейших класса ATM можно выделить на основе экспрессии антигенов F4 / 80, CD11b и CD11c; одна популяция экспрессирует все 3 антигена (клетки FBC), а вторая — только F4 / 80 и CD11b (клетки FB) (46, 47). Представленные здесь данные свидетельствуют о том, что в основном клетки FB накапливаются во время отрицательного энергетического баланса. Это контрастирует с развитием ожирения, когда преобладают клетки FBC, и может объяснить, почему накопление ATM во время ранней потери веса не сопровождается увеличением воспаления жировой ткани и резистентности к инсулину.Онтогенез, функции и, в частности, метаболизм свободных жирных кислот и других липидов отдельных субпопуляционных АТМ еще предстоит определить и, вероятно, предоставят механистическое понимание различий в иммунном ответе на ожирение и потерю веса.

Наши результаты подтверждают модель, в которой липолиз жировой ткани способствует привлечению ATM и захвату липидов (рисунок). Эти данные предполагают, что ATM могут играть роль в сдерживании внеклеточного увеличения концентраций FFA в периоды высокого липолиза и, таким образом, могут защищать локальную функцию адипоцитов.В худом состоянии адипоциты накапливают мало липидов, базальный липолиз ограничен, а банкоматов мало. Когда липолиз активируется и концентрации FFA резко увеличиваются, макрофаги быстро накапливаются в жировой ткани без значительного начального увеличения воспаления. После набора, ATMs фагоцитируют избыток липидов, возможно, снижая стресс адипоцитов. Во время потери веса увеличение потребности в липолизе увеличивает локальную концентрацию FFA и, таким образом, рекрутмент ATM. Однако постепенно, по мере уменьшения запасов триглицеридов и снижения базального липолиза, содержание АТМ снижается.При ожирении избыточное накопление липидов большими адипоцитами увеличивает базальный липолиз и, таким образом, чистое высвобождение FFA. Макрофаги привлекаются к жировой ткани, но в отличие от потери веса, при которой липолиз в конечном итоге уменьшается, хроническая стимуляция банкоматов приводит к локальному воспалению и изменению метаболической функции.

Методы

Мыши и протокол потери веса.

Самцов мышей C57BL / 6J были получены из лаборатории Джексона в возрасте 9 недель и размещены индивидуально в вентилируемых клетках из оргстекла в пределах барьера, свободного от патогенов, который поддерживает цикл 12 часов света / 12 часов темноты.Мышей кормили диетой с высоким содержанием жиров (D12492; Research Diets Inc.) (подробности о составе рациона см. В дополнительной таблице 1). Пищевые гранулы помещали на кормушки (Wenzel) для повышения точности измерений потребления пищи. Потребление пищи измеряли ежедневно для каждой мыши индивидуально в течение 1 месяца до начала ограничения калорийности. Ограничение калорийности начинали, когда мышей весили 40–41 г. Мы изменили распределение мышей по разным группам с ограничением калорий, чтобы возраст каждой группы существенно не отличался при умерщвлении (дополнительный рисунок 2).Во время ограничения калорийности каждая мышь получала 70% от своего потребления ad libitum (среднее потребление пищи 70% / средний вес). Контрольная постная группа получала стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc.). Для эксперимента по ограничению калорийности высокоуглеводной диеты мышей переводили на D12450B (Research Diets Inc.) (см. Дополнительную таблицу 1 для получения подробной информации о составе диеты). Потребление пищи корректировали ежедневно в зависимости от веса мыши. Мышей кормили в начале цикла темноты и света (они получали две трети пищи в темноте и одну треть во время светового цикла.Измерения состава тела проводились с помощью анализатора ЯМР miniSpec TD (Bruker). Образцы крови для измерения исходного уровня инсулина были получены при поднижнечелюстном кровотечении. Уровень глюкозы в крови измеряли с помощью глюкометра FLASH FreeStyle (Abbott). Мышей умерщвляли асфиксией CO ₂ и смещением шейного отдела после 4-часового голодания в течение пятого и шестого часов светового цикла. Образцы сыворотки для окончательных измерений инсулина, свободных жирных кислот и цитокинов собирали путем сердечной пункции.Подкожную брюшную, эпидидимальную, периренальную и брыжеечную жировые ткани иссекали, и правые депо жировой ткани и все брыжеечные депо взвешивали для каждого животного. Образцы тканей замораживали в жидком азоте и хранили при –80 ° C перед экстракцией РНК и иммуногистохимическим анализом. Эксперимент проводился в 2 отдельных случаях ( n = 40 на эксперимент). Все эксперименты на животных были одобрены IACUC Колумбийского университета.

Голодные эксперименты.

Постных мышей C57BL / 6J (возраст от 8 до 9 недель), получавших стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc.), не кормили в течение 24 часов, начиная со второго часа светового цикла. В качестве контроля использовали мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum по весу и возрасту. Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

Для экспериментов натощак на мышах с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, использовали мышей в возрасте от 24 до 28 недель. Мышей помещали на диету с высоким содержанием жиров (D12492 / Research Diets Inc.) начиная с 6-недельного возраста. Они прошли 24-часовое голодание, начиная со второго часа светового цикла.

Пять 8-недельных мышей Ccr2 ^{— / —} и пять 8-недельных Ccr2 ^{+ / +} мышей (однопометников), получавших стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc. ) голодали в течение 24 часов, начиная со второго часа светового цикла. Пять одинаковых по весу и возрасту мышей Ccr2 ^{— / —} и 5 Ccr2 ^{+ / +} (однопометники) использовали в качестве контроля.Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

CL316,243 для лечения мышей.

Десять 8-недельных мышей C57BL / 6J, получавших стандартную гранулированную диету (см. Выше), вводили внутрибрюшинно 1 мг / кг CL316,243 или физиологического раствора дважды (4 часа между каждой инъекцией). Мышей умерщвляли через 14 часов после второй инъекции. Перигонадную жировую ткань иссекали и образцы хранили, как описано выше.

Обработка мышей BrdU.

Десять 8-недельных мышей C57BL / 6J, получавших стандартную гранулированную диету (см. Выше), вводили внутрибрюшинно 0,133 мг / г BrdU (Sigma-Aldrich) или носитель дважды (3 часа между каждой инъекцией). Через 1,5 часа после первой инъекции мы убрали еду из опытной группы. Контрольную группу кормили без ограничений. Обе группы были принесены в жертву 24 часа спустя. Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

Мыши Atgl

Образцы перигонадальной жировой ткани от Atgl ^{+ / +} и Atgl ^{— / —} мышей были собраны у худых мышей в возрасте 8–9 недель, которых кормили ad libitum или голодали в течение 16 часов.

Метаболические анализы.

Уровни инсулина в сыворотке определяли с помощью сверхчувствительного инсулинового ELISA (Mercodia Inc.). PAI-1 и резистин в сыворотке измеряли с использованием панели мышиного адипокина LINCOplex (Millipore). Уровень лептина в сыворотке измеряли с использованием количественного анализа лептина мыши ELISA (системы R&D).FFA измеряли с использованием серии HR NEFA (Wako Diagnostics). Образцы крови для выделения сыворотки собирали после 4-часового голодания в течение пятого и шестого часов светового цикла. Образцы сыворотки, собранные, представленные на рисунке A, также были проанализированы на несколько гормонов и цитокинов и поэтому были помещены на влажный лед перед дальнейшей обработкой. Образцы сыворотки, представленные на рисунке A и рисунке A, использовались только для анализа FFA и были немедленно заморожены в жидком азоте перед анализом (для минимизации липолиза триглицеридов).

Иммуногистохимия.

Образцы жировой ткани фиксировали в течение 48 часов при комнатной температуре в цинк-формалиновом фиксаторе (Anatech Ltd.), инкубировали в 70% этаноле в течение 24 часов и затем заливали парафином. Срезы размером 5 мкм с интервалами 50 мкм помещали на заряженные предметные стекла, депарафинизировали в ксилоле и окрашивали на экспрессию F4 / 80 крысиным моноклональным антителом против F4 / 80 мыши (Abd Serotec). Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 80 минут при комнатной температуре (разведение 1: 100).Крысиный IgG2a (Invitrogen) использовали в качестве изотипического контроля (разведение 1:50). Затем использовали биотинилированное вторичное антитело против крыс в разведении 1: 200, затем комплекс Avidin DH: биотинилированная пероксидаза H хрена (Vector Laboratories) и развитие в хромогенном субстрате 3,3′-диаминобензидин (Vector Laboratories). Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для каждого отдельного депо жировой ткани было проанализировано 5–10 различных мощных полей из каждого из 3 различных срезов. Общее количество ядер и количество ядер клеток, экспрессирующих F4 / 80, подсчитывали для каждого поля.Долю клеток, экспрессирующих F4 / 80, для каждого образца рассчитывали как сумму количества ядер клеток, экспрессирующих F4 / 80, деленное на общее количество ядер в срезах образца. Площадь поперечного сечения определяли для каждого адипоцита в каждом поле с использованием программного обеспечения для анализа изображений Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.). Для каждой мыши подсчитывали 800–1000 адипоцитов. Число адипоцитов рассчитывали исходя из веса жировой подушечки и объема адипоцитов (48).

Для обнаружения BrdU-положительных клеток готовили срезы, как описано выше, и проводили иммуногистохимию с использованием моноклонального биотинилированного анти-BrdU (набор для окрашивания BrdU; Invitrogen).Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для каждого отдельного депо жировой ткани было проанализировано 10 различных мощных полей из каждого из 3 различных срезов. Общее количество ядер и количество ядер BrdU-положительных клеток подсчитывали для каждого поля. Долю BrdU-положительных клеток для каждого образца рассчитывали как сумму количества ядер BrdU-положительных клеток, деленную на общее количество ядер в срезах образца.

Для обнаружения CD11c-положительных клеток использовали замороженные срезы (10 мкм).Срезы окрашивали на экспрессию CD11c антителом хомяка против CD11c мыши (Abd Serotec). Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 60 минут при комнатной температуре (разведение 1: 100). IgG хомяка использовали в качестве изотипического контроля (разведение 1: 100) (Abd Serotec). Затем использовали биотинилированное вторичное антитело против хомяка в разведении 1: 200 (30 минут), затем использовали комплекс Avidin DH: биотинилированная пероксидаза H хрена (Vector Laboratories) и проявили в хромогенном субстрате 3,3′-диаминобензидин (Vector Laboratories). .Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Общее количество ядер и количество CD11c-положительных CLS подсчитывали для каждого поля. Долю CD11c-положительных CLS для каждого образца рассчитывали как сумму количества положительных CLS, деленную на общее количество ядер в срезах образца.

Для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, экспрессирующих F4 / 80 и CD11c, использовали замороженные срезы. Срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C (разведение 1: 100).Затем добавляли ослиный IgG против Cy3 крысы (Jackson ImmunoResearch) и козий IgG против хомяка Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Срезы инкубировали 45 минут при комнатной температуре (разведение 1: 300). Флуоресцентную микроскопию выполняли с использованием Nikon Eclipse 80i, оснащенного камерой Retiga Exi и системой флуоресцентного освещения X-Cite 120.

Количественная ОТ-ПЦР.

экстрагировали из замороженной жировой ткани с использованием кислотно-фенольного реагента (TRIzol; Invitrogen). РНК выделяли из SVC с использованием QIAGEN RNeasy Minikit (QIAGEN) и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen) и случайных гексамерных праймеров.Количественные анализы RT-PCR проводили с использованием системных инструментов DNA Engine Opticon 2 (Bio-Rad) и PCR SYBR Green I QuantiTect Master Mix (QIAGEN). Экспрессия мРНК всех указанных генов нормализована к экспрессии гена циклофилина B ( Ppib ). Каждую реакцию проводили в двух экземплярах, и данные анализировали методом 2-DDCT (49). Все использованные праймеры перечислены в дополнительной таблице 3.

Липолиз in vitro изолированной перигонадальной жировой ткани (эксплантаты).

Перигонадные жировые подушечки были удалены хирургическим путем у мышей C57BL / 6J, получавших с высоким содержанием жира ( n = 5 / группа), которые либо получали питание ad libitum, либо подвергались ограничению калорийности. Впоследствии их несколько раз промывали PBS. Кусочки ткани (общий вес ~ 100 мг) инкубировали в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 2% БСА, не содержащий жирных кислот (Sigma-Aldrich), при 37 ° C. Аликвоты собирали через 120 минут и исследовали на содержание FFA и глицерина. FFA и глицерин измеряли с использованием серии HR NEFA (Wako Diagnostics) и набора для определения свободного глицерина (Sigma-Aldrich) соответственно.Мы измерили количество адипоцитов в параллельных образцах от мышей, получавших ad libitum с одинаковым весом и жиром, и мышей с ограничением калорийности.

Опыты по совместительству.

Чтобы изолировать SVC, перигонадальную жировую ткань выделяли у самцов мышей C57BL / 6J с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, сразу после удушья CO ₂ . Ткани обрабатывали стерильными методами и измельчали ​​на мелкие (<10 мг) кусочки. Для выделения SVC измельченные образцы помещали в DMEM (Invitrogen) с добавлением 10 мг / мл BSA (Sigma-Aldrich).К суспензии ткани добавляли коктейль с обедненной ЛПС коллагеназой (Liberase 3; Roche Applied Science) в концентрации 0,03 мг / мл, и образцы инкубировали при 37 ° C на орбитальном шейкере (3 г ) в течение 45 минут. минут. После завершения разложения образцы пропускали через стерильную нейлоновую сетку 250 мкм (Sefar America Inc.). Суспензию центрифугировали при 500 г в течение 5 минут. Осажденные клетки собирали в виде SVC. SVC ресуспендировали в буфере для лизиса эритроцитов (BD Biosciences) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты.SVC высевали в концентрации 650 000 клеток / лунку на вкладыши для клеточных культур с размером пор 1 мкм (BD). Каждую вставку помещали в лунку 12-луночного планшета для культуры ткани (BD), содержащего 100 мг тонко измельченной жировой ткани. Чтобы выделить небольшие неповрежденные кусочки жировой ткани для культивирования, перигонадную жировую ткань удаляли у тучных мышей C57BL / 6J, получавших пищу с высоким содержанием жира, и измельчали ​​до кусочков размером примерно 10 мг. SVC совместно культивировали с кусочками жировой ткани в течение 24 часов в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин и 2% BSA, не содержащий жирных кислот.Изопротеренол (Sigma-Aldrich) добавляли в выбранные лунки в концентрации 10 мкмоль / л. Фракцию стромальных сосудов собирали для экспрессии гена или окрашивания масляным красным О через 24 часа.

Масляное красное окрашивание О. SVC

сушили на воздухе и фиксировали цинк-формалиновым фиксатором (см. Выше) в течение 10 минут и окрашивали масляным красным О, как описано ранее (50).

Анализ миграции макрофагов.

BMDM мыши были дифференцированы in vitro из клеток-предшественников костного мозга.Вкратце, клетки костного мозга вымывали из бедренных и большеберцовых костей 9-недельных мышей C57BL / 6J, промывали в DMEM (Invitrogen) и выращивали в течение 7 дней в чашках Петри, содержащих DMEM с 10% FBS, 20% кондиционированных клеток L929. среды, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина и 1% пирувата натрия. На седьмой день среды заменяли на DMEM, содержащую 10% FBS, 10% среды, кондиционированные клетками L929, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина и 1% пирувата натрия; макрофаги выращивали еще 3 дня. Дифференциация подтверждена анализом FACS.Миграцию BMDM оценивали с использованием 96-луночного анализа миграции клеток с 5 мкм хемотаксисом QCM (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя. В нижнюю камеру добавляли среду, кондиционированную эксплантатом, простую среду или среду, содержащую рекомбинантный MCP-1 (50 нг / мл) (PeproTech). Для получения среды, кондиционированной эксплантами, эксплантаты выделяли от тощих 10-недельных мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от голодных животных инкубировали в базовых условиях, как описано выше, тогда как эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) (Sigma-Aldrich) или без нее.Содержание FFA в эксплантатах оценивали с помощью серии HR NEFA (Wako Diagnostics). Планшеты с миграционной камерой инкубировали в течение 15 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . В конце инкубации клетки детектировали зеленым флуоресцентным красителем (краситель CyQUANT), включенным в анализ. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью Infinite 500 (Tecan). Количество клеток определяли на основании показаний флуоресценции и стандартной кривой.

Препарат клодроната, инкапсулированный в липосомы.

24 мг холестерина и 258 мг фосфатидилхолина (Sigma-Aldrich) растворяли в хлороформе в круглодонной колбе. Хлороформ упаривали при 37 ° C в роторном испарителе в вакууме до образования тонкой липидной пленки. Три грамма клодроната (динатриевая соль дихлорметилендифосфоновой кислоты) (Sigma-Aldrich) растворяли в 15 мл PBS. Раствор клодронат-PBS или контрольный раствор PBS добавляли к липидной пленке и встряхивали при 4 г в течение 30 минут.Раствор обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при комнатной температуре в ультразвуковом устройстве с водяной баней (50 Вт). Липосомы центрифугировали при 49 400 g в течение 1 часа и ресуспендировали в 12 мл PBS.

Истощение макрофагов инкапсулированным в липосомы клодронатом.

Клодронат, инкапсулированный в липосомы, вводили внутрибрюшинно мышам C57BL / 6J. Каждой мыши вводили липосомы, содержащие 115 мг / кг клодроната или эквивалентный объем липосом, содержащих PBS.Мышей не кормили в течение 24 часов, начиная с 3 дня после инъекции, и истощение макрофагов в перигонадной жировой ткани было подтверждено в конце периода голодания (день 4). Для экспериментов in vitro перигонадные жировые подушечки были хирургически удалены у мышей C57BL / 6J, получавших пищу с высоким содержанием жира ( n = 4 / группа), которые не голодали в течение 24 часов. Впоследствии их несколько раз промывали PBS. Кусочки ткани (общий вес ~ 75 мг) инкубировали в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 1% антибиотиков, без добавления сыворотки.Через 6 часов в свежую среду добавляли 20% липосом, содержащих либо клодронат, либо PBS, до конечного объема 1 мл. Эксплантаты выдерживали в течение 48 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . Затем среды, содержащие липосомы, перемещали и добавляли DMEM, содержащую 2% БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich). Аликвоты собирали через 120 минут и исследовали на содержание глицерина. Глицерин измеряли с помощью набора для определения свободного глицерина (Sigma-Aldrich). Эксплантаты также использовали для выделения РНК.

Статистика.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Все значения P были рассчитаны с использованием двухстороннего распределения, двухвыборочного теста с неравной дисперсией t Стьюдента. Все расчеты были выполнены с использованием Microsoft Excel и Statistica (Statsoft Inc.).

Потеря веса и липолиз способствуют динамическому иммунному ответу в жировой ткани мышей

Abstract

Ожирение вызывает иммунный ответ, характеризующийся привлечением миелоидных клеток к ключевым органам обмена веществ, включая жировую ткань.Однако реакция иммунных клеток на непатологические метаболические стимулы менее изучена, а факторы, регулирующие метаболически-зависимое накопление иммунных клеток, изучены не полностью. Здесь мы охарактеризовали реакцию макрофагов жировой ткани (ATM) на потерю веса и голодание у мышей и определили роль липолиза в рекрутинге и накоплении ATM. Мы обнаружили, что иммунный ответ на потерю веса был динамичным; ограничение калорийности мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, привело к первоначальному увеличению набора ATM, тогда как содержание ATM снизилось после продолжительного периода потери веса.Пик числа АТМ совпал с пиком циркулирующих концентраций СЖК и липолиза жировой ткани, что позволяет предположить, что липолиз вызывает накопление АТМ. Действительно, голодание или фармакологически индуцированный липолиз быстро увеличивал накопление ATM, активность хемоаттрактанта жировой ткани и захват липидов ATM. И наоборот, диетические и генетические манипуляции, снижающие липолиз, уменьшали накопление АТМ. Истощение макрофагов в культурах жировой ткани увеличивает экспрессию липазы триглицеридов жиров и генов, регулируемых FFA, и увеличивает липолиз.Эти данные предполагают, что локальные потоки липидов являются центральными регуляторами рекрутирования ATM и что после рекрутирования ATMs образуют нагруженные липидами макрофаги, которые могут буферизовать локальное повышение концентрации липидов.

Введение

Ожирение активирует сложную иммунную программу, центральными особенностями которой являются дифференциация, активация и рекрутирование лимфоидных и миелоидных клеток в ключевые метаболические ткани (1–11). У млекопитающих увеличение массы жировой ткани вызывает накопление макрофагов жировой ткани (ATM), которые продуцируют провоспалительные молекулы, включая TNF-α, SAA3 и CCL2 (MCP-1) (2, 12).Банкоматы способствуют как местному, так и системному воспалению и модулируют метаболические фенотипы, включая резистентность к инсулину (13). Генетические и фармакологические манипуляции, которые уменьшают содержание АТМ или изменяют их воспалительное состояние у тучных грызунов, модулируют местное воспаление и связаны со снижением инсулинорезистентности (14). Например, дефицит или антагонизм Ccr2 снижает рекрутирование ATM и частично защищает мышей от инсулинорезистентности, вызванной ожирением (15). Сходным образом, миелоидная клеточно-специфическая делеция IKK-β, регулирующая воспалительный путь, снижает вызванное ожирением воспаление и индуцированную диетой инсулинорезистентность (6, 16).

Метаболические факторы, регулирующие иммунный ответ на ожирение и накопление макрофагов и других иммунных клеток в жировой ткани, остаются плохо изученными. У людей со стабильным весом и грызунов или тех, кто набирает вес, существует сильная положительная корреляция между размером адипоцитов и содержанием АТМ (2, 17, 18). Эта корреляция предполагает, что накопление макрофагов происходит в ответ на процесс, связанный с увеличением объема адипоцитов. Чинти и его коллеги предположили, что некротическая смерть адипоцитов, которая, по их гипотезе, вызвана гипертрофией и ускоряется ожирением, является основным стимулом, регулирующим накопление АТМ (19).Действительно, массивный апоптоз адипоцитов в трансгенной модели индуцибельной липоатрофии приводит к быстрому накоплению ATM (20) и предполагает, что гибель адипоцитов может управлять накоплением ATM. Однако недавние исследования показывают, что скорость гибели адипоцитов не увеличивается у лиц с ожирением (21). Другая убедительная гипотеза заключается в том, что гипоксия влияет на набор сотрудников банкоматов. В этой модели гипертрофия адипоцитов создает области микрогипоксии, которые активируют воспалительные программы, важные для ремоделирования сосудистой сети.Эти пути включают регулируемое JNK1 высвобождение хемокинов (22-24). Однако в недавнем исследовании экспрессия в жировой ткани Hif1a , основного фактора, опосредующего реакцию гипоксии, и Vegfa , ключевой нижестоящей мишени Hifa , отрицательно коррелировала с содержанием ATM (17).

Увеличение массы жировой ткани и объема адипоцитов имеет другие широкие метаболические последствия, включая снижение митохондриальной функции, повышенный стресс ER, нарушение передачи сигналов инсулина и более высокую скорость базального липолиза (25–28).Ключ к разгадке функции ATM и их регуляции может быть получен из наблюдения, что с увеличением ожирения ATMs образуют многоядерные синцитии, которые содержат большие липидные капли (19, 29), что позволяет предположить, что при ожирении ATMs фагоцитируют или поглощают избыток липидов. Тесная связь размера адипоцитов с накоплением макрофагов и захватом липидов предполагает, что избыток липидов может иметь решающее значение для накопления ATM. Поэтому мы предположили, что иммунная система и макрофаги напрямую реагируют на изменения в метаболической функции и потоках субстратов и, в частности, что вызванное ожирением увеличение базального липолиза (за счет увеличения объема жировых клеток) (25) увеличит локальные концентрации внеклеточных липидов и приведет к АТМ. накопление.В соответствии с этой гипотезой депо висцеральной жировой ткани — по сравнению с подкожными депо брюшной полости — имеют повышенную базальную скорость липолиза и содержат больше банкоматов (18, 30, 31). Если усиленный липолиз вызывает накопление АТМ, то изменение липолиза должно изменить накопление АТМ предсказуемым образом. Общий липолиз представляет собой сумму (а) базального липолиза, который в значительной степени определяется содержанием триглицеридов в адипоцитах, и (б) липолиза по требованию, который представляет собой гормонально регулируемое высвобождение FFA в ответ на потребности в питании.Ожирение увеличивает размер адипоцитов и, следовательно, базальный липолиз. Отрицательный энергетический баланс приводит к мобилизации запасов триглицеридов жировой ткани и активирует липолиз по требованию; следовательно, у лиц с ожирением во время ранней потери веса, когда содержание триглицеридов в адипоцитах остается высоким, как базальный, так и требуемый липолиз высоки, и, если наша гипотеза верна, содержание АТМ должно быть повышено.

Несмотря на то, что подробные исследования динамики накопления макрофагов в жировой ткани во время набора веса были выполнены, кинетика накопления ATM во время похудания остается плохо определенной.Постоянное увеличение веса и массы жировой ткани приводит к пропорциональному увеличению содержания АТМ (2, 5, 18). После стойкой потери веса содержание макрофагов снижается (32). Однако наша гипотеза предсказывает, что достижение отрицательного энергетического баланса за счет увеличения липолиза потребности должно нарушить корреляцию между массой жировой ткани / объемом адипоцитов и содержанием макрофагов во время ранней потери веса, когда объем адипоцитов и базальный липолиз существенно не снижаются, но потребность в липолизе высока.

Чтобы определить, влияет ли липолиз, вызванный потерей веса, накопление АТМ в жировой ткани, мы измерили содержание АТМ у мышей с ожирением, получавших пищу с высоким содержанием жира, которым проводилось умеренное ограничение калорийности, и контролировали кинетику накопления макрофагов в течение 2-месячного периода. Мы непосредственно определили, увеличивает ли накопление АТМ липолиз жировой ткани натощак и фармакологически. Напротив, мы снизили скорость липолиза жировой ткани за счет изокалорийной замены углеводов пищевым жиром и изучили эффекты голодания у мышей с дефицитом Atgl / Pnlap2 , чтобы оценить, снижает ли снижение липолиза накопление ATM.Мы изучили эффекты индукции липолиза на банкоматах in vivo и в интактной жировой ткани in vitro, чтобы определить, активирует ли липолиз сам по себе поглощение свободных жирных кислот в банкоматах. Наконец, мы удалили макрофаги из жировой ткани in vitro и обнаружили, что в отсутствие ATM экспрессия липазы Atgl / Pnpla2 в жировой ткани и липолиз увеличиваются. Наши результаты подтверждают модель, в которой липолиз жировой ткани приводит к накоплению АТМ и рекрутированию макрофагов в буфер, локальное увеличение концентрации липидов за счет фагоцитоза и, возможно, за счет модуляции метаболизма адипоцитов.

Результаты

Потеря веса вызывает кратковременное скопление банкоматов.

Чтобы понять, как иммунная система — и в частности банкоматы — реагирует на потерю веса, мы охарактеризовали метаболический и воспалительный фенотипы мышей с ожирением, которые подвергались умеренному ограничению калорийности. Девятинедельных самцов мышей C57BL / 6J кормили диетой с высоким содержанием жиров (60% калорий приходилось на жир; дополнительная таблица 1; дополнительные материалы доступны в Интернете вместе с этой статьей; doi: 10.1172 / JCI42845DS1), пока они не достигнут массы тела 40 граммов. Затем эти животные были подвергнуты ограничению калорийности (они получали 70% корма ad libitum), чтобы вызвать постепенную потерю веса. Мышей умерщвляли и собирали ткани через 0, 3, 7, 14, 21, 42 и 60 дней ограничения калорийности. Группа мышей соответствующего возраста, получавших постную пищу, была изучена в качестве контроля (дополнительный рисунок 1A). В начале ограничения калорийности все мыши, получавшие диету с высоким содержанием жиров, имели одинаковый состав тела, уровень глюкозы в крови натощак и концентрации инсулина в сыворотке (дополнительная таблица 2).Мы чередовали распределение мышей по разным группам ограничения калорийности, гарантируя, что средний возраст каждой умерщвленной группы существенно не отличался (дополнительный рисунок 2A). Как и ожидалось, этот протокол умеренного ограничения калорийности вызывал постепенное снижение веса и жировой массы без значительного влияния на мышечную массу (дополнительный рисунок 1, B и C и дополнительный рисунок 2B). Общая жировая масса, измеренная с помощью ЯМР-спектроскопии, заметно снизилась к 14 дню. Мыши продолжали терять вес на протяжении всего вмешательства, и в конце ограничения калорийности они потеряли 27.9% от исходной массы тела (40,8 ± 0,3 г против 29,4 ± 3,8 г; P <0,001). Все жировые отложения уменьшались в массе с одинаковой скоростью (дополнительный рисунок 1D), и уменьшение жировой массы было связано с уменьшением размера адипоцитов, а не с уменьшением количества адипоцитов (дополнительный рисунок 1, C – F). Уменьшение размера адипоцитов, как и ожидалось, сопровождалось снижением экспрессии гена лептина и концентрации лептина в сыворотке (дополнительные рисунки 3, A и B).

Во время набора веса и в поперечных исследованиях людей со стабильным весом наблюдается положительная, почти линейная зависимость между ожирением и маркерами местного и системного воспаления (13).После потери веса примерно на 17% у пациентов через 3 месяца после бариатрической операции содержание АТМ и воспаление жировой ткани уменьшаются, а чувствительность к инсулину улучшается (32, 33). Однако исследований связи между ожирением и показателями воспаления во время динамической потери веса было немного. Недавнее исследование Лангина и его коллег предполагает, что во время ранней потери веса у людей экспрессия воспалительных генов не снижается (34).

Чтобы обеспечить большее временное разрешение взаимосвязи между ожирением и метаболическими и воспалительными фенотипами во время похудания, мы измерили уровень глюкозы в крови натощак, сывороточный инсулин и экспрессию воспалительных генов в жировой ткани в нашей когорте мышей в течение 2 месяцев непрерывной потери веса.Концентрации глюкозы в крови натощак и сывороточного инсулина оставались повышенными в течение первой недели потери веса, но после этого значительно снизились, одновременно со снижением процента жира в организме (дополнительный рисунок 4). Напротив, снижение экспрессии воспалительных генов в перигонадной жировой ткани не было равномерным, и несколько классов генов были идентифицированы на основе их характера экспрессии во время потери веса. Экспрессия некоторых воспалительных генов, таких как Saa3 , снизилась на ранних этапах похудания, что предшествовало улучшению гомеостаза глюкозы, тогда как экспрессия других прототипных воспалительных генов M1, включая Tnf ( Tnfa ), оставалась повышенной в течение всего периода. когда животные находились в отрицательном энергетическом балансе (дополнительный рисунок 5).Циркулирующие воспалительные белки также подразделяются на несколько классов в ответ на отрицательный энергетический баланс, при этом концентрации некоторых воспалительных молекул, например резистина, рано падают во время потери веса и до улучшения метаболизма, в то время как концентрации других, например, PAI-1 оставался неизменным во время ограничения калорийности и потери веса (дополнительный рисунок 3, C и D).

В отличие от других классов генов, экспрессия в жировой ткани генов, специфичных для макрофагов / миелоидных клеток, Emr1 (F4 / 80), Cd68 и Csf1r увеличивалась после 3 дней ограничения калорийности (Рисунок A ).Однако к 60 дням потери веса экспрессия Emr1 и Cd68 снижалась до уровней ниже тех, которые присутствовали до начала потери веса. Позднее снижение экспрессии генов, специфичных для макрофагов, соответствовало предыдущим исследованиям, в которых изучались эффекты долгосрочной потери веса. Чтобы определить, было ли начальное увеличение и окончательное снижение экспрессии генов, специфичных для макрофагов / миелоидов, связано с изменениями экспрессии генов или с изменением количества макрофагов, мы провели иммуногистохимию с использованием антитела, которое распознает антиген макрофагов F4 / 80 (EMR1).В соответствии с исследованиями экспрессии генов, количество макрофагов в перигонадальной жировой ткани увеличивалось в течение первой недели потери веса. Через три дня после начала ограничения калорийности в перигонадальной жировой ткани было на 47% больше макрофагов, чем в жировой ткани контрольных мышей, получавших ad libitum (процент макрофагов на общее количество клеток: 38,6% ± 4,1% против 26,3% ± 7,4%; P <0,01; Рисунок, B и C). Мы и другие ранее показали, что существует сильная положительная корреляция между ожирением и содержанием банкоматов (2, 18).Однако при похудании эта связь теряется. Вместо этого в начальный период потери веса (дни 0–7 в нашем исследовании) у более стройных мышей обнаруживается больше банкоматов (рис. D), тогда как позже, во время похудания, обнаруживается более типичная положительная корреляция (рис. D). Идентичные отношения были обнаружены при построении графика зависимости содержания АТМ от размера адипоцитов (данные не показаны). Банкоматы, в частности банкоматы CD11c ⁺ и короноподобные структуры (CLS) CD11c ⁺ , наиболее тесно связаны с воспалением жировой ткани и системной инсулинорезистентностью.Почти все клетки CD11c ⁺ в перигонадальной жировой ткани мышей во время ранней потери веса также были F4 / 80 ⁺ (CD11c ⁺ ATM) (дополнительная фигура 6). Хотя общее количество банкоматов увеличивалось во время ранней потери веса, количество банкоматов CD11c ⁺ и CLS не увеличивалось (дополнительный рисунок 7), что соответствует накоплению популяции банкоматов CD11c ^— во время ранней потери веса и отсутствию увеличения маркеров воспаления или нарушения инсулинорезистентности в этот же период (дополнительные рисунки 4 и 5).

( A ) Экспрессия генов, кодирующих миелоидно-макрофагальные белки в перигонадальной жировой ткани. Черные столбцы представляют мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которым в течение различных интервалов времени подвергались ограничения в калориях. Белые столбики представляют контрольных худых мышей, которых кормили пищевой диетой (CD) и которые не подвергались ограничению калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в перигонадальных срезах жировой ткани мышей во время потери веса после указанного количества дней ограничения калорийности.Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( C ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани. n = 5–6 мышей / группа. ( D ) Взаимосвязь между содержанием макрофагов и массой тела у мышей в течение первых 7 дней потери веса (левая панель) и в течение 14-60 дней потери веса (правая панель). Показаны квадратные значения коэффициентов корреляции Пирсона. Каждая точка данных представляет собой% макрофагов в перигонадальной жировой ткани мышей при разном весе тела во время ограничения калорийности.( E ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в срезах подкожной жировой ткани. Масштабные линейки: 50 мкм. ( F ) Макрофаги в процентах от всех клеток подкожной жировой ткани мышей во время потери веса. n = 5–6 мышей / группа. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 по сравнению с днем ​​0.

Раннее первоначальное увеличение содержания ATM не было уникальным для перигонадальной жировой ткани.В соответствии с предыдущими данными у мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, в подкожной жировой ткани содержание ATM было ниже, чем в перигонадной жировой ткани (2, 32). Однако после 3 дней ограничения калорий содержание АТМ удвоилось в подкожных депо (макрофаги в процентах от всех клеток: 10,0 ± 3,1% против 20,2 ± 7,4%; P <0,05; рис. E и F) . Как в перигонадных, так и в подкожных депо количество АТМ постепенно уменьшалось после 3 дней отрицательного энергетического баланса, так что после 42 дней ограничения калорий содержание АТМ было значительно ниже, чем в жировой ткани мышей с высоким содержанием жира, которые никогда не ограничивались калорийностью ( Рисунок, B, C, E и F).

Было высказано предположение, что во время набора веса накопление АТМ вызвано некрозом адипоцитов, ремоделированием ткани или микрогипоксией. Первоначальное увеличение ATM в ответ на потерю веса не было связано со снижением количества адипоцитов, как можно было бы ожидать, если некроз адипоцитов приводил к накоплению ATM (дополнительный рисунок 1F). Также пик в ATM не совпал с активацией транскрипционной программы ремоделирования жировой ткани (дополнительный рисунок 8).

Показатели липолиза коррелируют с содержанием АТМ.

Первоначальное увеличение количества банкоматов было связано с изменениями концентрации циркулирующих FFA и показателей липолиза. Базальный липолиз в жировой ткани — это высвобождение FFA из адипоцитов, которое происходит при отсутствии отрицательного энергетического баланса. Базальный липолиз увеличивается в жировой ткани у лиц с ожирением и положительно коррелирует с размером адипоцитов (25). Липолиз по требованию — это гормонально и автономно управляемое высвобождение FFA из триглицеридов адипоцитов, которое активируется отрицательным энергетическим балансом, когда FFA мобилизуются из жировой ткани для системного использования в качестве субстратов (25).Модель, в которой липолиз регулирует накопление АТМ, согласуется с предыдущими наблюдениями за людьми со стабильным весом или набором веса: у тучных мышей с большими адипоцитами наблюдается более высокий базальный липолиз жировой ткани и большее содержание АТМ, чем у тощих животных. Во время ранней потери веса, когда размер адипоцитов существенно не изменился, базальный липолиз остается высоким, а потребность в липолизе увеличивается, и, таким образом, мы прогнозируем чистое увеличение общего липолиза. Но по мере уменьшения массы жировой ткани и размера адипоцитов также уменьшается базальный липолиз и уменьшается чистый отток липидов из жировой ткани.Концентрации FFA в сыворотке коррелируют с общей скоростью липолиза и потоками жирных кислот в жировой ткани (25, 35). Следовательно, если липолиз действительно играет роль в накоплении ATM, мы предсказали, что FFA в сыворотке будет коррелировать с содержанием ATM у наших мышей с ограничением калорийности. Действительно, сывороточные концентрации FFA были выше на 3-й день ограничения калорий, до значительной потери веса, и совпадали с пиком содержания макрофагов (Рисунок A). В соответствии с нашей гипотезой существовала положительная корреляция между концентрацией FFA в сыворотке и процентом ATM в перигонадной жировой ткани на протяжении всего периода ограничения калорийности (Рисунок B).

( A ) Концентрации FFA в сыворотке во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. Черные столбцы представляют мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которым в течение различных интервалов времени подвергались ограничения в калориях. Белая полоса представляет контрольных худых мышей, которых кормили кормовой диетой и которые не подвергались ограничению калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Корреляция содержания макрофагов (% макрофагов) и концентрации FFA в сыворотке у мышей во время потери веса; показано квадратное значение коэффициента корреляции Пирсона. n = 5–6 мышей / группа. Каждая точка данных представляет собой% макрофагов в перигонадальной жировой ткани мыши при различных концентрациях FFA в сыворотке. ( C ) Экспрессия в перигонадной жировой ткани гена, кодирующего липазу ATGL, у мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. n = 5–6 мышей / группа. ( D ) Высвобождение FFA из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, инкубированных в базовых условиях. Эксплантаты были изолированы от мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или которые подвергались ограничению калорийности в течение 3 или 42 дней.( E ) Высвобождение глицерина из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, инкубированных в базовых условиях. Эксплантаты были изолированы от мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или которые подвергались ограничению калорийности в течение 3 или 42 дней. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05 по сравнению с днем ​​0.

В жировой ткани лимитирующая стадия как базального липолиза, так и липолиза по потребности регулируется ферментом, кодируемым Atgl / Pnpla2 . Экспрессия Atgl / Pnpla2 регулируется нутриционным статусом и тесно коррелирует со скоростью липолиза жировой ткани (36).В соответствии с пиком липолиза жировой ткани на 3-й день ограничения калорийности экспрессия Atgl / Pnpla2 в жировой ткани увеличивалась на 3-й день ограничения калорийности и возвращалась к исходному уровню на 42-й день (Рисунок C). Напротив, экспрессия гормоночувствительной липазы, кодируемой Hsl / Lipe , не коррелирует со статусом питания. Уровни мРНК Hsl / Lipe подавляются во время острого голодания и повышаются только после длительного голодания (36).В соответствии с этими данными, мы не наблюдали никаких изменений в уровнях Hsl / Lipe во время ограничения калорийности (дополнительный рисунок 9A).

Циркулирующие концентрации FFA и экспрессия Atgl / Pnpla2 обеспечивали косвенные измерения липолиза жировой ткани. Для прямого измерения липолиза в жировой ткани во время ограничения калорийности скорости высвобождения неэтерифицированных FFA и глицерина измеряли в перигонадальной жировой ткани мышей во время ограничения калорийности.В соответствии с нашими косвенными измерениями, липолиз увеличивался в жировой ткани мышей после 3 дней ограничения калорий по сравнению с жировой тканью мышей, получавших ad libitum (рисунок, D и E). Высвобождение FFA и глицерина снизилось через 42 дня. Эти данные демонстрируют положительную корреляцию между липолизом жировой ткани и содержанием АТМ. Чтобы напрямую определить, влияет ли увеличение или уменьшение липолиза на накопление АТМ, мы провели ряд диетических, фармакологических и генетических манипуляций.

Липолиз вызывает накопление АТМ.

Если липолиз вызывает накопление АТМ в жировой ткани, то голодание, которое быстро увеличивает гидролиз триглицеридов жировой тканью, также должно увеличивать содержание АТМ. Перигонадную жировую ткань собирали у мышей C57BL / 6J с ожирением, получавших пищу с высоким содержанием жира, которые либо не голодали в течение 24 часов, либо кормились ad libitum. Голодание вызывало увеличение концентрации FFA в сыворотке (рис. A) и приводило к быстрому накоплению ATM. По сравнению с жировой тканью мышей, получавших ad libitum, жировая ткань голодных мышей содержала на 65% больше ATM (процент макрофагов на общее количество клеток: 22.9% ± 6% против 37,9% ± 3,5%; P <0,01; Рисунок, Б – Г). Накопление ATM, вызванное голоданием, не ограничивалось тучными мышами. У худых мышей экспрессия генов, специфичных для макрофагов, Emr1 и Csf1r , увеличивалась в 3 и 4 раза соответственно после 24-часового голодания (Рисунок E). В соответствии с нашими наблюдениями, что ограничение калорийности не вызывает накопление ATM CD11c ⁺ , экспрессия Itgax ( Cd11c ) не изменяется при голодании (Рисунок E).

( A ) Концентрации FFA в сыворотке у мышей с ожирением ad libitum, получавших пищу ad libitum и голодавших 24 часа в сутки, вызванных диетой с высоким содержанием жиров. n = 5–6 мышей / группа. ** P <0,01, по сравнению с кормлением ad libitum (кормление Ad lib). ( B и C ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1) в перигонадальных срезах жировой ткани от мышей с ожирением, индуцированного диетой с высоким содержанием жиров, получавших ad libitum ( B ) и мышей, голодавших 24 часа (). С ).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( D ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадной жировой ткани от мышей с ожирением ad libitum, получавших пищу ad libitum и голодавших 24 часа в сутки, вызванного диетой с высоким содержанием жиров. n = 5–6 мышей / группа. ** P <0,01 по сравнению с кормлением ad libitum. ( E ) Экспрессия генов, кодирующих белки, специфичные для миелоидных макрофагов, у мышей, получавших постное питание ad libitum и голодавших 24 часа в сутки. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05 по сравнению с кормлением ad libitum.( F ) Протокол фармакологически индуцированного липолиза адипоцитов с помощью β3-адренергического агониста (CL316,243) у худых мышей. ( G — I ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1) в перигонадальных срезах жировой ткани от тощих мышей, получавших носитель ( G ) или CL316,243 ( H и I ) ). Многоядерные гигантские клетки, содержащие липидные капли, видны на некоторых участках ( I ). Стрелки указывают банкоматы.Масштабные линейки: 50 мкм. ( J ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани от мышей, обработанных носителем и CL316,243. n = 5 мышей / группа. *** P <0,001, по сравнению с носителем. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Активация β3-адренергического рецептора ( Adrb3 ), который у мышей почти исключительно экспрессируется адипоцитами, увеличивает липолиз адипоцитов. Граннеман и его коллеги ранее отмечали, что β3-адренергическая стимуляция приводит к накоплению миелоидных клеток в жировой ткани (37).Чтобы определить, будет ли фармакологическая активация липолиза увеличивать накопление ATM, мы дважды вводили мышам C57BL / 6J (масса тела = 24,5 ± 0,8 г) β3-адренергический агонист CL316,243 с интервалом в 4 часа. Депо жировой ткани собирали через 14 часов после последней инъекции (Рисунок F). По сравнению с контрольными мышами, фармакологическая индукция липолиза быстро увеличивала содержание ATM в перигонадальной жировой ткани более чем в 5 раз, до уровней, типичных для мышей с ожирением (рисунок, G – J).Макрофаги были видны как изолированно, так и в скоплениях (Рисунок, G – I). Таким образом, среди гормональных сигналов, активируемых голоданием, β3-адренергическая индукция липолиза адипоцитов достаточна для индукции быстрого рекрутирования макрофагов. Подобно нашим наблюдениям при ранней потере веса и голодании, рекрутированные β3-адренергические рецепторы макрофаги не увеличивают воспалительный фенотип жировой ткани (дополнительный рисунок 9E)

Уменьшение липолиза во время похудания или голодания снижает накопление АТМ.

Если наша гипотеза верна, то манипуляции, ингибирующие липолиз во время раннего похудания или голодания, должны уменьшить или предотвратить накопление АТМ. Хотя диета с высоким содержанием жиров увеличивает количество пищевых липидов, они также являются кетогенными при отрицательном энергетическом балансе. По сравнению с диетами с высоким содержанием жиров при отрицательном энергетическом балансе, диеты с высоким содержанием углеводов увеличивают соотношение циркулирующего инсулина / глюкагона и снижают мобилизацию липидов и скорость липолиза в жировой ткани (38). Поэтому мы повторили интервенцию по ограничению калорийности, добавив группу мышей соответствующего веса, которые были ограничены в калориях на изокалорийной высокоуглеводной диете (дополнительная таблица 1).Мышей поддерживали ограничение калорийности в течение 3 дней, и мышей в обеих группах в равной степени ограничивали (на 30% меньше калорий, чем их потребление ad libitum). В конце ограничения калорийности не было никакой разницы в весе между группами с ограничением калорийности диеты с высоким и высоким содержанием углеводов. Однако, как и ожидалось, концентрация FFA в сыворотке мышей с ограничением калорийности рациона с высоким содержанием углеводов была на 36% ниже, чем у мышей с ограничением калорийности рациона с высоким содержанием жиров (0,38 ± 0,11 против 0.59 ± 0,07 ммоль / л; P <0,05) (Рисунок A). В соответствии с нашей гипотезой, во время потери веса содержание ATM было на 35% ниже (31,1% ± 4,1% против 20,1% ± 5,2%; P <0,05) в перигонадальной жировой ткани у мышей, получавших высокоуглеводную диету, по сравнению с таковыми. питались диетой с высоким содержанием жиров (Рисунок, B и C).

Протокол ограничения калорийности использовался, чтобы вызвать потерю веса с более низкой скоростью липолиза по сравнению с ограничением калорийности мышей на диете с высоким содержанием жиров.Мышей с ожирением, вызванным высокожировой диетой, кормили 70% от их калорийности ad libitum в течение 3 дней в виде диеты с высоким содержанием углеводов или жиров. ( A ) Сыворотка FFA у мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности диеты с высоким содержанием жиров или углеводов. n = 5–6 мышей / группа. ( B ) Срезы перигонадной жировой ткани мышей во время потери веса, вызванной диетой с высоким содержанием жиров (левая панель) или высоким содержанием углеводов (правая панель).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 50 мкм. ( C ) Макрофаги в процентах от всех клеток в перигонадальной жировой ткани мышей во время потери веса, вызванной ограничением калорийности диеты с высоким содержанием жиров или углеводов. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05, по сравнению с ограничением калорийности HFD. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Жировая триглицерид липаза (также известная как деснутрин или протеин 2, содержащий пататин-подобный домен фосфолипазы) ( Atgl / Pnpla2 ) регулирует как базальный, так и необходимый липолиз в жировой ткани.Животные с дефицитом ATGL / PNPLA2 серьезно нарушены в их способности мобилизовать FFA, имеют очень низкий базальный липолиз и неспособны повышать потребность в липолизе в ответ на голодание, несмотря на сохранность гормонального и вегетативного ответа на голодание (36). Чтобы предоставить генетические доказательства того, что липолиз является критическим детерминантом содержания ATM, мы изучили эффекты голодания на мышах Atgl / Pnpla2 ^{— / —} . В соответствии с нашей гипотезой, мы обнаружили, что ad libitum — кормил Atgl / Pnpla2 ^{— / —} мышей имеет менее 3% банкоматов и что после голодания не было увеличения количества банкоматов (рисунок, A и B). или экспрессия генов, специфичных для макрофагов (рис. C).Эти данные свидетельствуют о том, что липаза ATGL / PNPLA2 необходима для рекрутирования и накопления ATM в жировой ткани.

( A ) Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов, экспрессирующих F4 / 80 (EMR1), в перигонадальных срезах жировой ткани из Atgl ^{+ / +} (верхняя панель) и Atgl ^{— / —} (нижняя панель) мышей, которых кормили ad libitum (слева) или голодали (справа).Стрелки указывают банкоматы. Масштабные линейки: 100 мкм. ( B ) Макрофаги в процентах от всех клеток у мышей Atgl ^{+ / +} , получавших постное питание ad libitum, и мышей Atgl ^{— / —} , получавших голодное питание. n = 4–5 мышей / группа. *** P <0,001 по сравнению с кормлением ad libitum. ( C ) Экспрессия генов, специфичных для макрофагов, в перигонадальной жировой ткани мышей Atgl ^{— / —} , получавших без ограничений и голодавших без пищи. n = 4–5 мышей / группа. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Липолиз жировой ткани вызывает миграцию макрофагов.

Скорость митоза в жировой ткани голодных мышей была очень низкой (<2%) и не отличалась от скорости митоза в жировой ткани у мышей, получавших ad libitum (дополнительные рисунки 9, B и C), что позволяет предположить, что липолиз -зависимое увеличение ATM было не из-за пролиферации, а следствием рекрутирования миелоидных клеток. Чтобы определить, увеличивает ли липолиз высвобождение хемоаттрактантов жировой ткани для макрофагов, мы выполнили анализ миграции с эксплантатами жировой ткани от голодных и получающих неограниченное питание мышей.Эксплантаты перигонадной жировой ткани собирали у тощих мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали в базовых условиях или с добавлением изопротеренола для индукции липолиза. Как и ожидалось, по сравнению с жировой тканью, выделенной от мышей, получавших ad libitum, жировая ткань от голодных мышей или жировая ткань, обработанная изопротеренолом, увеличивала липолиз, о чем свидетельствует увеличение высвобождения FFA (Рисунок A). При таком увеличении липолиза пропорционально увеличивалась хемотаксическая активность жировой ткани по отношению к макрофагам, происходящим из костного мозга (BMDM).Это увеличение активности хемоаттрактанта жировой ткани было сопоставимо с таковым, индуцированным MCP-1 / CCL2 (Рисунок B). Мы также обнаружили, что в отличие от голодных мышей дикого типа, голодные CCR2-дефицитные мыши не увеличивали экспрессию генов, специфичных для макрофагов (дополнительная фигура 9D). Однако не наблюдалось увеличения экспрессии в жировой ткани известных лигандов CCR2 во время голодания (данные не показаны). Эти данные согласуются с набором банкоматов во время быстрого многоступенчатого процесса, в котором накопление предшественников ATM в кровотоке зависит от CCR2, но для перехода в депо жира действительно требуется CCR2 или его лиганд.

Эксплантаты перигонадальной жировой ткани выделяли от тощих мышей, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от голодных животных инкубировали в базовых условиях, тогда как эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) или без нее. ( A ) Концентрацию FFA измеряли в среде, кондиционированной эксплантатом. ( B ) Хемотаксическую активность контрольной среды, среды с добавлением MCP-1 / CCL2 (50 нг / мл) и среды, кондиционированной эксплантатом, измеряли с использованием стандартного анализа миграции для BMDM.Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 4, 5–8 повторов на образец. * P <0,05; ** P <0,01.

Снижение веса и липолиз активируют программу поглощения липидов банкоматами.

Основная функция макрофагов — фагоцитоз тканеспецифических продуктов таким образом, чтобы поддерживать гомеостаз ткани. Например, в кости, остеокласте (многоядерный макрофаг кости) резорбция матрикса необходима для поддержания здоровья кости (39).По аналогии, накопление ATM в периоды повышенного липолиза может способствовать поглощению или фагоцитозу избыточных местных липидов и участвовать в обмене липидов в жировой ткани. Действительно, отличительной особенностью АТМ при ожирении является накопление внутриклеточных липидов (19, 29). В жировой ткани людей с ожирением есть банкоматы с множеством липидных капель и другие, которые образуют многоядерные гигантские клетки, содержащие большие одноглазные капли. В соответствии с основной функцией АТМ, заключающейся в поглощении липидов в периоды повышенного высвобождения FFA из адипоцитов, экспрессия в жировой ткани 2 рецепторов транспорта липидов макрофагов, Cd36 и Msr1 , увеличивается в начальный период веса. потеря (рисунок А).К 42 дню ограничения калорийности, когда липолиз жировой ткани снижается, экспрессия этих 2 генов возвращается к уровням, наблюдаемым у мышей, никогда не снижавших веса. Чтобы определить, действительно ли липолиз вызывает накопление липидов в банкоматах, мы исследовали содержание липидных капель в макрофагсодержащих стромальных сосудистых клетках (SVC) после 24-часового голодания. Голодание резко индуцировало образование липидных капель в банкоматах и ​​увеличивало количество липидсодержащих пузырьков на 39% в банкоматах, выделенных натощак, по сравнению с ATM, полученными от тучных мышей C57BL / 6J, получавших ad libitum (17.3 ± 3 против 24,1 ± 4,7 липидных везикул на клетку; P <0,001; Рисунок, Б и В). Голодание также увеличивало экспрессию генов, участвующих в захвате, хранении липидов ( Adfp , aP2 , Cd36 ) и экспорте ( Abca1 и ApoE ) в стромальной сосудистой фракции жировой ткани (Рисунок D). .

( A ) Экспрессию в жировой ткани генов, продукты которых, CD36 (Cd36) и рецептор скавенджера A (Msr1), участвуют в захвате липидов макрофагами, измеряли в перигонадальной жировой ткани во время потери веса, вызванной ограничением калорийности. n = 5–6 мышей / группа. * P <0,05; *** P <0,001, по сравнению с нулевым днем ​​( B ) Стромальные сосудистые клетки (SVC), выделенные из перигонадальной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum (левая панель) или голодали. в течение 24 часов (правая панель) окрашивали на нейтральный липид масляным красным О. Масштабные полосы: 50 мкм. ( C ) Количество липидных капель в макрофагах из перигонадной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным высоким содержанием жиров, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. n = 5 мышей / группа. *** P <0,001. ( D ) Экспрессия генов (в стромальной сосудистой фракции), кодирующих белки, участвующие в захвате, утилизации и экспорте липидов. n = 5 мышей / группа. * P <0,05. Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Чтобы более точно определить, поглощают ли АТМ липиды в ответ на липолиз как таковой, мы создали систему in vitro для оценки эффектов стимулированного адренергическим действием липолиза адипоцитов на функцию АТМ.Мы совместно культивировали SVC, которые включают макрофаги с жировой тканью от тощих мышей C57BL / 6J в присутствии адренергического стимула (изопротеренол). В отсутствие жировой ткани лечение изопротеренолом не влияло на экспрессию гена SVC или накопление липидов (фигура, A и C, и дополнительная фигура 10A). Однако в присутствии жировой ткани изопротеренол индуцировал экспрессию гена Adfp , который кодирует белок липидных капель, покрывающий липидные капли в банкоматах (19).Кроме того, экспрессия Cd36 увеличилась ( P = 0,09) (Рисунок A). Не было активации программы дифференцировки адипоцитов, то есть не было увеличения экспрессии адипонектина или лептина и снижения экспрессии Pparg (дополнительная фигура 10B). Кроме того, совместное культивирование с жировой тканью и, в большей степени, с добавлением стимуляции изопротеренолом, индуцировало экспрессию гена Ccr2 во фракции SVC, потенциально отражая активацию программы хемотаксических макрофагов (Рисунок B).Гистологически индукция липолиза привела к накоплению липидов в SVC (Рисунок, C и D) и увеличила появление многоядерных нагруженных липидами макрофагов, которые обычно наблюдаются в жировой ткани у людей с ожирением (Рисунок E).

( A ) SVC, выделенные из перигонадальной жировой ткани мышей с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, культивировали либо отдельно, либо с кусочками перигонадальной жировой ткани (полученными от тощих животных) с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) или без нее для индукции липолиза. во фракции жировой ткани.Измеряли экспрессию генов Adfp и Cd36 в SVC. n = 5 мышей / группа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. ( B ) Экспрессию хемокинового рецептора Ccr2 измеряли в SVC, обработанных, как описано в A . Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 5 мышей / группа. ( C ) SVC, обработанные изопротеренолом, культивированные отдельно (левая панель) или с жировой тканью (правая панель), окрашивали на нейтральный липид масляным красным О. Липидсодержащие клетки отмечены стрелками.Масштабные линейки: 50 мкм. ( D ) Процент липидсодержащих клеток среди SVC, обработанных, как описано в A . n = 5 мышей / группа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; ^† P = 0,09. ( E ) Присутствие насыщенных липидами многоядерных гигантских клеток среди SVC, сокультивированных с жировой тканью в присутствии изопротеренола. Масштабная линейка: 15 мкм.

Истощение макрофагов увеличивает липолиз жировой ткани.

Привлечение ATM и поглощение липидов во время периодов липолиза привело нас к гипотезе о том, что ATM играют роль в регулировании локальных концентраций FFA. Чтобы определить, влияют ли ATM на липолиз или высвобождение липидов, мы удалили ATM из жировой ткани, которая содержала высокую концентрацию макрофагов. Эксплантаты эпидидимальной жировой ткани собирали у мышей с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, которые голодали в течение 24 часов. Эксплантаты обрабатывали инкапсулированным в липосомы клодронатом для истощения ATM, а контрольные эксплантаты от тех же животных обрабатывали инкапсулированным в липосомы PBS.Клодронат представляет собой бифосфонат, который вызывает апоптоз макрофагов при фагоцитозе в липосомах. Как и ожидалось, обработка клодронатом снижала примерно на 80% содержание макрофагов, что измерялось по экспрессии маркера макрофагов Emr1 и экспрессируемого макрофагами рецептора скавенджера Msr1 . Истощение макрофагов увеличивает экспрессию липазы Atgl / Pnpla2 в 2,5 раза и увеличивает экспрессию регулируемых жирными кислотами генов Fabp4 / aP2 , Acadl и Dgat1 .Индукция липазы и генов, необходимых для метаболизма жирных кислот, предполагает, что истощение макрофагов увеличивает липолиз и субстраты FFA. Действительно, по сравнению с обработанными контрольными эксплантами жировой ткани, истощенные макрофагами эксплантаты имели на 27% более высокую скорость липолиза, измеренную по высвобождению глицерина. Чтобы оценить, может ли истощение макрофагов иметь аналогичный эффект на метаболизм FFA in vivo, мы внутрибрюшинно вводили худым мышам C57BL / 6J клодронат, инкапсулированный в липосомы, чтобы истощить ATM из депо внутрибрюшной жировой ткани, а затем голодали их в течение 24 часов.Обработка клодронатом по сравнению с контрольной обработкой (инкапсулированный в липосомы PBS) снижала экспрессию генов, специфичных для макрофагов, более чем на 90% (дополнительная фигура 10C). Интраабдоминальное истощение АТМ увеличивало сыворотку натощак (FFA) на 69% по сравнению с контрольными мышами, которым инъецировали липосомы (Рисунок C). Эти данные предоставляют предварительные доказательства того, что функция макрофагов частично ослабляет вызванное липолизом высвобождение FFA.

Затем эксплантаты обрабатывали либо инкапсулированным в липосомы клодронатом, либо инкапсулированным в липосомы PBS. Эксплантаты от одних и тех же мышей обрабатывали в обоих экспериментальных условиях. ( A ) Экспрессия генов, специфичных для макрофагов, и генов, участвующих в метаболизме липидов в эксплантах. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 4 мыши / группа. ( B ) Высвобождение глицерина из эксплантатов перигонадальной жировой ткани, обработанных либо инкапсулированным в липосомы клодронатом, либо инкапсулированным в липосомы PBS.Клодронат, инкапсулированный в липосомы, вводили внутрибрюшинно худым мышам C57BL / 6J. Мышей не кормили в течение 24 часов, начиная с 3 дня после инъекции, и истощение макрофагов в перигонадной жировой ткани было подтверждено в конце периода голодания (день 4). Инкапсулированный в липосомы PBS также вводили в качестве контроля. ( C ) Концентрация FFA в сыворотке у мышей, получавших клодронат или PBS, после 24-часового голодания. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. n = 8 мышей / группа. * P <0.05; ** P <0,01 по сравнению с обработкой PBS.

Обсуждение

Ожирение порождает сложный иммунный ответ, характерным признаком которого является накопление макрофагов в жировой ткани. Факторы, которые регулируют накопление ATM, четко не определены, и действительно, эффекты других метаболических нарушений на накопление и функцию ATM в значительной степени не исследованы. В других условиях рекрутирование предшественников миелоидных макрофагов происходит в ответ на нарушение функции ткани, обычно в ответ на повреждение или чужеродный патоген, но также в ответ на нарушения липидных потоков (40).Например, в стенке артерии локальный избыток холестерина и липопротеинов через двухэтапный процесс рекрутирования и захвата липидов приводит к накоплению нагруженных липидами макрофагов (пенистых клеток) (41). Заполненные липидами макрофаги также являются характерной находкой в ​​жировой ткани людей с ожирением (19, 29). Поэтому мы предположили, что повышенный поток липидов может также регулировать накопление ATM в депо жировой ткани. Здесь мы показали, что накопление макрофагов в жировой ткани является острой реакцией на потерю веса и регулируется липолизом жировой ткани.Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями липолиза при ожирении. Общий базальный липолиз хронически повышен в жировой ткани у людей с ожирением по сравнению с жировой тканью у худых людей (25) и в интраабдоминальном по сравнению с подкожной жировой тканью (30, 31). Именно в этих условиях и в депо, в которых липолиз выше, содержание АТМ также повышается (2, 5, 18, 33).

Роль банкоматов в развитии воспаления жировой ткани, вызванного ожирением, и связанных с ним патологических последствий, включая инсулинорезистентность, интенсивно изучается.Наши данные о том, что ATM быстро увеличивают захват липидов в ответ на липолиз адипоцитов, предполагают, что ATM могут выполнять адаптивную функцию, по крайней мере, в течение коротких периодов времени, поглощая избыток FFA (рисунок). Подобный процесс лежит в основе развития атером, когда повышенные концентрации холестерина в стенках сосудов приводят к привлечению предшественников макрофагов в субэндотелиальные пространства. Эффективный захват и клиренс липидов из сосудистой сети является адаптивным, пока макрофагальный клиренс холестерина не нарушен.Однако при развитии атером накопление холестерина опережает способность макрофагов очищать липиды; макрофаги поглощают холестерин, но не мигрируют из своего анатомического местоположения. Таким образом, нагруженные холестерином макрофаги со временем образуют пенистые клетки, которые остаются в стенке сосуда и становятся центральным патогенным компонентом атеросклеротических поражений (41). Во время похудания как повышение липолиза, так и увеличение АТМ являются временными. Это говорит о том, что ATM участвуют в поглощении избыточного липида и его выходе из ткани.Однако при ожирении хроническое повышение липолиза и местных концентраций FFA обеспечивает постоянный сигнал для накопления макрофагов. Со временем фенотип АТМ при ожирении, в отличие от того, что наблюдается при потере веса, изменяется так, что популяция CD11c ⁺ , которая описывается как более воспалительная, преобладает и приводит к нарушению местного метаболизма.

Активация липолиза во время ранней потери веса и голодания увеличивает локальное высвобождение FFA (а также глицерина и других побочных продуктов липолиза), вызывая рекрутмент ATM.Однажды задействованные, ATMs фагоцитируют избыток липидов и потенциально секретируют антилиполитические факторы, которые вместе снижают локальные концентрации FFA.

Чтобы понять функции банкоматов, было предпринято множество попыток описать производство воспалительных молекул в банкоматах. Однако, как «профессиональные» фагоциты, макрофаги также эффективны в поглощении замечательного набора молекул, от небольших липидов и колоний патогенов до умирающих и мертвых клеток (42). Присутствие липидных капель в банкоматах, в том числе крупных однокамерных капель в многоядерных гигантских клетках, показало некоторым, что ATM в первую очередь функционируют для фагоцитоза некротических адипоцитов (19).Быстрое появление липидных капель в банкоматах во время голодания, даже у худых животных, предполагает, что привлечение макрофагов к жировой ткани, по крайней мере, во время отрицательного энергетического баланса, является частью скоординированного ответа, который может снизить локальные внеклеточные концентрации FFA.

Было обнаружено, что FFA и другие липиды регулируют состояние активации и иммунную функцию миелоидных клеток и макрофагов. В качестве внеклеточных сигналов жирные кислоты, особенно насыщенные жирные кислоты, активируют классические воспалительные реакции в макрофагах и других иммунных клетках посредством задействования рецепторов распознавания образов, включая TLR (43–45).Наши результаты показывают, что липолиз и повышенные концентрации FFA могут также регулировать накопление макрофагов и делать это без активации провоспалительного или M1-поляризованного состояния. Увеличение количества макрофагов более чем на 40% во время начальной фазы потери веса происходит без увеличения экспрессии воспалительных генов или концентрации циркулирующих адипокинов и поддерживает модель, в которой липиды, помимо их участия в активации ATM, играют важную и особую роль в ATM. набор персонала.

Накопление банкоматов в жировой ткани — это только часть иммунного ответа на ожирение. Т-клетки также рекрутируются в жировую ткань во время развития ожирения (1, 7–9, 11). Если Т-клетки играют роль в жировой ткани, сравнимую с той, что играет в атеромах, субпопуляции Т-клеток могут регулировать набор и функцию ATM и других миелоидных клеток. Сложность иммунного ответа жировой ткани на метаболические нарушения дополнительно увеличивается из-за неоднородности популяций АТМ.Два крупнейших класса ATM можно выделить на основе экспрессии антигенов F4 / 80, CD11b и CD11c; одна популяция экспрессирует все 3 антигена (клетки FBC), а вторая — только F4 / 80 и CD11b (клетки FB) (46, 47). Представленные здесь данные свидетельствуют о том, что в основном клетки FB накапливаются во время отрицательного энергетического баланса. Это контрастирует с развитием ожирения, когда преобладают клетки FBC, и может объяснить, почему накопление ATM во время ранней потери веса не сопровождается увеличением воспаления жировой ткани и резистентности к инсулину.Онтогенез, функции и, в частности, метаболизм свободных жирных кислот и других липидов отдельных субпопуляционных АТМ еще предстоит определить и, вероятно, предоставят механистическое понимание различий в иммунном ответе на ожирение и потерю веса.

Наши результаты подтверждают модель, в которой липолиз жировой ткани способствует привлечению ATM и захвату липидов (рисунок). Эти данные предполагают, что ATM могут играть роль в сдерживании внеклеточного увеличения концентраций FFA в периоды высокого липолиза и, таким образом, могут защищать локальную функцию адипоцитов.В худом состоянии адипоциты накапливают мало липидов, базальный липолиз ограничен, а банкоматов мало. Когда липолиз активируется и концентрации FFA резко увеличиваются, макрофаги быстро накапливаются в жировой ткани без значительного начального увеличения воспаления. После набора, ATMs фагоцитируют избыток липидов, возможно, снижая стресс адипоцитов. Во время потери веса увеличение потребности в липолизе увеличивает локальную концентрацию FFA и, таким образом, рекрутмент ATM. Однако постепенно, по мере уменьшения запасов триглицеридов и снижения базального липолиза, содержание АТМ снижается.При ожирении избыточное накопление липидов большими адипоцитами увеличивает базальный липолиз и, таким образом, чистое высвобождение FFA. Макрофаги привлекаются к жировой ткани, но в отличие от потери веса, при которой липолиз в конечном итоге уменьшается, хроническая стимуляция банкоматов приводит к локальному воспалению и изменению метаболической функции.

Методы

Мыши и протокол потери веса.

Самцов мышей C57BL / 6J были получены из лаборатории Джексона в возрасте 9 недель и размещены индивидуально в вентилируемых клетках из оргстекла в пределах барьера, свободного от патогенов, который поддерживает цикл 12 часов света / 12 часов темноты.Мышей кормили диетой с высоким содержанием жиров (D12492; Research Diets Inc.) (подробности о составе рациона см. В дополнительной таблице 1). Пищевые гранулы помещали на кормушки (Wenzel) для повышения точности измерений потребления пищи. Потребление пищи измеряли ежедневно для каждой мыши индивидуально в течение 1 месяца до начала ограничения калорийности. Ограничение калорийности начинали, когда мышей весили 40–41 г. Мы изменили распределение мышей по разным группам с ограничением калорий, чтобы возраст каждой группы существенно не отличался при умерщвлении (дополнительный рисунок 2).Во время ограничения калорийности каждая мышь получала 70% от своего потребления ad libitum (среднее потребление пищи 70% / средний вес). Контрольная постная группа получала стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc.). Для эксперимента по ограничению калорийности высокоуглеводной диеты мышей переводили на D12450B (Research Diets Inc.) (см. Дополнительную таблицу 1 для получения подробной информации о составе диеты). Потребление пищи корректировали ежедневно в зависимости от веса мыши. Мышей кормили в начале цикла темноты и света (они получали две трети пищи в темноте и одну треть во время светового цикла.Измерения состава тела проводились с помощью анализатора ЯМР miniSpec TD (Bruker). Образцы крови для измерения исходного уровня инсулина были получены при поднижнечелюстном кровотечении. Уровень глюкозы в крови измеряли с помощью глюкометра FLASH FreeStyle (Abbott). Мышей умерщвляли асфиксией CO ₂ и смещением шейного отдела после 4-часового голодания в течение пятого и шестого часов светового цикла. Образцы сыворотки для окончательных измерений инсулина, свободных жирных кислот и цитокинов собирали путем сердечной пункции.Подкожную брюшную, эпидидимальную, периренальную и брыжеечную жировые ткани иссекали, и правые депо жировой ткани и все брыжеечные депо взвешивали для каждого животного. Образцы тканей замораживали в жидком азоте и хранили при –80 ° C перед экстракцией РНК и иммуногистохимическим анализом. Эксперимент проводился в 2 отдельных случаях ( n = 40 на эксперимент). Все эксперименты на животных были одобрены IACUC Колумбийского университета.

Голодные эксперименты.

Постных мышей C57BL / 6J (возраст от 8 до 9 недель), получавших стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc.), не кормили в течение 24 часов, начиная со второго часа светового цикла. В качестве контроля использовали мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum по весу и возрасту. Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

Для экспериментов натощак на мышах с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, использовали мышей в возрасте от 24 до 28 недель. Мышей помещали на диету с высоким содержанием жиров (D12492 / Research Diets Inc.) начиная с 6-недельного возраста. Они прошли 24-часовое голодание, начиная со второго часа светового цикла.

Пять 8-недельных мышей Ccr2 ^{— / —} и пять 8-недельных Ccr2 ^{+ / +} мышей (однопометников), получавших стандартную гранулированную диету (PicoLab Rodent Diet 20; Purina Mills Inc. ) голодали в течение 24 часов, начиная со второго часа светового цикла. Пять одинаковых по весу и возрасту мышей Ccr2 ^{— / —} и 5 Ccr2 ^{+ / +} (однопометники) использовали в качестве контроля.Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

CL316,243 для лечения мышей.

Десять 8-недельных мышей C57BL / 6J, получавших стандартную гранулированную диету (см. Выше), вводили внутрибрюшинно 1 мг / кг CL316,243 или физиологического раствора дважды (4 часа между каждой инъекцией). Мышей умерщвляли через 14 часов после второй инъекции. Перигонадную жировую ткань иссекали и образцы хранили, как описано выше.

Обработка мышей BrdU.

Десять 8-недельных мышей C57BL / 6J, получавших стандартную гранулированную диету (см. Выше), вводили внутрибрюшинно 0,133 мг / г BrdU (Sigma-Aldrich) или носитель дважды (3 часа между каждой инъекцией). Через 1,5 часа после первой инъекции мы убрали еду из опытной группы. Контрольную группу кормили без ограничений. Обе группы были принесены в жертву 24 часа спустя. Перигонадную жировую ткань иссекали, и образцы хранили, как описано выше.

Мыши Atgl

Образцы перигонадальной жировой ткани от Atgl ^{+ / +} и Atgl ^{— / —} мышей были собраны у худых мышей в возрасте 8–9 недель, которых кормили ad libitum или голодали в течение 16 часов.

Метаболические анализы.

Уровни инсулина в сыворотке определяли с помощью сверхчувствительного инсулинового ELISA (Mercodia Inc.). PAI-1 и резистин в сыворотке измеряли с использованием панели мышиного адипокина LINCOplex (Millipore). Уровень лептина в сыворотке измеряли с использованием количественного анализа лептина мыши ELISA (системы R&D).FFA измеряли с использованием серии HR NEFA (Wako Diagnostics). Образцы крови для выделения сыворотки собирали после 4-часового голодания в течение пятого и шестого часов светового цикла. Образцы сыворотки, собранные, представленные на рисунке A, также были проанализированы на несколько гормонов и цитокинов и поэтому были помещены на влажный лед перед дальнейшей обработкой. Образцы сыворотки, представленные на рисунке A и рисунке A, использовались только для анализа FFA и были немедленно заморожены в жидком азоте перед анализом (для минимизации липолиза триглицеридов).

Иммуногистохимия.

Образцы жировой ткани фиксировали в течение 48 часов при комнатной температуре в цинк-формалиновом фиксаторе (Anatech Ltd.), инкубировали в 70% этаноле в течение 24 часов и затем заливали парафином. Срезы размером 5 мкм с интервалами 50 мкм помещали на заряженные предметные стекла, депарафинизировали в ксилоле и окрашивали на экспрессию F4 / 80 крысиным моноклональным антителом против F4 / 80 мыши (Abd Serotec). Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 80 минут при комнатной температуре (разведение 1: 100).Крысиный IgG2a (Invitrogen) использовали в качестве изотипического контроля (разведение 1:50). Затем использовали биотинилированное вторичное антитело против крыс в разведении 1: 200, затем комплекс Avidin DH: биотинилированная пероксидаза H хрена (Vector Laboratories) и развитие в хромогенном субстрате 3,3′-диаминобензидин (Vector Laboratories). Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для каждого отдельного депо жировой ткани было проанализировано 5–10 различных мощных полей из каждого из 3 различных срезов. Общее количество ядер и количество ядер клеток, экспрессирующих F4 / 80, подсчитывали для каждого поля.Долю клеток, экспрессирующих F4 / 80, для каждого образца рассчитывали как сумму количества ядер клеток, экспрессирующих F4 / 80, деленное на общее количество ядер в срезах образца. Площадь поперечного сечения определяли для каждого адипоцита в каждом поле с использованием программного обеспечения для анализа изображений Image-Pro Plus (Media Cybernetics Inc.). Для каждой мыши подсчитывали 800–1000 адипоцитов. Число адипоцитов рассчитывали исходя из веса жировой подушечки и объема адипоцитов (48).

Для обнаружения BrdU-положительных клеток готовили срезы, как описано выше, и проводили иммуногистохимию с использованием моноклонального биотинилированного анти-BrdU (набор для окрашивания BrdU; Invitrogen).Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Для каждого отдельного депо жировой ткани было проанализировано 10 различных мощных полей из каждого из 3 различных срезов. Общее количество ядер и количество ядер BrdU-положительных клеток подсчитывали для каждого поля. Долю BrdU-положительных клеток для каждого образца рассчитывали как сумму количества ядер BrdU-положительных клеток, деленную на общее количество ядер в срезах образца.

Для обнаружения CD11c-положительных клеток использовали замороженные срезы (10 мкм).Срезы окрашивали на экспрессию CD11c антителом хомяка против CD11c мыши (Abd Serotec). Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 60 минут при комнатной температуре (разведение 1: 100). IgG хомяка использовали в качестве изотипического контроля (разведение 1: 100) (Abd Serotec). Затем использовали биотинилированное вторичное антитело против хомяка в разведении 1: 200 (30 минут), затем использовали комплекс Avidin DH: биотинилированная пероксидаза H хрена (Vector Laboratories) и проявили в хромогенном субстрате 3,3′-диаминобензидин (Vector Laboratories). .Предметные стекла контрастировали гематоксилином. Общее количество ядер и количество CD11c-положительных CLS подсчитывали для каждого поля. Долю CD11c-положительных CLS для каждого образца рассчитывали как сумму количества положительных CLS, деленную на общее количество ядер в срезах образца.

Для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, экспрессирующих F4 / 80 и CD11c, использовали замороженные срезы. Срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C (разведение 1: 100).Затем добавляли ослиный IgG против Cy3 крысы (Jackson ImmunoResearch) и козий IgG против хомяка Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Срезы инкубировали 45 минут при комнатной температуре (разведение 1: 300). Флуоресцентную микроскопию выполняли с использованием Nikon Eclipse 80i, оснащенного камерой Retiga Exi и системой флуоресцентного освещения X-Cite 120.

Количественная ОТ-ПЦР.

экстрагировали из замороженной жировой ткани с использованием кислотно-фенольного реагента (TRIzol; Invitrogen). РНК выделяли из SVC с использованием QIAGEN RNeasy Minikit (QIAGEN) и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen) и случайных гексамерных праймеров.Количественные анализы RT-PCR проводили с использованием системных инструментов DNA Engine Opticon 2 (Bio-Rad) и PCR SYBR Green I QuantiTect Master Mix (QIAGEN). Экспрессия мРНК всех указанных генов нормализована к экспрессии гена циклофилина B ( Ppib ). Каждую реакцию проводили в двух экземплярах, и данные анализировали методом 2-DDCT (49). Все использованные праймеры перечислены в дополнительной таблице 3.

Липолиз in vitro изолированной перигонадальной жировой ткани (эксплантаты).

Перигонадные жировые подушечки были удалены хирургическим путем у мышей C57BL / 6J, получавших с высоким содержанием жира ( n = 5 / группа), которые либо получали питание ad libitum, либо подвергались ограничению калорийности. Впоследствии их несколько раз промывали PBS. Кусочки ткани (общий вес ~ 100 мг) инкубировали в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 2% БСА, не содержащий жирных кислот (Sigma-Aldrich), при 37 ° C. Аликвоты собирали через 120 минут и исследовали на содержание FFA и глицерина. FFA и глицерин измеряли с использованием серии HR NEFA (Wako Diagnostics) и набора для определения свободного глицерина (Sigma-Aldrich) соответственно.Мы измерили количество адипоцитов в параллельных образцах от мышей, получавших ad libitum с одинаковым весом и жиром, и мышей с ограничением калорийности.

Опыты по совместительству.

Чтобы изолировать SVC, перигонадальную жировую ткань выделяли у самцов мышей C57BL / 6J с ожирением, вызванных диетой с высоким содержанием жиров, сразу после удушья CO ₂ . Ткани обрабатывали стерильными методами и измельчали ​​на мелкие (<10 мг) кусочки. Для выделения SVC измельченные образцы помещали в DMEM (Invitrogen) с добавлением 10 мг / мл BSA (Sigma-Aldrich).К суспензии ткани добавляли коктейль с обедненной ЛПС коллагеназой (Liberase 3; Roche Applied Science) в концентрации 0,03 мг / мл, и образцы инкубировали при 37 ° C на орбитальном шейкере (3 г ) в течение 45 минут. минут. После завершения разложения образцы пропускали через стерильную нейлоновую сетку 250 мкм (Sefar America Inc.). Суспензию центрифугировали при 500 г в течение 5 минут. Осажденные клетки собирали в виде SVC. SVC ресуспендировали в буфере для лизиса эритроцитов (BD Biosciences) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты.SVC высевали в концентрации 650 000 клеток / лунку на вкладыши для клеточных культур с размером пор 1 мкм (BD). Каждую вставку помещали в лунку 12-луночного планшета для культуры ткани (BD), содержащего 100 мг тонко измельченной жировой ткани. Чтобы выделить небольшие неповрежденные кусочки жировой ткани для культивирования, перигонадную жировую ткань удаляли у тучных мышей C57BL / 6J, получавших пищу с высоким содержанием жира, и измельчали ​​до кусочков размером примерно 10 мг. SVC совместно культивировали с кусочками жировой ткани в течение 24 часов в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин и 2% BSA, не содержащий жирных кислот.Изопротеренол (Sigma-Aldrich) добавляли в выбранные лунки в концентрации 10 мкмоль / л. Фракцию стромальных сосудов собирали для экспрессии гена или окрашивания масляным красным О через 24 часа.

Масляное красное окрашивание О. SVC

сушили на воздухе и фиксировали цинк-формалиновым фиксатором (см. Выше) в течение 10 минут и окрашивали масляным красным О, как описано ранее (50).

Анализ миграции макрофагов.

BMDM мыши были дифференцированы in vitro из клеток-предшественников костного мозга.Вкратце, клетки костного мозга вымывали из бедренных и большеберцовых костей 9-недельных мышей C57BL / 6J, промывали в DMEM (Invitrogen) и выращивали в течение 7 дней в чашках Петри, содержащих DMEM с 10% FBS, 20% кондиционированных клеток L929. среды, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина и 1% пирувата натрия. На седьмой день среды заменяли на DMEM, содержащую 10% FBS, 10% среды, кондиционированные клетками L929, 5% лошадиной сыворотки, 1% глутамина и 1% пирувата натрия; макрофаги выращивали еще 3 дня. Дифференциация подтверждена анализом FACS.Миграцию BMDM оценивали с использованием 96-луночного анализа миграции клеток с 5 мкм хемотаксисом QCM (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя. В нижнюю камеру добавляли среду, кондиционированную эксплантатом, простую среду или среду, содержащую рекомбинантный MCP-1 (50 нг / мл) (PeproTech). Для получения среды, кондиционированной эксплантами, эксплантаты выделяли от тощих 10-недельных мышей C57BL / 6J, которых кормили ad libitum или голодали в течение 24 часов. Эксплантаты от голодных животных инкубировали в базовых условиях, как описано выше, тогда как эксплантаты от мышей, получавших ad libitum, инкубировали с обработкой изопротеренолом (10 мкМ) (Sigma-Aldrich) или без нее.Содержание FFA в эксплантатах оценивали с помощью серии HR NEFA (Wako Diagnostics). Планшеты с миграционной камерой инкубировали в течение 15 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . В конце инкубации клетки детектировали зеленым флуоресцентным красителем (краситель CyQUANT), включенным в анализ. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью Infinite 500 (Tecan). Количество клеток определяли на основании показаний флуоресценции и стандартной кривой.

Препарат клодроната, инкапсулированный в липосомы.

24 мг холестерина и 258 мг фосфатидилхолина (Sigma-Aldrich) растворяли в хлороформе в круглодонной колбе. Хлороформ упаривали при 37 ° C в роторном испарителе в вакууме до образования тонкой липидной пленки. Три грамма клодроната (динатриевая соль дихлорметилендифосфоновой кислоты) (Sigma-Aldrich) растворяли в 15 мл PBS. Раствор клодронат-PBS или контрольный раствор PBS добавляли к липидной пленке и встряхивали при 4 г в течение 30 минут.Раствор обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при комнатной температуре в ультразвуковом устройстве с водяной баней (50 Вт). Липосомы центрифугировали при 49 400 g в течение 1 часа и ресуспендировали в 12 мл PBS.

Истощение макрофагов инкапсулированным в липосомы клодронатом.

Клодронат, инкапсулированный в липосомы, вводили внутрибрюшинно мышам C57BL / 6J. Каждой мыши вводили липосомы, содержащие 115 мг / кг клодроната или эквивалентный объем липосом, содержащих PBS.Мышей не кормили в течение 24 часов, начиная с 3 дня после инъекции, и истощение макрофагов в перигонадной жировой ткани было подтверждено в конце периода голодания (день 4). Для экспериментов in vitro перигонадные жировые подушечки были хирургически удалены у мышей C57BL / 6J, получавших пищу с высоким содержанием жира ( n = 4 / группа), которые не голодали в течение 24 часов. Впоследствии их несколько раз промывали PBS. Кусочки ткани (общий вес ~ 75 мг) инкубировали в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 1% антибиотиков, без добавления сыворотки.Через 6 часов в свежую среду добавляли 20% липосом, содержащих либо клодронат, либо PBS, до конечного объема 1 мл. Эксплантаты выдерживали в течение 48 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ . Затем среды, содержащие липосомы, перемещали и добавляли DMEM, содержащую 2% БСА без жирных кислот (Sigma-Aldrich). Аликвоты собирали через 120 минут и исследовали на содержание глицерина. Глицерин измеряли с помощью набора для определения свободного глицерина (Sigma-Aldrich). Эксплантаты также использовали для выделения РНК.

Статистика.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Все значения P были рассчитаны с использованием двухстороннего распределения, двухвыборочного теста с неравной дисперсией t Стьюдента. Все расчеты были выполнены с использованием Microsoft Excel и Statistica (Statsoft Inc.).

Границы | Влияние острых и хронических упражнений на липолиз абдоминального жира: обновление

Введение

Физические упражнения — одно из наиболее эффективных вмешательств в образ жизни для борьбы со многими хроническими заболеваниями, в частности ожирением и диабетом 2 типа.Польза для здоровья от упражнений достигается за счет улучшения энергетического обмена и гомеостаза глюкозы. Эти преимущества поддерживаются в долгосрочной перспективе за счет улучшения состава тела, вызванного гипертрофией мышц и потерей жировой массы (Ross and Bradshaw, 2009; Peterson et al., 2011; Stoner et al., 2016; Evans et al., 2019; Hsu et al., 2019; Viana et al., 2019). Важно отметить, что даже если тренировки с физической нагрузкой обычно оказывают очень умеренное влияние на массу тела, постоянным наблюдением является уменьшение окружности талии и массы висцеральной белой жировой ткани (WAT), и, следовательно, это эффективная стратегия снижения кардиометаболического риска у лиц с ожирением ( Wewege et al., 2017).

Во время тренировки скелетные мышцы используют как жирные кислоты (ЖК), так и глюкозу в качестве топлива для поддержания сокращения мышечных волокон. Когда упражнения выполняются с высокой интенсивностью и в течение короткого времени, мышечные клетки в первую очередь полагаются на глюкозу и мышечный гликоген в качестве топлива, который в основном высвобождается из запасов гликогена в мышцах и печени. Однако, если упражнение выполняется с умеренной интенсивностью и в течение более длительного периода, ФА станет основным источником энергии для поддержания сокращения мышц.Действительно, окисление ЖК в мышцах зависит от поступления ЖК из разных источников: ЖК, высвобождаемых в результате липолиза триацилглицеринов (TG), хранящихся в WAT, из циркулирующих липопротеинов очень низкой плотности-TG (VLDL-TG), из интрамиоцеллюлярных триацилглицеринов (IMTG) и потенциально ТГ хранится в меж / внутримышечной жировой ткани (IMAT). Вклад ЛПОНП-ТГ в окисление липидов всего тела колеблется от 5 до 10% в покое и, по-видимому, незначителен во время упражнений (Wolfe et al., 1985; Kiens and Lithell, 1989).Таким образом, жирные кислоты, полученные из IMTG и периферических WAT, являются основными источниками липидного топлива во время физических упражнений (Horowitz, 2003). Их относительный вклад в расход энергии при упражнениях зависит от ряда факторов, таких как интенсивность, продолжительность и тренировочный статус (Horowitz and Klein, 2000). Упражнения низкой и умеренной интенсивности, в диапазоне от 25 до 65% максимального потребления кислорода (VO ₂ max), связаны с 5-10-кратным увеличением окисления липидов всего тела по сравнению с отдыхом (Romijn et al., 1993). Большая часть увеличения доступности ЖК обеспечивается липолизом ВАТ, который увеличивается в 2–4 раза (Romijn et al., 1993; Klein et al., 1994; Krauzova et al., 2018). В этом обзоре мы обсудим влияние острых и хронических упражнений на липолиз ВАТ в брюшной полости у худых и страдающих ожирением людей.

Влияние острых физических упражнений на липолиз жировой ткани

Основные источники FA

Многочисленные исследования продемонстрировали тесную связь между липолизом и окислением ЖК во время физических упражнений.Действительно, наблюдалась положительная корреляция между липолитической скоростью, измеренной in vitro в изолированных адипоцитах, и окислением ЖК в состоянии покоя у здоровых людей во всем теле (Imbeault et al., 2000). Кроме того, была описана сильная положительная взаимосвязь между подкожным абдоминальным липолизом WAT и окислением ЖК всего тела, измеренным во время тренировки у испытуемых, тренированных на выносливость (Moro et al., 2014). Кроме того, активность липазы триглицеридов жиров (ATGL) увеличивается во время упражнений в WAT у худых и страдающих ожирением людей (Petridou et al., 2017).

Брюшной WAT состоит из двух основных жировых отложений: подкожного WAT (SCAT) с одной стороны и висцерального WAT с другой стороны. Физические упражнения в основном активируют липолиз при SCAT, так как только 5–10% циркулирующих длинноцепочечных ЖК высвобождаются из висцеральной жировой ткани у худых субъектов (Horowitz, 2003; Nielsen et al., 2004). Липолитический ответ SCAT в брюшной полости зависит как от интенсивности, так и от продолжительности упражнений (Horowitz, 2003). Кроме того, было высказано предположение, что подкожный абдоминальный липолиз сильнее ягодично-бедренного липолиза как у мужчин, так и у женщин, и что мужчины обладают относительной «резистентностью» к липолизу, опосредованному норэпинефрином, из-за более высокого содержания в адипоцитах альфа2-адренорецепторов, которые ингибируют липолиз (Leibel and Hirsch, 1987; Jensen and Johnson, 1996; Moro et al., 2007). Однако в этих исследованиях относительная скорость липолиза, измеренная in vitro, на изолированных адипоцитах, in situ, с помощью микродиализа и in vivo, с использованием различий A – V, оказалась похожей между мужчинами и женщинами, что указывает на большую мобилизацию липидов. Наблюдаемое во время упражнений у женщин в основном объясняется более высокой массой подкожно-жировой клетчатки по сравнению с мужчинами.

Основные липолитические гормоны и факторы

Активация липолиза SCAT во время упражнений может быть связана с увеличением концентрации катехоламинов в плазме, которые стимулируют бета-адренорецепторы на плазматической мембране адипоцитов, что приводит к внутриклеточной активации гормоночувствительной липазы (HSL; Horowitz, 2003).Однако ранее мы показали, что местная инфузия бета-блокатора пропранолола в SCAT только частично подавляет липолиз, вызванный физической нагрузкой (Moro et al., 2004; Verboven et al., 2018). Было обнаружено, что остаточный липолиз 60–70% коррелирует с концентрацией предсердного натрийуретического пептида (ANP) в плазме (Moro et al., 2004, 2008). Роль ANP в индуцированном физическими упражнениями липолизе была затем дополнительно подтверждена во время повторных тренировок на выносливость у худых здоровых и страдающих ожирением людей (Moro et al., 2006; Коппо и др., 2010). Таким образом, помимо хорошо известной роли катехоламинов в индуцированном физической нагрузкой липолизе ВАТ, повышение ПНП в плазме наряду со снижением инсулина в плазме (Moro et al., 2007) по отношению к интенсивности упражнений активно способствует усилению липолиза адипоцитов. во время тренировки. Интересно, что когда упражнения выполняются на следующий день после тренировки, когда запасы гликогена в мышцах все еще низки, липолиз увеличивается по сравнению с тем же упражнением, выполняемым после дня отдыха, у элитных велосипедистов (Moro et al., 2014). Поразительно, но это наблюдение нельзя объяснить вышеупомянутыми классическими липолитическими агентами, что позволяет предположить, что другие факторы могут участвовать в активации липолиза WAT во время упражнений (Moro et al., 2014). Последние данные показывают, что белки, секретируемые мышечными волокнами во время сокращения, так называемые миокины, могут активировать липолиз WAT у людей. Действительно, интерлейкин-6 (IL-6) был первым миокином, который был обнаружен, и уровни IL-6 в плазме были увеличены в ответ на резкую тренировку (Pedersen et al., 2001; Рейхман и Дела, 2014). Недавнее клиническое исследование продемонстрировало, что IL-6 необходим для уменьшения массы висцеральной жировой ткани в ответ на тренировку (Wedell-Neergaard et al., 2019). Однако роль IL-6 в активации липолиза WAT все еще остается предметом дискуссий, так как острое лечение IL-6 не активирует липолиз адипоцитов in vitro (Trujillo et al., 2004). Кроме того, было описано резкое повышение уровня IL-6 in vivo для увеличения липолиза всего тела из-за увеличения высвобождения мышечной ЖК, в то время как липолиз WAT оставался неизменным (Wolsk et al., 2010). Иризин — еще один миокин, который, как было описано, увеличивает липолиз WAT посредством косвенного механизма, включающего потемнение WAT (Bostrom et al., 2012). Однако хотя некоторые эксперименты, проведенные на грызунах, предполагают, что миокины, высвобождаемые при физической нагрузке, могут активировать потемнение WAT (Stanford et al., 2015), актуальность такого механизма у людей остается спорной (Norheim et al., 2014; Lehnig and Stanford, 2018). .

Совсем недавно мы идентифицировали новый миокин, секретируемый сокращением первичных клеток скелетных мышц человека, названный фактором роста и дифференцировки 15 (GDF15), который усиливает липолиз адипоцитов in vitro (Laurens et al., 2020). Кроме того, GDF15 также секретировался у людей после упражнений высокой или умеренной интенсивности in vivo , и рекомбинантный белок GDF15 был способен активировать липолиз в подкожных эксплантатах WAT (Laurens et al., 2020).

Также было описано, что белая жировая ткань продуцирует растворимые факторы, которые могут действовать паракринным / аутокринным образом для поддержания липолиза во время физических упражнений, таких как интерлейкин-15 (IL-15). Было продемонстрировано, что IL-15 может продуцироваться с помощью SCAT во время упражнения с одним часовым циклом, что, как известно, увеличивает липолиз WAT.Кроме того, секреция IL-15 в покое коррелирует с липолизом SCAT, а инфузия IL-15 посредством микродиализа активирует липолиз SCAT у худых субъектов, в то время как подавляет липолиз у субъектов с ожирением (Pierce et al., 2015). Однако никакой корреляции между секрецией IL-15 и липолизом во время упражнений не наблюдалось. Таким образом, вопрос о том, способствует ли IL-15 липолизу, вызванному физической нагрузкой, все еще обсуждается и требует дальнейших исследований.

Интенсивность упражнений

Относительный вклад использования FA во время тренировки зависит от ее интенсивности.Липолиз белой жировой ткани увеличивается от низкой до умеренной интенсивности и уменьшается при высокой интенсивности (Romijn et al., 1993). Действительно, когда упражнения выполняются с высокой интенсивностью, глюкоза является основным энергетическим субстратом, быстро подпитывающим сокращающуюся мышцу. Однако по мере снижения интенсивности упражнений происходит переключение, и липиды становятся основным энергетическим субстратом (то есть концепция кроссовера) (Brooks and Mercier, 1994). Концепция «Fatmax» была затем использована Jeukendreup и его коллегами для описания интенсивности упражнений, выраженной в процентах от VO ₂ max, вызывая максимальную зависимость от жира как топлива, окисляемого в скелетных мышцах (Jeukendrup and Wallis, 2005). ).При такой интенсивности половина ЖК, окисленных мышечными волокнами, доставляется липолизом WAT, а оставшаяся часть обеспечивается внутриклеточно за счет пулов IMTG. Значение Fatmax отличается для каждого человека и в основном зависит от массы тела, диеты, пола и тренировочного статуса (Jeukendrup and Wallis, 2005). Например, Fatmax был измерен на уровне 48% от VO ₂ max в большой когорте худых, ведущих сидячий образ жизни, в то время как у испытуемых, тренированных на выносливость, он составлял около 65% (Achten et al., 2002; Jeukendrup and Wallis, 2005). .Интересно, что Fatmax оказался ниже у мужчин, чем у женщин (45% против 52% от VO ₂ max, соответственно) (Jeukendrup and Wallis, 2005). Как указывалось ранее, большее окисление липидов при данной интенсивности упражнений у женщин объясняется более высокой мобилизацией липидов при той же относительной интенсивности упражнений из-за большей массы подкожного жира. Кроме того, Fatmax ниже у людей с ожирением, чем у худых (Perez-Martin et al., 2001). Однако, даже если Fatmax широко использовался в программах похудания, основанных на физических упражнениях, эта концепция также вызвала некоторую критику.Во-первых, Fatmax сильно зависит от диеты и состояния питания, поскольку организм больше полагается на углеводы (CHO) в качестве топлива, когда они очень доступны, например, в постпрандиальных условиях. Во-вторых, скорость окисления ЖК одинакова в большом диапазоне интенсивности упражнений, обычно примерно от 45 до 75% от максимальной аэробной способности, и, таким образом, не сильно отличается от пикового значения (т. Е. Значения Fatmax). В-третьих, количество ЖК, сожженных в течение 24 часов, зависит не только от ЖК, окисленных во время упражнений, но и в период восстановления после упражнений, особенно когда упражнения выполняются с высокой интенсивностью.Наконец, Fatmax — это скорость окисления ЖК, но общее количество используемых ЖК зависит от расхода энергии, а упражнения высокой интенсивности вызывают наибольший расход энергии. Таким образом, тренировка с интенсивностью Fatmax может не принести дополнительной пользы для снижения веса, чем другие тренировочные вмешательства, выполняемые с более высокой интенсивностью упражнений.

Продолжительность учений

Вклад FA в подпитку сокращающейся мышцы также зависит от продолжительности упражнения. Исследования, проведенные в различных группах, показали, что окисление ЖК постепенно увеличивается во время продолжительной тренировки, в то время как окисление СНО уменьшается (Ravussin et al., 1986; Klein et al., 1994). Это сопровождается увеличением липолиза с увеличением продолжительности упражнений (de Glisezinski et al., 2003; Lafontan et al., 2008). Интересно, что было показано, что активность мышечного HSL снижается во время продолжительной тренировки (Watt et al., 2003). Это является следствием повышенного поглощения циркулирующих ЖК мышечными волокнами, что, в свою очередь, снижает липолиз и окисление запасов IMTG. Увеличение липолиза WAT в основном связано с повышением уровня пролиполитических гормонов в плазме во время длительных физических упражнений.Действительно, секреция катехоламинов увеличивается в зависимости от продолжительности упражнений. Это увеличение более выражено для адреналина, чем для норадреналина, вероятно, из-за несколько более низкой гликемии (de Glisezinski et al., 2003) и того факта, что на секрецию норадреналина в основном влияет интенсивность упражнений (Leuenberger et al., 1993). В соответствии с этим наблюдением мы ранее продемонстрировали, что адреналин является основным бета-адренергическим агентом, способствующим липолизу при физической нагрузке при SCAT (de Glisezinski et al., 2009). Мы показали, что это увеличение липолиза адипоцитов зависит не только от бета-адренергической стимуляции катехоламинами, но также от снижения уровня инсулина в плазме и повышения ПНП в плазме (Arner et al., 1990; Moro et al., 2004 ). Например, было обнаружено, что уровень ПНП в плазме особенно высок после марафона и может участвовать в активации липолиза WAT, чтобы компенсировать резкое повышение потребности в энергии во время бега на длинные дистанции (Niessner et al., 2003).

Наконец, все затраты энергии, вызванные упражнениями, также должны приниматься во внимание при рассмотрении вклада FA, сожженных в ответ на упражнение, поскольку высокий процент не всегда отражает большое количество сожженных FA, если затраты энергии вызваны тренировка схватка низкая. Расход энергии при выполнении упражнений зависит как от их интенсивности, так и от продолжительности.

Воздействие осбесити

Важно отметить, что мы и другие исследователи наблюдали, что липолиз SCAT, вызванный физической нагрузкой, ниже у субъектов с ожирением, чем у субъектов без ожирения (Stich et al., 2000; Mittendorfer et al., 2004; Росс и Брэдшоу, 2009). Это было связано с более высокой чувствительностью антилиполитических альфа2-адренорецепторов и более низкой чувствительностью пролиполитических бета-адренорецепторов у лиц с ожирением (Stich et al., 2000). Однако из-за более высокой жировой массы у лиц с ожирением по сравнению с лицами, не страдающими ожирением, концентрация ЖК в плазме была выше у лиц с ожирением как в состоянии покоя, так и во время физических упражнений (Stich et al., 2000). Кроме того, экспрессия рецептора клиренса ANP NPRC выше в адипоцитах у субъектов с ожирением, чем у худых здоровых людей, и может участвовать в более низкой активации липолиза в ответ на секрецию ANP во время упражнений (Dessi-Fulgheri et al., 2003; Ковачова и др., 2016; Ryden et al., 2016). Таким образом, в то время как скорость базального липолиза выше у субъектов с ожирением по сравнению с субъектами, не страдающими ожирением, липолиз, вызванный физической нагрузкой, снижается у субъектов с ожирением. Этот адаптивный ответ при ожирении можно рассматривать как защитный механизм, позволяющий избежать чрезмерного высвобождения FA в кровоток во время тренировки.

Повышенный липолиз во время восстановления после тренировки

Взаимосвязь между интенсивностью упражнений и окислением ЖК и, следовательно, высвобождением ЖК в результате липолиза WAT не так проста, как первоначально предполагалось.Роль ЖК как питательных веществ во время восстановления после упражнений была описана в недавнем обзоре группы Бенте Кинса (Lundsgaard et al., 2020). Вкратце, даже если упражнения высокой интенсивности (т. Е. Выполняемые с интенсивностью, превышающей 75% от максимальной аэробной мощности субъекта) вызывают низкую скорость окисления ЖК во время тренировки, утилизация ЖК после тренировки выше, чем после упражнений с низкой интенсивностью. схватки (Pillard et al., 2010). Это более сильное окисление ЖК после тренировки с высокой интенсивностью в основном отражается снижением респираторного коэффициента (Marion-Latard et al., 2003) и, по-видимому, не зависит от расхода энергии в течение 6 часов после тренировки. Это является следствием предпочтительного использования СНО для пополнения запасов гликогена в мышцах, которые были истощены во время тренировки высокой интенсивности, что отдает предпочтение ФА в качестве основного топлива в течение 24–48 часов после тренировки (Tremblay et al., 1994; Кинс и Рихтер, 1998). Ранее мы показали на изолированных адипоцитах, что после длительной тренировки WAT демонстрирует повышенную чувствительность к бета-адренергическим липолитическим агентам, что может участвовать в увеличении доступности FA в период восстановления (Harant et al., 2002). Поразительно, но это увеличение потребления ЖК после тренировки более выражено у мужчин, чем у женщин (Henderson et al., 2007). Кроме того, используя вливание меченного стабильным изотопом пальмитата, Magkos et al. (2009) наблюдали, что вызванное упражнениями увеличение использования ЖК в период восстановления после тренировки больше у субъектов с низкой доступностью ЖК в плазме в состоянии покоя и больше после тренировки, приводящей к высокой потребности в энергии. Интересно, что было продемонстрировано, что липолиз после тренировки стимулируется в SCAT повышением уровня гормона роста в плазме, который секретируется соматотропными клетками во время тренировки (Enevoldsen et al., 2007). Недавнее исследование, проведенное на мышах, также выявило роль IL-6, миокина, секретируемого волокнами скелетных мышц во время упражнений, в регуляции липидного метаболизма WAT во время восстановления после упражнений (Knudsen et al., 2017).

Таким образом, представляется важным рассмотреть период восстановления после тренировки, чтобы полностью оценить влияние различных методов упражнений на использование ФА и, следовательно, потерю веса тела.

Влияние физических упражнений на липолиз жировой ткани

Тренировка с упражнениями улучшает мобилизацию ФА во время схватки с упражнениями.Действительно, было показано, что частота появления FA (Ra) в крови выше у субъектов, тренированных на выносливость, по сравнению с контрольной группой, ведущей сидячий образ жизни (Coggan et al., 2000). Тренировка с физической нагрузкой влияет как на чувствительность WAT к катехоламинам, так и на их секрецию во время упражнений, которая снижается в ответ на заданную абсолютную нагрузку после тренировки (Kjaer et al., 1987; Riviere et al., 1989; Arner, 1995). Поперечные исследования, проведенные на адипоцитах SCAT, показали, что бета-адренергическая чувствительность выше у тренированных субъектов, чем у лиц, ведущих малоподвижный образ жизни (Crampes et al., 1986; Crampes et al., 1989; Ривьер и др., 1989). Кроме того, продольные исследования показали, что тренировки на выносливость улучшают бета-адренергический липолитический ответ изолированных адипоцитов у субъектов с ожирением (De Glisezinski et al., 1998a; Moro et al., 2009).

Кроме того, физические упражнения улучшают реакцию ANP у субъектов с ожирением, но пока неясно, связано ли это с увеличением концентрации ANP в плазме или с увеличением рецепторов ANP на поверхности клеток адипоцитов (Moro et al., 2005). Действительно, с помощью in situ экспериментов по микродиализу в SCAT молодых мужчин с избыточным весом мы смогли показать, что 4 месяца аэробных тренировок улучшают как бета-адренергические, так и липолитические реакции ANP (Stich et al., 1999; Moro et al., 2005 ). Наконец, концентрация инсулина снижается с увеличением тренировочного статуса, но влияние на липолиз WAT частично уравновешивается улучшением чувствительности к инсулину WAT с помощью тренировок (Polak et al., 2005; Riis et al., 2019). Поразительно, что даже если липолиз, вызванный физической нагрузкой, выше у тренированных субъектов, концентрация ЖК в плазме ниже как в состоянии покоя, так и во время упражнений (Crampes et al., 2003; de Glisezinski et al., 2003). Это можно объяснить увеличением использования ЖК скелетными мышцами у тренированных субъектов. Действительно, количество окисления ЖК как в состоянии покоя, так и в результате упражнений выше после тренировочной программы, что приводит к повышенному потреблению кислорода (de Glisezinski et al., 2003). Улучшение липолиза, вызванного физической нагрузкой, наблюдаемое у субъектов с ожирением, тренирующихся на выносливость, также, по-видимому, частично связано со снижением антилиполитического эффекта альфа2-адренорецепторов в SCAT, что может быть следствием более низких уровней адреналина в плазме крови. основной альфа2-адренергический лиганд.Действительно, антилиполитическая активность альфа2-адренорецепторов снижалась после тренировки на выносливость у худых и тучных субъектов (De Glisezinski et al., 2001; Richterova et al., 2004). Интересно, что аналогичные адаптации липолитического ответа WAT были обнаружены после программы тренировок с отягощениями у лиц с ожирением (Polak et al., 2005).

Наконец, было замечено, что интенсивность упражнений, которая вызывает более высокий уровень липолитизма, увеличивается при тренировке с физической нагрузкой (Perez-Martin et al., 2001; Achten et al., 2002). Таким образом, в то время как максимальное использование FA достигается при интенсивности 30% от максимальной аэробной мощности у людей, ведущих сидячий образ жизни, у тренированных людей оно достигается примерно на 65%. Это означает, что общее количество FA, мобилизованное во время тренировки, выше у тренированных субъектов, потому что как расход энергии, так и процент использованных FA увеличиваются. Кроме того, высокоинтенсивные тренировки вызывают увеличение мышечной массы, что влияет на базовую скорость метаболизма и, таким образом, может увеличивать расход энергии и, как следствие, влиять на окисление ЖК в периоды покоя и потерю веса тела (Heydari et al., 2012; Осава и др., 2014; Schubert et al., 2017; Batrakoulis et al., 2018).

В целом, эти данные предполагают, что программа тренировок, сочетающая высокоинтенсивные и умеренные тренировки, может оптимизировать ежедневное использование ФА и оптимизировать потерю веса тела у людей с избыточным весом или ожирением.

Влияние диеты и времени дня на липолиз, вызванный физической нагрузкой

Доступность углеводов влияет на липолиз, вызванный физической нагрузкой. Действительно, прием глюкозы во время тренировки снижает липолиз SCAT и частично ингибирует окисление ЖК (De Glisezinski et al., 1998b). Было показано, что упражнения натощак увеличивают окисление ЖК и липолиз всего тела у здоровых людей (Vicente-Salar et al., 2015; Andersson Hall et al., 2016; Hansen et al., 2017). Это убедительный подход для достижения максимального использования жира во время упражнений. Интересно, что недавнее исследование показало, что упражнения после завтрака с высоким содержанием белка оказывают такое же влияние на липолиз, как и упражнения натощак (Saghebjoo et al., 2020). Кроме того, добровольцы, получавшие в течение 5 дней диету с высоким содержанием жиров, демонстрируют более высокую липолитическую скорость WAT во время упражнений, чем люди, получавшие диету, богатую CHO, что можно объяснить более высокой реакцией на катехоламины и более низкой инсулинемией (Suljkovicova et al., 2002).

В многочисленных обзорных статьях описывается влияние времени дня на эффективность упражнений, но очень немногие из них посвящены липидному метаболизму и липолизу WAT (Chtourou and Souissi, 2012; Seo et al., 2013; Dollet and Zierath, 2019; Parr et al. ., 2020). Несколько исследований показали, что упражнения, выполняемые в вечернее время, вызывают большую зависимость от липидов по сравнению с упражнениями, выполняемыми утром (Aoyama and Shibata, 2020). Кроме того, перекрестное исследование, проведенное с участием молодых мужчин, продемонстрировало, что упражнения на выносливость, выполняемые в вечернее время, повышают уровни адреналина в плазме, ИЛ-6 и ЖК в плазме по сравнению с такими же упражнениями, выполняемыми утром, что позволяет предположить, что вечерние упражнения являются наиболее эффективными. эффективен для достижения высоких показателей липолиза WAT (Kim et al., 2015). Однако данных по-прежнему мало, и для полного ответа на этот вопрос необходимо провести будущие исследования.

Ограничение калорийности и снижение веса, вызванное физическими упражнениями

Многие исследования показали, что ограничение калорий более эффективно для снижения веса тела, чем тренировка с упражнениями, и что сочетание тренировок с упражнениями с вмешательством по ограничению калорийности дает небольшое дополнительное преимущество для снижения веса по сравнению с ограничением калорий только одним способом (Miller et al., 1997 ; Swift et al., 2018). Однако упражнения играют важную роль в поддержании массы тела после похудания (Swift et al., 2018). Действительно, потеря веса, вызванная ограничением калорийности, увеличивает чувствительность WAT к липолитическим стимулам, производимым во время упражнений (Mauriege et al., 1999). Кроме того, упражнения защищают от потери безжировой массы тела во время ограничения калорий и предотвращают падение скорости метаболизма в состоянии покоя (Chomentowski et al., 2009).

Таким образом, даже если сочетание упражнений с вмешательством по ограничению калорий не приводит к дальнейшей потере веса, чем одно только ограничение калорий, упражнения потенцируют потерю массы висцерального жира и устойчивое улучшение состава тела (You et al., 2006), и предотвращает хорошо описанный эффект диеты «йо-йо».

Текущие пробелы в исследованиях

Есть много дополнительных вопросов, на которые еще предстоит ответить, чтобы полностью понять влияние физических упражнений на липолиз WAT и состав тела. Действительно, будущие исследования должны быть направлены на выявление неизвестных липолитических факторов, секретируемых во время упражнений, таких как миокины и потенциально микро-РНК, высвобождаемые во внеклеточных пузырьках в ответ на сокращение мышц (Whitham et al., 2018). Понимание сложных межорганных перекрестных помех во время упражнений откроет путь к новым областям исследований и может привести к открытию новых молекулярных игроков с потенциальной терапевтической ролью.

Наконец, исследовательские усилия также должны быть сосредоточены на совершенствовании методов тренировок с целью достижения максимального и устойчивого улучшения состава тела, особенно у людей с избыточным весом или ожирением. Оценка сочетания ограниченного по времени режима питания с тренировками, выполняемыми во время голодания, может быть привлекательным подходом к потере жировой массы.

Заключение

В целом, мало споров о том, что тренировки с упражнениями способствуют снижению веса в брюшной полости у людей с избыточным весом и ожирением. Хронические упражнения в значительной степени продемонстрировали свою способность способствовать снижению веса при ограничении калорийности и поддержанию долгосрочной потери веса. Ряд исследований показывают, что сочетание упражнений средней и высокой интенсивности может обеспечить дополнительные преимущества для потери веса, по крайней мере частично, за счет более высоких показателей расхода энергии во время упражнений и повышения скорости окисления ЖК во время восстановления после упражнений.Хотя канонические липолитические системы и гормоны были подробно изучены в течение последних 30 лет, более поздние исследования выявили перекрестные помехи между мышечной и жировой тканью, опосредованные миокинами, регулирующими липолиз WAT. Однако многое еще предстоит открыть. С открытием того факта, что сокращающиеся мышцы могут производить миокины, способные дистанционно воздействовать на органы, включая WAT, наши текущие знания, вероятно, будут подвергнуты сомнению в ближайшие несколько лет.

Авторские взносы

CL и CM написали и отредактировали рукопись.IG, IH и DL редактировали и исправляли рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы очень благодарны доктору Франсуа Крампу за его вклад в вышеупомянутые исследования, за выдающееся обсуждение и критическое прочтение рукописи.

Список литературы

Achten, J., Gleeson, M., and Jeukendrup, A.E. (2002). Определение интенсивности упражнений, вызывающих максимальное окисление жиров. Med. Sci. Спортивные упражнения. 34, 92–97. DOI: 10.1097 / 00005768-200201000-00015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андерссон Холл, У., Эдин, Ф., Педерсен, А., и Мадсен, К. (2016). У элитных спортсменов, работающих на выносливость, окисление жира в организме увеличивается в большей степени при выполнении предшествующих упражнений, чем при ночном голодании. Заявл. Physiol. Nutr. Метаб. 41, 430–437. DOI: 10.1139 / apnm-2015-0452

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арнер, П. (1995). Влияние физических упражнений на метаболизм жировой ткани у людей. Внутр. J. Obes Relat. Метаб. Disord. 19 (Дополнение 4), S18 – S21.

Google Scholar

Арнер П., Кригхольм Э., Энгфельдт П. и Болиндер Дж. (1990). Адренергическая регуляция липолиза in situ в покое и во время физических упражнений. Дж.Clin. Инвестировать. 85, 893–898. DOI: 10.1172 / jci114516

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Батракулис А., Джамуртас А. З., Георгакули К., Драганидис Д., Дели, К. К., Папаниколау К. и др. (2018). Высокоинтенсивная комплексная нейромышечная тренировка изменяет энергетический баланс и снижает массу тела и жир у женщин с ожирением: 10-месячное рандомизированное контролируемое исследование, исключающее тренировку. PLoS One 13: e0202390. DOI: 10,1371 / журнал.pone.0202390

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bostrom, P., Wu, J., Jedrychowski, M. P., Korde, A., Ye, L., Lo, J. C., et al. (2012). PGC1-альфа-зависимый миокин, который стимулирует развитие белого жира, подобное бурому жиру, и термогенез. Природа 481, 463–468.

Google Scholar

Брукс, Г. А., и Мерсье, Дж. (1994). Баланс использования углеводов и липидов во время упражнений: концепция «кроссовера». Дж.Прил. Physiol. 76, 2253–2261. DOI: 10.1152 / jappl.1994.76.6.2253

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Chomentowski, P., Dube, J. J., Amati, F., Stefanovic-Racic, M., Zhu, S., Toledo, F. G., et al. (2009). Умеренные упражнения уменьшают потерю массы скелетных мышц, которая происходит при преднамеренной потере веса, вызванной ограничением калорийности, у пожилых людей с избыточным весом или ожирением. J. Gerontol A Biol. Sci. Med. Sci. 64, 575–580. DOI: 10.1093 / gerona / glp007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Когган, А.Р., Рагузо, К. А., Гасталделли, А., Сидосис, Л. С., и Екель, К. В. (2000). Обмен жиров во время упражнений высокой интенсивности у тренированных на выносливость и нетренированных мужчин. Метаболизм 49, 122–128. DOI: 10.1016 / s0026-0495 (00) -6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Crampes, F., Beauville, M., Riviere, D., and Garrigues, M. (1986). Влияние физических тренировок у людей на реакцию изолированных жировых клеток на адреналин. J. Appl. Physiol. 61, 25–29.DOI: 10.1152 / jappl.1986.61.1.25

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Crampes, F., Marion-Latard, F., Zakaroff-Girard, A., De Glisezinski, I., Harant, I., Thalamas, C., et al. (2003). Влияние продольной программы тренировок на реакцию на упражнения у мужчин с избыточным весом. Obes Res. 11, 247–256. DOI: 10.1038 / oby.2003.38

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Crampes, F., Riviere, D., Beauville, M., Марсерон, М., и Гарригес, М. (1989). Липолитический ответ адипоцитов на адреналин у людей, ведущих сидячий образ жизни и тренирующихся: различия, связанные с полом. Eur. J. Appl. Physiol. Ок. Physiol. 59, 249–255. DOI: 10.1007 / bf02388324

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

De Glisezinski, I., Crampes, F., Harant, I., Berlan, M., Hejnova, J., Langin, D., et al. (1998a). Тренировки на выносливость изменяют липолитическую реакцию ожирения жировой ткани. Am. J. Physiol. 275, E951 – E956.

Google Scholar

De Glisezinski, I., Harant, I., Crampes, F., Trudeau, F., Felez, A., Cottet-Emard, J. M., et al. (1998b). Влияние приема углеводов на липолиз жировой ткани во время длительных тренировок у тренированных мужчин. J. Appl. Physiol. 84, 1627–1632. DOI: 10.1152 / jappl.1998.84.5.1627

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

де Глизезински, И., Ларруи, Д., Байзова, М., Коппо К., Полак Дж., Берлан М. и др. (2009). Адреналин, но не норадреналин, является определяющим фактором мобилизации липидов в подкожно-жировой клетчатке человека при физической нагрузке. J. Physiol. 587 (Pt 13), 3393–3404. DOI: 10.1113 / jphysiol.2009.168906

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

De Glisezinski, I., Marion-Latard, F., Crampes, F., Berlan, M., Hejnova, J., Cottet-Emard, J.M., et al. (2001). Отсутствие альфа (2) -адренергического антилиполитического действия при нагрузке на подкожно-жировую клетчатку тренированных мужчин. J. Appl. Physiol. 91, 1760–1765. DOI: 10.1152 / jappl.2001.91.4.1760

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

de Glisezinski, I., Moro, C., Pillard, F., Marion-Latard, F., Harant, I., Meste, M., et al. (2003). Аэробные тренировки улучшают индуцированный физической нагрузкой липолиз при SCAT и утилизацию липидов у мужчин с избыточным весом. Am. J. Physiol. Эндокринол. Метаб. 285, E984 – E990.

Google Scholar

Десси-Фулгери, П., Сарзани, Р., и Раппелли, А. (2003). Роль натрийуретической пептидной системы в липогенезе / липолизе. Nutr. Метаб. Кардиоваск. Дис. 13, 244–249. DOI: 10.1016 / s0939-4753 (03) 80018-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доллет, Л., Зиерат, Дж. Р. (2019). Взаимодействие между диетой, физическими упражнениями и молекулярными циркадными часами в управлении метаболической адаптацией жировой ткани. J. Physiol. 597, 1439–1450. DOI: 10.1113 / jp276488

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эневольдсен, Л.H., Polak, J., Simonsen, L., Hammer, T., Macdonald, I., Crampes, F., et al. (2007). Посттренировочный липолиз брюшной и подкожной жировой ткани натощак подавляется инфузией аналога соматостатина октреотида. Clin. Physiol. Funct. Imaging 27, 320–326. DOI: 10.1111 / j.1475-097x.2007.00754.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эванс, П. Л., Макмиллин, С. Л., Вейраух, Л. А., и Витчак, К. А. (2019). Регулирование транспорта глюкозы в скелетных мышцах и метаболизма глюкозы с помощью физических упражнений. Питательные вещества 11: 2432. DOI: 10.3390 / nu11102432

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хансен Д., Де Страйкер Д. и Колдерс П. (2017). Влияние тренировок на выносливость натощак на биохимию и метаболизм мышц у здоровых субъектов: могут ли эти эффекты иметь особую клиническую пользу для пациентов с сахарным диабетом 2 типа и инсулинорезистентных пациентов? Sports Med. 47, 415–428. DOI: 10.1007 / s40279-016-0594-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гарант, И., Marion-Latard, F., Crampes, F., de Glisezinski, I., Berlan, M., Stich, V., et al. (2002). Влияние длительных физических упражнений на липолитическую реакцию жировых клеток на адренергические агенты и инсулин у мужчин с ожирением. Внутр. J. Obes Relat. Метаб. Disord. 26, 1373–1378. DOI: 10.1038 / sj.ijo.0802072

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хендерсон, Г. К., Фаттор, Дж. А., Хорнинг, М. А., Фагихния, Н., Джонсон, М. Л., Мау, Т. Л. и др. (2007).Липолиз и метаболизм жирных кислот у мужчин и женщин в период восстановления после упражнений. J. Physiol. 584 (Pt 3), 963–981. DOI: 10.1113 / jphysiol.2007.137331

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хейдари М., Фройнд Дж. И Бутчер С. Х. (2012). Влияние интервальных упражнений высокой интенсивности на телосложение молодых мужчин с избыточным весом. Дж. Обес 2012: 480467.

Google Scholar

Горовиц, Дж.Ф. (2003). Мобилизация жирных кислот из жировой ткани во время тренировки. Trends Endocrinol. Метаб. 14, 386–392. DOI: 10.1016 / s1043-2760 (03) 00143-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Горовиц, Дж. Ф., и Кляйн, С. (2000). Липидный обмен во время упражнений на выносливость. Am. J. Clin. Nutr. 72 (2 доп.), 558S – 563S.

Google Scholar

Сюй, К. Дж., Ляо, К. Д., Цай, М. В. и Чен, К. Н. (2019). Влияние упражнений и диетических вмешательств на состав тела, метаболическое здоровье и физическую работоспособность у взрослых с саркопеническим ожирением: метаанализ. Питательные вещества 11: 2163. DOI: 10.3390 / nu110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Имбо П., Трембле А., Депре Дж. И Мориж П. (2000). Стимулируемый бета-адренорецепторами липолиз подкожных адипоцитов брюшной полости как детерминант окисления жиров у мужчин с ожирением. Eur. J. Clin. Инвестировать. 30, 290–296. DOI: 10.1046 / j.1365-2362.2000.00634.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дженсен, М.Д., и Джонсон, К. М. (1996). Вклад кинетики свободных жирных кислот (СЖК) ног и внутренних органов в постабсорбционный приток СЖК у мужчин и женщин. Метаболизм 45, 662–666. DOI: 10.1016 / s0026-0495 (96)

-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Jeukendrup, A. E., and Wallis, G.A. (2005). Измерение окисления субстрата во время физических упражнений с помощью измерений газообмена. Внутр. J. Sports Med. 26 (Дополнение 1), S28 – S37.

Google Scholar

Киенс, Б., и Рихтер, Э.А. (1998). Использование триацилглицерина скелетных мышц во время восстановления после тренировки у людей. Am. J. Physiol. 275, E332 – E337.

Google Scholar

Ким, Х. К., Кониси, М., Такахаши, М., Табата, Х., Эндо, Н., Нумао, С. и др. (2015). Влияние упражнений на повышенную выносливость, выполняемых утром и вечером, на воспалительные цитокины и метаболические гормональные реакции. PLoS One 10: e0137567. DOI: 10.1371 / journal.pone.0137567

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кьяер, М., Секер Н. Х. и Гальбо Х. (1987). Физический стресс и выброс катехоламинов. Baillieres Clin. Эндокринол. Метаб. 1, 279–298. DOI: 10,1016 / s0950-351x (87) 80064-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кляйн, С., Койл, Э. Ф., и Вулф, Р. Р. (1994). Жировой обмен во время упражнений низкой интенсивности у тренированных на выносливость и нетренированных мужчин. Am. J. Physiol. 267 (6, часть 1), E934 – E940.

Google Scholar

Кнудсен, Дж. Г., Гудиксен, А., Bertholdt, L., Overby, P., Villesen, I., Schwartz, C. L., et al. (2017). IL-6 в скелетных мышцах регулирует использование мышечного субстрата и метаболизм жировой ткани во время восстановления после резких тренировок. PLoS One 12: e0189301. DOI: 10.1371 / journal.pone.0189301

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коппо К., Ларруи Д., Маркес М. А., Берлан М., Байзова М., Полак Дж. И др. (2010). Мобилизация липидов в подкожной жировой клетчатке во время физических упражнений у худых и полных людей.Роль инсулина и натрийуретических пептидов. Am. J. Physiol. Эндокринол. Метаб. 299, E258 – E265.

Google Scholar

Ковачова, З., Тарп, В. Г., Лю, Д., Вэй, В., Се, Х., Коллинз, С., и др. (2016). Экспрессия рецептора натрийуретического пептида жировой ткани связана с чувствительностью к инсулину при ожирении и диабете. Ожирение 24, 820–828. DOI: 10.1002 / oby.21418

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Краузова, Е., Тума, П., де Глизезински, И., Стич, В., и Сиклова, М. (2018). Метформин не подавляет липолиз жировой ткани, вызванный физической нагрузкой, у молодых здоровых худощавых мужчин. Фронт. Physiol. 9: 604. DOI: 10.3389 / fphys.2018.00604

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лафонтан, М., Моро, К., Берлан, М., Крэмпс, Ф., Сенгенес, К., и Галицки, Дж. (2008). Контроль липолиза натрийуретическими пептидами и циклическим GMP. Trends Endocrinol. Метаб. 19, 130–137.DOI: 10.1016 / j.tem.2007.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лауренс К., Пармар А., Мерфи Э., Карпер Д., Лэр Б., Маес П. и др. (2020). Фактор роста и дифференцировки 15 секретируется скелетными мышцами во время физических упражнений и способствует липолизу у людей. JCI Insight 5: e131870.

Google Scholar

Лейбель Р. Л. и Хирш Дж. (1987). Местные и половые различия в адренорецепторном статусе жировой ткани человека. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 64, 1205–1210. DOI: 10.1210 / jcem-64-6-1205

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лойенбергер, У., Синовей, Л., Губин, С., Галл, Л., Дэвис, Д., и Зелис, Р. (1993). Влияние интенсивности и продолжительности упражнений на распространение норадреналина и клиренс у людей. J. Appl. Physiol. 75, 668–674. DOI: 10.1152 / jappl.1993.75.2.668

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Магкос, Ф., Мохаммед Б. С., Паттерсон Б. В. и Миттендорфер Б. (2009). Кинетика свободных жирных кислот в поздней фазе послетренировочного восстановления: важность метаболизма жирных кислот в покое и дефицит энергии, вызванный физической нагрузкой. Метаболизм 58, 1248–1255. DOI: 10.1016 / j.metabol.2009.03.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марион-Латар, Ф., Крампес, Ф., Закаров-Жирар, А., Де Глизезински, И., Гарант, И., Стич, В., и др. (2003). Повышение уровня окисления липидов после тренировки после умеренной тренировки у нетренированных здоровых мужчин с ожирением. Horm. Метаб. Res. 35, 97–103. DOI: 10,1055 / с-2003-39051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мориж П., Имбо П., Ланжен Д., Лакайль М., Альмерас Н., Трембле А. и др. (1999). Региональные и гендерные различия липолиза жировой ткани в ответ на потерю веса. J. Lipid Res. 40, 1559–1571.

Google Scholar

Миллер В. К., Коцея Д. М. и Гамильтон Э. Дж. (1997). Метаанализ последних 25 лет исследований по снижению веса с использованием диеты, физических упражнений или диеты плюс вмешательство физических упражнений. Внутр. J. Obes Relat. Метаб. Disord. 21, 941–947. DOI: 10.1038 / sj.ijo.0800499

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миттендорфер Б., Филдс Д. А. и Кляйн С. (2004). Избыток жира в организме у мужчин снижает доступность жирных кислот в плазме и их окисление во время упражнений на выносливость. Am. J. Physiol. Эндокринол. Метаб. 286, E354 – E362.

Google Scholar

Моро, К., Креймпес, Ф., Сенгенес, К., Де Глизезински, И., Галицкий, Дж., Thalamas, C., et al. (2004). Предсердный натрийуретический пептид способствует физиологическому контролю мобилизации липидов у людей. FASEB J. 18, 908–910. DOI: 10.1096 / fj.03-1086fje

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моро, К., Гарант, И., Бадин, П. М., Патарка, Ф. Х., Гилланд, Дж. К., Бурлье, В. и др. (2014). Влияние липолиза и доступности жирных кислот на выбор топлива во время упражнений. J. Physiol. Biochem. 70, 583–591.

Google Scholar

Моро К., Пасарика М., Элкинд-Хирш К. и Редман Л. М. (2009). Аэробные упражнения улучшают предсердный натрийуретический пептид и катехоламин-опосредованный липолиз у тучных женщин с синдромом поликистозных яичников. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 94, 2579–2586. DOI: 10.1210 / jc.2009-0051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моро, К., Пиллард, Ф., де Глизезински, И., Крэмпс, Ф., Таламас, К., Гарант, И., и другие. (2007). Половые различия в механизмах регуляции липолиза у лиц с избыточным весом: влияние интенсивности упражнений. Ожирение 15, 2245–2255. DOI: 10.1038 / oby.2007.267

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моро К., Пиллард Ф., Де Глизезински И., Гарант И., Ривьер Д., Стич В. и др. (2005). Тренировка усиливает липидомобилизирующее действие ANP в жировой ткани мужчин с избыточным весом. Med. Sci. Спортивные упражнения. 37, 1126–1132. DOI: 10.1249 / 01.mss.0000170124.51659.52

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Moro, C., Pillard, F., de Glisezinski, I., Klimcakova, E., Crampes, F., Thalamas, C., et al. (2008). Вызванная физическими упражнениями мобилизация липидов в подкожной жировой ткани у мужчин с избыточным весом в основном связана с натрийуретическими пептидами. Am. J. Physiol. Эндокринол. Метаб. 295, E505 – E513.

Google Scholar

Моро, К., Полак, Дж., Хейнова, Дж., Климчакова, Е., Судороги, Ф., Стич, В. и др. (2006). Предсердный натрийуретический пептид стимулирует мобилизацию липидов во время повторяющихся тренировок на выносливость. Am. J. Physiol. Эндокринол. Метаб. 290, E864 – E869.

Google Scholar

Нильсен, С., Го, З., Джонсон, К. М., Хенсруд, Д. Д., и Дженсен, М. Д. (2004). Спланхнический липолиз при ожирении у человека. J. Clin. Инвестировать. 113, 1582–1588. DOI: 10.1172 / jci21047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нисснер, А., Зиглер, С., Слани, Дж., Билленштайнер, Э., Волощук, В., и Гейер, Г. (2003). Повышение уровней натрийуретических пептидов предсердий и головного мозга в плазме после марафона: частично ли их эффекты уравновешиваются стероидами надпочечников? Eur. J. Endocrinol. 149, 555–559. DOI: 10.1530 / eje.0.14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Norheim, F., Langleite, T. M., Hjorth, M., Holen, T., Kielland, A., Stadheim, H. K., et al. (2014).Влияние острых и хронических упражнений на PGC-1альфа, ирисин и потемнение подкожной жировой ткани у людей. FEBS J. 281, 739–749. DOI: 10.1111 / febs.12619

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Осава Ю., Адзума К., Табата С., Кацукава Ф., Исида Х., Огума Ю. и др. (2014). Влияние 16-недельных высокоинтенсивных интервальных тренировок с использованием эргометров для верхней и нижней части тела на аэробную подготовку и морфологические изменения у здоровых мужчин: предварительное исследование. Открытый доступ J. Sports Med. 5, 257–265. DOI: 10.2147 / oajsm.s68932

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Педерсен, Б. К., Стинсберг, А., и Шерлинг, П. (2001). Упражнение и интерлейкин-6. Curr. Opin. Гематол. 8, 137–141.

Google Scholar

Perez-Martin, A., Dumortier, M., Raynaud, E., Brun, J.F., Fedou, C., Bringer, J., et al. (2001). Баланс окисления субстрата во время субмаксимальных упражнений у худых и полных людей. Diabetes Metab. 27 (4 Pt 1), 466–474.

Google Scholar

Петерсон, М. Д., Сен, А., и Гордон, П. М. (2011). Влияние упражнений с отягощениями на безжировую массу тела у пожилых людей: метаанализ. Med. Sci. Спортивные упражнения. 43, 249–258. DOI: 10.1249 / mss.0b013e3181eb6265

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петриду А., Хатзиниколау А., Авлонити А., Джамуртас А., Лоулес Г., Папассотириу И. и др.(2017). Повышенная активность триацилглицерин липазы в жировой ткани у худых и полных мужчин во время упражнений на выносливость. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 102, 3945–3952. DOI: 10.1210 / jc.2017-00168

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пирс, Дж. Р., Мейплз, Дж. М., и Хикнер, Р. К. (2015). Концентрации ИЛ-15 в скелетных мышцах и подкожной жировой ткани у худых и полных людей: местные эффекты ИЛ-15 на липолиз жировой ткани. Am.J. Physiol. Эндокринол. Метаб. 308, E1131 – E1139.

Google Scholar

Pillard, F., Van Wymelbeke, V., Garrigue, E., Moro, C., Crampes, F., Guilland, J. C., et al. (2010). Окисление липидов у мужчин с избыточным весом после физических упражнений и приема пищи. Метаболизм 59, 267–274. DOI: 10.1016 / j.metabol.2009.07.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Полак, Дж., Моро, К., Климчакова, Э., Хейнова, Дж., Майеркик, М., Вигери, Н., и другие. (2005). Динамическая силовая тренировка улучшает чувствительность к инсулину и функциональный баланс между адренергическими альфа-2А и бета-путями в подкожной жировой ткани у субъектов с ожирением. Диабетология 48, 2631–2640. DOI: 10.1007 / s00125-005-0003-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Равуссин, Э., Богардус, К., Шайдеггер, К., Лагранж, Б., Хортон, Э. Д. и Хортон, Э. С. (1986). Влияние повышенных уровней свободных жирных кислот на окисление углеводов и липидов при длительных физических упражнениях у людей. J. Appl. Physiol. 60, 893–900. DOI: 10.1152 / jappl.1986.60.3.893

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рихтерова, Б., Стич, В., Моро, К., Полак, Дж., Климчакова, Е., Майеркик, М., и др. (2004). Влияние тренировки на выносливость на адренергический контроль липолиза в жировой ткани у женщин с ожирением. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 89, 1325–1331. DOI: 10.1210 / jc.2003-031001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Риис, С., Кристенсен, Б., Неллеманн, Б., Моллер, А. Б., Хустед, А. С., Педерсен, С. Б. и др. (2019). Молекулярные адаптации подкожной жировой ткани человека после десяти недель тренировок на выносливость у здоровых мужчин. J. Appl Physiol. 126, 569–577. DOI: 10.1152 / japplphysiol.00989.2018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ривьер Д., Крэмпс Ф., Бовиль М. и Гарригес М. (1989). Липолитический ответ жировых клеток на катехоламины у женщин, ведущих малоподвижный образ жизни и занимающихся физическими упражнениями. J. Appl. Physiol. 66, 330–335. DOI: 10.1152 / jappl.1989.66.1.330

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Romijn, J. A., Coyle, E. F., Sidossis, L. S., Gastaldelli, A., Horowitz, J. F., Endert, E., et al. (1993). Регулирование эндогенного жирового и углеводного обмена в зависимости от интенсивности и продолжительности упражнений. Am. J. Physiol. 265 (3, часть 1), E380 – E391.

Google Scholar

Райден, М., Бакдаль, Дж., Петрус, П., Торелл А., Гао Х., Куэ М. и др. (2016). Нарушение предсердного липолиза, опосредованного натрийуретическим пептидом, при ожирении. Внутр. J. Obes 40, 714–720. DOI: 10.1038 / ijo.2015.222

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сагебджу М., Каргар-Акбарийе Н., Мохаммадния-Ахмади М. и Саффари И. (2020). Как выполнять упражнения для увеличения липолиза и чувствительности к инсулину: натощак или после однократного завтрака с высоким содержанием белка. J. Sports Med. Phys. Фитнес 60, 625–633.

Google Scholar

Шуберт, М. М., Кларк, Х. Э., Си, Р. Ф. и Испания, К. К. (2017). Влияние 4 недель интервальных тренировок на скорость обмена веществ в состоянии покоя, физическую форму и результаты, связанные со здоровьем. Заявл. Physiol. Nutr. Метаб. 42, 1073–1081. DOI: 10.1139 / apnm-2017-0268

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Со, Д. Ю., Ли, С., Ким, Н., Ко, К. С., Ри, Б. Д., Парк, Б. Дж. И др. (2013). Утренняя и вечерняя зарядка. Integr.Med. Res. 2, 139–144.

Google Scholar

Стэнфорд, К. И., Миддельбек, Р. Дж., И Гудиер, Л. Дж. (2015). Воздействие физических упражнений на белую жировую ткань: внешний вид и метаболическая адаптация. Диабет 64, 2361–2368. DOI: 10.2337 / db15-0227

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стич В., Де Глизезински И., Крэмпс Ф., Хейнова Дж., Коттет-Эмард Дж. М., Галицки Дж. И др. (2000). Активация альфа (2) -адренергических рецепторов нарушает индуцированный физической нагрузкой липолиз при SCAT у пациентов с ожирением. Am. J. Physiol. Regul. Интегр. Комп. Physiol. 279, R499 – R504.

Google Scholar

Стич, В., де Глизезински, И., Галицки, Дж., Хейнова, Дж., Крэмпс, Ф., Ривьер, Д., и др. (1999). Тренировка на выносливость увеличивает бета-адренергический липолитический ответ в подкожной жировой ткани у субъектов с ожирением. Внутр. J. Obes Relat. Метаб. Disord. 23, 374–381. DOI: 10.1038 / sj.ijo.0800829

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стоунер, Л., Rowlands, D., Morrison, A., Credeur, D., Hamlin, M., Gaffney, K., et al. (2016). Эффективность вмешательства физических упражнений для потери веса у подростков с избыточным весом и ожирением: метаанализ и последствия. Sports Med. 46, 1737–1751. DOI: 10.1007 / s40279-016-0537-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Suljkovicova, H., Marion-Latard, F., Hejnova, J., Majercik, M., Crampes, F., De Glisezinski, I., et al. (2002). Влияние состава макроэлементов диеты на регуляцию липолиза в жировой ткани в покое и во время физических упражнений: исследование микродиализа. Метаболизм 51, 1291–1297. DOI: 10.1053 / meta.2002.35190

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Свифт, Д. Л., Макги, Дж. Э., Эрнест, К. П., Карлайл, Э., Найгард, М., и Йоханнсен, Н. М. (2018). Влияние упражнений и физической активности на потерю и поддержание веса. Прог. Кардиоваск. Дис. 61, 206–213.

Google Scholar

Tremblay, A., Simoneau, J.A., и Bouchard, C. (1994). Влияние интенсивности упражнений на ожирение и метаболизм скелетных мышц. Метаболизм 43, 814–818. DOI: 10.1016 / 0026-0495 (94) -3

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Трухильо М. Э., Салливан С., Хартен И., Шнайдер С. Х., Гринберг А. С. и Фрид С. К. (2004). Интерлейкин-6 регулирует метаболизм липидов жировой ткани человека и выработку лептина in vitro. J. Clin. Эндокринол. Метаб. 89, 5577–5582. DOI: 10.1210 / jc.2004-0603

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вербовен, К., Stinkens, R., Hansen, D., Wens, I., Frederix, I., Eijnde, B.O., et al. (2018). Адренергический и неадренергический опосредованный липолиз жировой ткани человека во время интенсивных физических упражнений и тренировок. Clin. Sci. 132, 1685–1698. DOI: 10.1042 / cs20180453

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Виана, Р. Б., Навес, Дж. П. А., Косвиг, В. С., де Лира, К. А. Б., Стил, Дж., Фишер, Дж. П. и др. (2019). Являются ли интервальные тренировки волшебной палочкой для похудания? Систематический обзор и метаанализ, сравнивающий непрерывные тренировки средней интенсивности с интервальными тренировками высокой интенсивности (HIIT). Br. J. Sports Med. 53, 655–664. DOI: 10.1136 / bjsports-2018-099928

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Висенте-Салар, Н., Урдампиллета Отеги, А., и Рош Колладо, Э. (2015). Тренировка на выносливость в условиях голодания: биологические адаптации и управление массой тела. Nutr. Hosp. 32, 2409–2420.

Google Scholar

Ватт, М. Дж., Хейгенхаузер, Г. Дж., О’Нил, М., и Спрайт, Л. Л. (2003). Активность гормоночувствительной липазы и содержание жирных ацил-КоА в скелетных мышцах человека при длительных физических нагрузках. J. Appl. Physiol. 95, 314–321. DOI: 10.1152 / japplphysiol.01181.2002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wedell-Neergaard, A. S., Lang Lehrskov, L., Christensen, R.H., Legaard, G.E., Dorph, E., Larsen, M. K., et al. (2019). Изменения массы висцеральной жировой ткани, вызванные физической нагрузкой, регулируются передачей сигналов IL-6: рандомизированное контролируемое исследование. Cell Metab. 29, 844.e3–855.e3.

Google Scholar

Вевеге, М., Ван ден Берг, Р., Уорд, Р. Э., и Кич, А. (2017). Влияние интервальных тренировок высокой интенсивности по сравнению с непрерывными тренировками средней интенсивности на состав тела взрослых с избыточным весом и ожирением: систематический обзор и метаанализ. Obes Rev. 18, 635–646. DOI: 10.1111 / obr.12532

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Whitham, M., Parker, B. L., Friedrichsen, M., Hingst, J. R., Hjorth, M., Hughes, W. E., et al. (2018). Внеклеточные везикулы обеспечивают взаимодействие тканей во время упражнений. Cell Metab. 27, 237.e4–251.e4.

Google Scholar

Вулф Р. Р., Шоу Дж. Х. и Дюркот М. Дж. (1985). Влияние сепсиса на кинетику ЛПОНП: ответы в базальном состоянии и во время инфузии глюкозы. Am. J. Physiol. 248 (6, часть 1), E732 – E740.

Google Scholar

Вольск, Э., Мигинд, Х., Грондал, Т. С., Педерсен, Б. К., и ван Холл, Г. (2010). IL-6 избирательно стимулирует жировой обмен в скелетных мышцах человека. Am. J. Physiol.Эндокринол. Метаб. 299, E832 – E840.

Google Scholar

Ю Т., Мерфи К. М., Лайлз М. Ф., Демоны Дж. Л., Ленчик Л. и Никлас Б. Дж. (2006). Добавление аэробных упражнений к диетической потере веса преимущественно уменьшает размер адипоцитов в брюшной полости. Внутр. J. Obes 30, 1211–1216. DOI: 10.1038 / sj.ijo.0803245

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Как работает EVOLVE® ?: ДЕРМАБАРЕ: Med Spa

Независимо от того, подошли ли вы к завершению своего пути к снижению веса или начали замечать застойные жировые карманы, накапливающиеся на определенных участках вашего тела, вы слишком хорошо знаете, как бороться с попытками подтянуть свое тело с помощью диета и упражнения.К счастью, есть способ безопасно и эффективно разгладить стойкие жировые отложения, подтягивая и подтягивая кожу.

В DermaBare доктор Рамин Тайани и наша команда преданы делу вашего здоровья и благополучия. А для нас это также означает выглядеть и чувствовать себя на высоте. Вот почему мы рады предложить вам инновационную процедуру похудения с помощью системы EVOLVE®. Узнайте больше о том, как это работает, и подходите ли вы для лечения.

Что такое EVOLVE

EVOLVE является частью нехирургической коррекции контуров тела или липолиза, группы процедур, которые удаляют жир и подтягивают кожу без использования инвазивной хирургии.EVOLVE — это форма радиочастотного липолиза, что означает, что аппарат подает радиочастотные волны на определенные части вашего тела.

Радиочастотные волны — это форма ультразвуковой технологии, которая делает их безопасными и нежными для вашей кожи. Нам особенно нравится EVOLVE, потому что наши пациенты практически не испытывают дискомфорта во время лечения.

Радиочастотные волны работают, нацеливая и убивая ваши жировые клетки, которые ваше тело затем естественным образом устраняет.Он также подтягивает основную структуру вашей кожи, тем самым повышая выработку коллагена и эластина, способствуя гладким и молодым изгибам.

Преимущества EVOLVE

EVOLVE — удобный метод сжигания жира, поскольку в отличие от более инвазивных методов не требуется разрезов и времени восстановления. Поскольку лечение обычно занимает от 20 до 45 минут, вы можете провести процедуру во время обеденного перерыва и сразу же вернуться к обычному дню.

EVOLVE одобрен FDA, безопасен и эффективен.В зависимости от вашей формы вам может потребоваться повторное лечение, но пациенты обычно замечают результаты через месяц лечения. EVOLVE также намного более экономичен, чем более инвазивные методы лечения, такие как липосакция.

Вы кандидат на EVOLVE?

EVOLVE — это не метод похудания. Лучше всего для тех, у кого есть лишние участки жира или кожи, которые они хотели бы подтянуть. Так что это отличное лечение для тех, кто интенсивно похудел или заметил накопление жира в определенных областях.EVOLVE не рекомендуется людям с индексом массы тела более 30.

Чтобы узнать больше и записаться на прием, позвоните нам или запишитесь на прием на нашем сайте сегодня.

10 проверенных способов избавиться от упрямого жира на животе

Маффин. Любовные ручки. Запасное колесо. Несмотря на милые прозвища, жир на животе НЕ милый. Это непривлекательно, расстраивает и НЕПРЕРЫВНО. Это сопротивление не является воображаемым. Тело на самом деле вырабатывает жировые клетки, устойчивые к сжиганию или уменьшению, и они накапливаются в области живота, бедер и бедер.

Но эта «запаска» более чем непривлекательна и разочаровывает. Жир в области живота, также называемый висцеральным жиром, очень вреден. Этот тип жира является основным фактором риска диабета 2 типа и сердечных заболеваний.

Существуют научно обоснованные диеты, упражнения и стратегии приема добавок, которые помогут навсегда избавиться от упрямого жира. Читайте 10 проверенных методов избавления от упрямого жира на животе — навсегда!