Липоевая кислота р: Thorne Research, R-липоевая кислота, 60 капсул

Во всех исследованиях сообщалось о значительном улучшении показателей TSS. В этих исследованиях наблюдалось снижение TSS в среднем на 50% при пероральном или внутривенном введении не менее 600 мг в день. Однако по сравнению с участниками контрольных групп снижение TSS было на самом деле меньше, чем клинически значимый порог в 30% [15], так как TSS в контрольной группе также снизился.Это было особенно очевидно в исследованиях, в которых альфа-липоевая кислота вводилась перорально. В одном исследовании, в котором альфа-липоевая кислота вводилась внутривенно, группа вмешательства действительно показала снижение TSS более чем на 30% по сравнению с контрольной группой [16]. Дозировки выше 600 мг в день не привели к дальнейшему улучшению TSS и привели к увеличению частоты побочных эффектов, таких как тошнота, рвота и головокружение. Побочные эффекты, наблюдаемые при дозировке ≤600 мг в день, не отличались от наблюдаемых при приеме плацебо.Анализ безопасности лечения альфа-липоевой кислотой в течение 4 лет при диабетической полинейропатии [27] показал, что переносимость лечения и прекращение лечения из-за отсутствия переносимости не различались между группами плацебо и лечения. Однако частота серьезных нежелательных явлений была выше при приеме альфа-липоевой кислоты (38,1%), чем при приеме плацебо (28,0%) [27]. Из всех зарегистрированных нежелательных явлений только нарушения сердечного ритма и ритма наблюдались значительно чаще у пациентов, получавших альфа-липоевую кислоту, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (6.9% против 2,7%, 0,047) [27].

3.4. Мета-анализ

В целом объединенная стандартизованная разница средних значений, оцененная по всем испытаниям, показала снижение оценок TSS на -2,26 (ДИ: от -3,12 до -1,41;) в пользу введения альфа-липоевой кислоты (Таблица 4). Результаты анализа подгрупп перорального введения (-1,78 ДИ: -2,45 до -1,10;) и внутривенного введения (-2,81 ДИ: от -4,16 до -1,46;) подтвердили надежность общего результата (таблицы 5 и 6).

4.Обсуждение. мг в день (степень рекомендации A). Однако значительные улучшения, наблюдаемые после перорального приема альфа-липоевой кислоты в течение 3-5 недель в дозе ≥600 мг в день, вероятно, не имеют клинического значения, поскольку снижение TSS фактически было меньше порогового значения 30. % считается клинически значимым.В настоящее время нет публикаций, в которых описаны эффекты длительного лечения внутривенной или пероральной липоевой кислотой.

РКИ в основном проводятся одной немецкой исследовательской группой. Некоторые из этих исследований были многоцентровыми, в них были включены пациенты из Германии, России, Израиля и Хорватии. Предположительно, эти популяции пациентов не пересекаются. Все исследования спонсировались фармацевтической компанией, производящей альфа-липоевую кислоту.Ряд авторов получали зарплату от этой компании, кроме того, у фармацевтической компании также были представители, входящие в консультативный орган по нескольким из этих исследований.

Поразительно, что клинически значимое влияние на невропатическую боль наблюдается уже после 3-5 недель приема альфа-липоевой кислоты. Это неожиданно быстро для антиоксидантных диетических добавок. Это можно объяснить избирательной модуляцией кальциевых каналов Т-типа нейронов альфа-липоевой кислотой [10].В исследованиях диабетической вегетативной нейропатии эффекты альфа-липоевой кислоты наблюдались через 8–16 недель [21, 22], в зависимости от дизайна исследования.

Включенные РКИ не были разработаны для лечения нейропатической боли. Индивидуальные баллы по каждому из четырех симптомов СТШ (боль, жжение, парестезия, онемение) не были доступны из включенных исследований.

К сожалению, пока нет опубликованных результатов его администрирования за более длительный период времени. Постоянная долгосрочная эффективность любого лечения имеет первостепенное значение при хронических состояниях, таких как диабетическая невропатия.

В Нидерландах стоимость использования альфа-липоевой кислоты в дозировке 600 мг в день варьируется от 17,15 до 75,00 евро в месяц, в зависимости от производителя [14]. Для сравнения, стоимость амитриптилина, карбамазепина, дулоксетина, габапентина и прегабалина составляет, соответственно, 3,41, 9,38, 35,80, 53,75 и 71,71 евро в месяц (на основе налогового индекса Z, 2010 г.) [28].

Наконец, метаанализ, вероятно, будет страдать от систематической ошибки публикации, методологических недостатков и неоднородности.Мы свели вероятность систематической ошибки к минимуму, разработав подробный протокол перед началом этого исследования, выполнив тщательный поиск опубликованных исследований и используя явные методы для выбора исследований, извлечения данных и анализа данных. Кроме того, мы изучили всю совокупность рандомизированных доказательств, включив все соответствующие рандомизированные испытания.

Мы пришли к выводу, что внутривенное введение альфа-липоевой кислоты приводит к значительным и клинически значимым улучшениям симптоматической периферической диабетической нейропатии в краткосрочной перспективе.Представленные нами результаты достаточно обнадеживают, чтобы рассмотреть возможность внутривенного введения альфа-липоевой кислоты для лечения диабетической невропатии у пациентов, которые не реагируют на обычную терапию. Неясно, являются ли значительные улучшения, наблюдаемые при пероральном приеме альфа-липоевой кислоты, клинически значимыми. Для изучения эффектов обоих путей потребуются дополнительные более длительные исследования с использованием информативной шкалы нейропатической боли.

Вклад авторов

G.S. Mijnhout разработал стратегию поиска, выполнил поиск в базе данных и отбор исследований, а также методологическую оценку качества и написал рукопись; Б. Дж. Коллен отвечал за статистическую методологию исследования, выполнял статистическое объединение и редактировал рукопись; А. Альхалаф и Н. Клифстра выполнили поиск в базе данных, отбор исследований, методологическую оценку качества и отредактировали рукопись; Х. Дж. Г. Било редактировал рукопись и отвечал за критическую оценку и окончательное утверждение рукописи.Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Конфликт интересов

У авторов нет конфликта интересов, о котором следует раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность А. Резниченко, доктору медицины, из Центра почек, Отделение внутренней медицины, Университетский медицинский центр Гронингена, Нидерланды, за ее готовность перевести на русский язык публикацию Строкова и др. [24]. Они также благодарят Нин Цюй, доктор медицинских наук, из отделения кардиоторакальной хирургии Университетского медицинского центра Гронингена, Нидерланды, за его готовность перевести китайскую публикацию Liu et al.[26].

Липоевая кислота при вторично прогрессирующем МС

Реферат

Цель: Определить, снижает ли липоевая кислота (ЛК), эндогенно продуцируемый антиоксидант, скорость атрофии всего мозга и является ли она безопасной при вторично прогрессирующем МС (ВПРС).

Методы: Пациенты с ВПРС в возрасте 40–70 лет, включенные в одноцентровое двухлетнее двойное слепое рандомизированное исследование ежедневного перорального приема 1200 мг LA по сравнению с плацебо. Первичным результатом было изменение годового объема головного мозга в процентах (PCBV).Вторичными исходами были изменения частоты атрофии сегментированных структур головного и спинного мозга и субструктур сетчатки, инвалидность, качество жизни и безопасность. В анализе «намерение лечиться» использовались линейные смешанные модели.

Результаты: Участие произошло в период со 2 мая 2011 г. по 14 августа 2015 г. Группы исследования LA (n = 27) и плацебо (n = 24) были сопоставлены со средним возрастом 58,5 (SD 5,9) лет, 61 % женщин, средняя продолжительность заболевания 29,6 (стандартное отклонение 9,5) лет и средний показатель расширенного статуса инвалидности 6.0 (межквартильный размах 1,75). Через 2 года среднегодовое значение PCBV было значительно меньше в группе LA по сравнению с плацебо (-0,21 [стандартная ошибка оценки коэффициента (SEE) 0,14] против -0,65 [SEE 0,10], 95% доверительный интервал [ДИ] 0,157–0,727 , п = 0,002). Улучшенная ходьба на время 25 футов была почти, но не значительно лучше в LA, чем в контрольной группе (-0,535 [SEE 0,358] против 0,137 [SEE 0,247], 95% ДИ -1,37 до 0,03, p = 0,06). У пациентов с ЛП было значительно больше желудочно-кишечных расстройств и меньше падений.Неожиданная почечная недостаточность (n = 1) и гломерулонефрит (n = 1) произошли в когорте LA. Соответствие, измеренное по количеству таблеток, составило 87%.

Выводы: LA продемонстрировал 68% снижение годового PCBV и предположил клиническую пользу SPMS при сохранении благоприятной безопасности, переносимости и соответствия в течение 2 лет.

Идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT01188811.

Классификация доказательств: Это исследование предоставляет доказательства класса I того, что у пациентов с ВПРС ЛА снижает скорость атрофии головного мозга.

ГЛОССАРИЙ

AE =

нежелательное явление;

CI =

доверительный интервал;

EAE =

экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит;

EDSS =

Расширенная шкала статуса инвалидности;

GI =

желудочно-кишечный тракт;

ITT =

намерение лечить;

LA =

липоевая кислота;

MP-RAGE =

градиентное эхо-сигнал, подготовленный с помощью намагничивания;

OCT =

оптическая когерентная томография;

PCBV =

процент изменения объема мозга;

ИП =

главный исследователь;

RRMS =

ремиттирующий РС;

SAE =

серьезный AE;

SEE =

стандартные ошибки оценки коэффициента;

SPMS =

вторично-прогрессирующий MS

К двум десятилетиям большинство с ремиттирующим рецидивирующим MS (RRMS) имеют вторично-прогрессирующий MS (SPMS).Патофизиология SPMS, вероятно, включает митохондриальную дисфункцию, активацию микроглии, нарушение эндотелия сосудов и эффекты менингеальных лимфоидных тканей. ¹ Возникающая в результате нейродегенерация и ускоренная атрофия головного мозга коррелируют с функциональной инвалидностью; Таким образом, атрофия всего мозга является в настоящее время золотым стандартом суррогатного результата МРТ для испытаний SPMS. ² Нацеливание на определенные патофизиологические процессы является рациональной стратегией лечения ВПРС.

Липоевая кислота (LA) — это эндогенно продуцируемый антиоксидант с множеством биологических функций, включая улавливание свободных радикалов, хелатирование ионов металлов, регенерацию внутриклеточного глутатиона и восстановление макромолекул при окислительном повреждении. ³ В митохондриях окислительно-восстановительная пара LA / дигидролипоевая кислота является ключевым кофактором пируватдегидрогеназного комплекса окислительного дыхания и способствует синтезу нуклеиновых кислот. ⁴ LA модулирует сигнальный путь PKB / Akt, важный для целостности эндотелия сосудов, влияет на фактор транскрипции Nrf2 и действует как миметик инсулина. ^5,6

Наш центр и другие показали, что LA снижает инвалидность при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (EAE), уменьшает миграцию воспалительных клеток в спинной мозг и зрительные нервы и ингибирует активацию макрофагов / микроглии. ^7,8 Пероральный прием LA пациентами с РС приводит к уровням в крови, сравнимым с таковыми при EAE. ⁹ В клинических испытаниях LA хорошо переносится; частыми побочными реакциями были непереносимость желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), головная боль, зловонная моча и сыпь. ^10,11 Здесь мы сообщаем о результатах 2-летнего рандомизированного контролируемого исследования, чтобы определить, снижает ли ЛА частоту атрофии всего мозга, замедляет ли клиническое ухудшение и является ли он безопасным при ВПРС.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования.

Это проспективное, одноцентровое, двухлетнее, двойное слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование фазы II перорального рацемического LA в дозе 1200 мг в день для ответа на следующий вопрос первичного исследования с уровнем доказательности I класса: будет ли LA снижает частоту атрофии всего мозга при SPMS? Вторичные вопросы исследования заключались в том, чтобы определить, снизит ли ЛА частоту атрофии сегментированного головного мозга, спинного мозга и субструктур сетчатки, уменьшит ли ухудшение трудоспособности и качества жизни и будет ли безопасным при ВПРС.Набор проводился в период с мая 2011 года по октябрь 2013 года, последний визит был в августе 2015 года. Исследование проводилось в Портлендской системе здравоохранения по делам ветеранов (VAPORHCS), Портленд, штат Орегон, с некоторыми процедурами в Орегонском университете здоровья и науки (OHSU), Портленд, штат Орегон.

Участники.

Критериями включения были возраст 40–70 лет, предыдущий RRMS (критерии Макдональда 2005 г.) и текущее SPMS, определяемое прогрессированием инвалидности с рассеянным склерозом при отсутствии клинического рецидива в течение предшествующих 5 лет, как определено главным исследователем (PI) на основании анамнеза. и обзор диаграммы. ¹² Прогресс был определен как достаточный для изменения функциональной системы по расширенной шкале статуса инвалидности (EDSS) или достижения значимого функционального изменения (например, прекращение работы из-за когнитивного снижения). ¹³ Участникам было разрешено начинать, останавливать или продолжать глатирамера ацетат или β-интерферон во время исследования. Критериями исключения были использование натализумаба, иммунодепрессантов, химиотерапии или запланированного внутривенного лечения кортикостероидами в течение 1 года после включения в исследование, лечение кортикостероидами при рецидиве в течение 60 дней после включения в исследование, ЛА в течение 30 дней после включения в исследование, ограничения МРТ, самооценка глазных заболеваний, которые могли сбивать с толку. интерпретация оптической когерентной томографии (ОКТ), беременность или кормление грудью, значительное активное сопутствующее заболевание, неконтролируемый или инсулинозависимый диабет, а также отсутствие свободного владения английским языком.Из-за медленного набора в течение первых 8 месяцев ограничение EDSS в 6.0 было отменено.

Утверждение стандартных протоколов, регистрация и согласие пациентов.

Исследование было одобрено экспертными советами VAPORHCS и OHSU. Письменное согласие было получено от всех участников. Исследование было зарегистрировано на сайте ClinicalTrials.gov (NCT01188811) и проводилось в соответствии с рекомендациями CONSORT 2010 года. ¹⁴

Изучите роли персонала.

PI провела скрининговые визиты и начальные исследования EDSS для рандомизации, оценила нежелательные явления (НЯ) и выступила в качестве монитора исследования.Ослепленные неврологи и опытный практикующий невролог выступали в качестве экзаменаторов EDSS. Ослепленные координаторы исследования собирали данные о мобильности, анкеты и поддерживали базы данных.

Исследуемый препарат.

ИП (№ 110132) получило указание на новое исследуемое лекарство. Компания Pure Encapsulations (Садбери, Массачусетс) предоставила желатиновые капсулы, содержащие 600 мг рацемического LA или плацебо. Капсулы плацебо содержали авицел (кристаллы микроцеллюлозы) и 4,3 мг кверцетина (биофлавоноид), что придавало плацебо желтый цвет, похожий на LA.Срок годности исследуемого препарата был продлен один раз во время исследования Pure Encapsulations после повторного тестирования капсул с образцами, определившего сохраняющуюся стабильность.

График исследования.

Визиты для скрининга и базовые визиты были разделены на ≤30 дней. Последующие посещения на 3, 6, 12, 18 и 24 месяцах произошли ± 2 недели. Месяц был определен как 4 недели для целей планирования. МРТ и ОКТ проводились на исходном уровне, 12 и 24 месяцев. Данные о клинических исходах собирались на исходном уровне и каждые 6 месяцев. Лабораторные измерения безопасности выполнялись при каждом посещении.Между посещениями и после завершения исследования происходили телефонные звонки для выявления НЯ.

Результаты.

Первичным результатом была разница в годовом процентном изменении объема головного мозга (PCBV) на МРТ по оценке структурного изображения с использованием нормализации атрофии (SIENA). Вторичные результаты включали частоту атрофии сегментированных структур головного и спинного мозга и сетчатки, изменения в инвалидности, качество жизни и безопасность.

Протокол получения МРТ.

Детали получения и анализа МРТ показаны в приложении e-1 на сайте Neurology.org / nn. Следующие последовательности были получены с использованием Philips Achieva 3.0T серии X с системами градиента Quasar Dual: (1) 3D-градиентное эхо-сигнал для быстрого получения градиентного сигнала с высоким разрешением (3D MP-RAGE) с 1 мм ³ вокселей для высоких структурная (T1-взвешенная) информация разрешения. Верхний шейный отдел спинного мозга был намеренно включен в серию посредством позиционирования; (2) серия 3D-инверсионного восстановления с ослабленным флюидом (3D FLAIR) с вокселями 1 мм ³ ; (3) обычные 3 мм (0.3 промежуток) аксиальная двумерная плотность протонов / Т2-взвешенные последовательности с разрешением в плоскости 1 мм ² ; и (4) 3-миллиметровая сагиттальная 2D-плотность протонов / Т2-взвешенные последовательности спинного мозга. Внутрисосудистый контраст не применялся.

МРТ анализы.

МРТ были рассмотрены нейрорадиологом на предмет неожиданных результатов. Один обученный аналитик МРТ выполнял подсчет повреждений, волюметрию и анализ толщины коры. PI провела анализ толщины поперечного сечения спинного мозга и занятости очагов поражения.Обоими руководил нейрорадиолог. Объемы и карты церебральных Т2-гиперинтенсивных поражений были получены с использованием Lesion TOpology-preserving Anatomical Segmentation (Lesion-TOADS). ¹⁵ инструментов FSL использовались для создания изображений MP-RAGE с заполненными очагами поражения. SIENAX использовался для определения поперечных объемов всего мозга, белого и серого вещества. ¹⁶ Атрофия всего мозга определялась с помощью SIENA из пакета FSL. ¹⁶ Объемы подкоркового глубокого серого вещества были измерены с помощью FIRST. ¹⁶ Толщина коры, объемная сегментация коры и их анализ были выполнены с помощью FreeSurfer (surfer.nmr.mgh.harvard.edu/) и его продольного потока обработки. ¹⁷ Площадь поперечного сечения спинного мозга регистрировалась в точке С1. Для описательных целей была проведена внутренняя оценка относительного процента спинного мозга от большого затылочного отверстия до нижнего края C7, занятого очагами рассеянного склероза. МРТ оценивали по качеству (хорошее, удовлетворительное, плохое и непригодное для использования). Плохие и непригодные для использования сканы были исключены из анализа.

окт.

Участники прошли ОКТ спектральной области (Cirrus HD-OCT; Carl Zeiss Meditec, Inc., Дублин, Калифорния) в каждом глазу после фармакологического расширения (1% тропикамида и 0,5% гидрохлорида пропаракаина). Перипапиллярное сканирование и сканирование желтого пятна были получены с использованием протоколов Optic Disc Cube 200 × 200 и Macular Cube 512 × 128 соответственно. ОКТ проверял опытный нейроофтальмолог. Исключенные сканы имели противоречивые результаты, артефакты, рассогласование или мощность сигнала менее 7.

Клинические меры.

Инвалидность была зафиксирована EDSS. Один и тот же экзаменатор EDSS использовался для данного участника на протяжении всего исследования, насколько это было возможно. Мероприятиями по мобильности для амбулаторных участников были: ходьба на время 25 футов (T25FW), опросник по шкале ходьбы при рассеянном склерозе (MSWS-12) и опросник по уверенности в балансе по видам деятельности (ABC). ^{18, -, 20 Тест} символьных цифр (SDMT) проверял когнитивные способности. ²¹ Краткое описание состояния здоровья RAND, состоящее из 36 пунктов, для оценки качества жизни. ²²

Контроль безопасности.

НЯ были классифицированы с использованием критериев общей терминологии для нежелательных явлений версии 4.0 (CTCAE v4.0). Незапланированные посещения имели место при рецидивах, НЯ и посещениях для раннего прекращения исследования. При каждом посещении проверялись лабораторные анализы по мониторингу безопасности (общий анализ крови и панели почек и печени). Колумбийская шкала оценки степени тяжести суицида (C-SSRS) применялась при каждом посещении. Совет по безопасности и мониторингу данных, состоящий из 3 человек, собирается ежегодно.

Размер выборки, рандомизация и слепой анализ.

Исследование было проведено для сравнения основного результата, PCBV, по оценке Altmann et al. ²³ с использованием стандартного отклонения 1,51 для атрофии SIENA, 2-летней продолжительности исследования с ежегодными МРТ и величины эффекта 60%. Размер выборки 23 на руку был необходим для получения 80% мощности и значимости p <0,05. Прогнозируемый набор был увеличен с учетом отсева. Неслепой исследовательский фармацевт назначил участников на LA или плацебо в соотношении 1: 1 после рандомизации с перестановкой блоков, основанной на EDSS ≤4.5 или> 4.5. ¹³ Весь остальной исследовательский персонал не знал назначения лечения. МРТ были помечены дополнительными случайно сгенерированными числами во время анализа, чтобы еще больше снизить риск систематической ошибки. Статистический анализ проводился слепым статистиком по первичным, вторичным критериям и критериям безопасности.

Статистические методы.

В анализе «намерение лечиться» (ITT) использовались линейные смешанные модели для оценки влияния LA на среднегодовое значение PCBV. Смешанные модели использовались для корректировки серийной корреляции внутри участников, для учета повторных измерений продольного дизайна и для включения всех участников исследования.Модели были скорректированы с учетом возраста, пола и продолжительности рассеянного склероза участников с помощью стандартной диагностики модели для выявления чрезмерно влиятельных точек воздействия. Множественные сравнения были учтены с использованием поправки Холма-Сидака в пределах областей результатов исследования. Точки выбросов были идентифицированы с помощью стандартных диагностических методов с использованием комбинаций рычагов влияния точек данных, индивидуальных остатков и расстояния Кука для выявления чрезмерно влиятельных наблюдений и исключения их из базового анализа и анализа двухлетних изменений.Данные участников, принимавших уменьшенную дозу LA (n = 2), не обрабатывались по-разному при анализе результатов, поскольку их ограниченное количество делало оценку подгруппы трудноразрешимой. Результаты смешанной модели представлены как скорости изменения с дисперсией, представленной стандартными ошибками оценок коэффициентов (SEE). Был проведен апостериорный анализ оценки первичного исхода, добавив в модель базовый объем всего мозга и исходный объем Т2-поражения в качестве ковариант. Все анализы были выполнены с использованием R 3.3.1 с дополнительной утилитой из пакета lme4. ^24,25

РЕЗУЛЬТАТЫ

Из 54 согласившихся и рандомизированных 51 участник (27 LA и 24 плацебо) приняли по крайней мере 1 дозу исследуемого препарата и были включены в анализ ITT (рисунок 1). 46 участников завершили исследование (22 LA и 24 плацебо). 5 выбывших из когорты LA были вызваны клаустрофобией во время МРТ, продолжительной тошнотой и рвотой, которые исчезли после прекращения LA, и значительным сопутствующим заболеванием (рак простаты, протеинурия и ухудшение функции почек).Поскольку выбывший с клаустрофобией не завершил исходную МРТ, размер ITT-выборки LA когорты для PCBV составил 26 (рис. 1).

Исходные демографические данные представлены в таблице 1. Когорты LA и контрольные группы были в целом сопоставимы по возрасту, полу, продолжительности РС, образованию и инвалидности. Не было значительных различий между группами лечения (все p > 0,05). В таблице 2 представлены исходные значения основных показателей результатов исследования по группам исследования.Когорта LA имела значительно больший исходный объем всего мозга ( p = 0,004) и общий объем глубокого серого вещества ( p = 0,042). Контрольная группа имела больший исходный нормализованный объем Т2-поражений.

Исходные демографические и клинические характеристики участников исследования в зависимости от лечения (n = 51)

Различия на исходном уровне между показателями результатов исследования (среднее, стандартное отклонение)

Соответствие исследуемому препарату составило 87% по количеству таблеток. Два участника принимали вдвое меньшую дозу LA в соответствии с протоколом для большей части исследования, по одному от гастрита и повышенного уровня щелочной фосфатазы.

Частота атрофии головного мозга и вторичные результаты визуализации.

Через 2 года участники, принимавшие LA, имели значительно меньшее годовое значение PCBV (-0,21% [SEE 0,14]), чем контрольная группа (-0,65% [SEE 0,10], p = 0,002), при этом наблюдалась величина положительного эффекта лечения LA. повышение скорости атрофии всего мозга на 0,44 ± 0,29% (95% доверительный интервал [ДИ] 0,157–0,727). Это изменение соответствует 68% снижению скорости атрофии головного мозга в группе LA по сравнению с плацебо (рисунок 2A, таблица 3).В апостериорном анализе исходный объем всего мозга не был связан с какими-либо другими контролирующими переменными (возраст, пол и продолжительность заболевания), а также не повлиял на различия в PCBV между когортами исследования. Аналогичным образом, изменение объема поражения Т2 за период исследования не было связано ни с одной из корректирующих переменных, включая исходный объем поражения Т2. Показаны отдельные двухлетние изменения PCBV для LA (-0,45% [SEE 0,71]) по сравнению с контролем (-1,31% [SEE 1,10], p = 0,001) у завершивших исследование (рис. 2B).Сегментация мозга и ОКТ не выявили значительных различий в среднегодовых темпах изменений между группами исследования; увеличение объема Т2-поражения в когорте LA было почти, но не значительно отличалось от контроля (414,6 [SEE 201,2] против 33,1 [SEE 134,7], p = 0,058, таблица 3).

Годовое процентное изменение объема мозга (PCBV) между LA и плацебо-когортами с использованием анализа намерения лечить 51 участника с вторично прогрессирующим РС (A).Двухлетний PCBV от завершивших исследование показан и демонстрирует значительно меньшее PCBV в когорте LA (n = 22, −0,45% [SEE 0,71]), чем в контроле (n = 24, −1,31% [SEE 1.10], p = 0,001, В). LA = липоевая кислота; SEE = стандартные ошибки оценки коэффициента.

Клинические исходы.

Среди клинических исходов когорта LA продемонстрировала улучшение T25FW, которое почти, но не значительно отличалось от контроля (-0,535 [SEE 0,358] против 0,137 [SEE 0,247], 95% ДИ -1.37 до 0,03, p = 0,060).

АЕ.

AE представлены в таблице e-1. Количество НЯ было одинаковым между ЛА и контрольной группой (80 и 68, соответственно, p = 0,87), с 6 серьезными НЯ (SAE) в каждом. Больше нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта (14 [SD 17%] против 2 [SD 3%], p = 0,007) и меньшее количество падений (12 [SD 15%] против 26 [SD 38%], p = 0,03). когорта Лос-Анджелеса. У одного участника ЛА развилась не вызывающая беспокойства везикулярная сыпь, аналогичная ранее описанной, которая исчезла в течение 6 недель после завершения исследования. ¹¹ Один рецидив произошел в каждой исследуемой когорте, ни один из которых не повлиял на последующее обследование EDSS. Не было нового суицидального поведения по C-SSRS, и не было различий между когортами по новым лабораторным отклонениям; однако только те, кто принимал LA, требовали снижения дозы согласно протоколу (n = 2). Мысль о СНЯ, непосредственно связанных с ЛП, была рвотой и обезвоживанием, требующими госпитализации, которые исчезли после прекращения ЛП. Заметными НЯ, приведшими к выбыванию, были один пациент с ЛА с исходным повышением креатинина, прогрессирующим до почечной недостаточности, и другой с протеинурией из-за гломерулонефрита.Консультирующий нефролог не подумал, что 2 НЯ были связаны с ЛП. НЯ более подробно рассматриваются в Приложении e-2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Это двухлетнее, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое пилотное исследование продемонстрировало значительное снижение показателя первичного исхода годовой скорости атрофии всего мозга по SIENA у людей с ВПРС, принимающих перорально в дозе 1200 мг в день. ЛА. На годовое сокращение PCBV не повлияли ни запланированные ковариаты возраста, пола и продолжительности заболевания, ни постфактумные добавления базовых объемов головного мозга и Т2-поражений.Было высказано предположение об улучшении времени T25FW, и в когорте LA было меньше падений. В целом ЛА была безопасна, хорошо переносилась, имела высокую комплаентность и не имела неожиданных вредных НЯ или СНЯ, связанных с ЛП.

Снижение частоты атрофии головного мозга выгодно отличается от масштабного исследования 3 фазы окрелизумаба (n = 731), в котором сообщается о снижении частоты атрофии всего мозга на 17,5% в течение 120 недель. ²⁶ В отличие от настоящего исследования, исследование окрелизумаба включало только пациентов с первичным прогрессирующим РС с большим количеством мужчин (51% против 39%), которые были моложе (45 против 59 лет), имели более короткую продолжительность заболевания (6.5 против 30 лет) и меньшая степень инвалидности (EDSS 4,7 против 5,4). Исследование окрелизумаба ограничивалось включением пациентов с воспалительной ЦСЖ, характеристика, не оцениваемая в этом исследовании. Другие испытания модифицирующей болезнь терапии в популяциях прогрессирующего РС не продемонстрировали достоверных изменений в показателях атрофии головного мозга или не использовали этот показатель результатов. ^{27, -, 29}

Снижение PCBV было для оценки всего мозга SIENA, надежного метода измерения продольной атрофии на основе регистрации. ³⁰ Сегментация мозга не выявила специфических отделов мозга, ответственных за разную частоту атрофии.Одно из объяснений состоит в том, что расчет размера выборки был основан на SIENA, а не на методах сегментации, методах, которые дают неоднородные результаты и требуют более крупных выборок. ³⁰ Сегментированные объемы могут быть более подвержены физиологическим факторам, включая состояние гидратации и расположение, чем измерения всего мозга. ³¹ В качестве альтернативы снижение PCBV может происходить из-за эффекта, общего для всех тканей мозга. Повторение исследования на более крупной выборке прояснит природу эффектов атрофии ЛА.

Предположение о большем увеличении объема Т2-поражения в когорте ЛП имеет неопределенное значение. Увеличение может быть реальным и, таким образом, представлять потенциальные вредные эффекты LA, может представлять физиологические изменения, не связанные с MS, может быть результатом проблем с качеством постобработки MR или может не отличаться от плацебо. ¹⁵ Требуется дальнейшая оценка.

В целом, LA был безопасен и хорошо переносился. Лабораторные отклонения ограничивались бессимптомным повышением щелочной фосфатазы, которое улучшалось после прекращения LA.Хотя не было никаких неожиданных НЯ или СНЯ, явно связанных с ЛП, случаи почечной недостаточности и гломерулонефрита вызывают беспокойство. Предыдущие исследования с LA не сообщили о нарушении функции почек. ^{9, -, 11} Тем не менее, более тщательный мониторинг функции почек является целесообразным для будущих исследований ЛА и предполагает осторожность в рекомендации этой дозы ЛА перед дальнейшими оценками.

Потенциальным искажающим фактором исследования, о котором авторы не знали при планировании исследования, было присутствие кверцетина (8.6 мг в день) в качестве плацебо. Кверцетин, как и другие биофлавоноиды, биологически активен. Хотя существуют противоречивые сообщения, Van Beek et al. обнаружили, что 10 мг кверцетина перорально в день усиливают воспаление и усугубляют активный и пассивный EAE у мышей. Это повышает вероятность того, что в настоящем исследовании кверцетин мог ухудшить контроль и преувеличить эффекты LA. ³² Расчетная доза для человека, аналогичная исследованию Ван Бика, составляет 2 г, что на порядки больше, чем в капсулах с плацебо. ³³ Таким образом, хотя маловероятно, что это повлияет на результаты настоящего исследования, в будущих исследованиях следует избегать применения кверцетина, чтобы исключить эту возможность.

Другие ограничения исследования связаны, прежде всего, с небольшим размером выборки этого пилотного исследования, что, как уже обсуждалось, приводит к потере возможностей для выявления клинических и вторичных результатов визуализации. В свете этого очень сильное снижение скорости атрофии головного мозга можно рассматривать со скептицизмом, хотя сопоставимая скорость атрофии в контрольной группе с другими необработанными когортами SPMS подтверждает полученные данные. ^23,34 Базовые различия в объеме мозга или объеме поражения Т2 существовали между когортами исследования; однако апостериорный анализ не выявил влияния этих различий на результаты исследования. Увеличение размера выборки в будущих исследованиях должно исправить базовые дисбалансы. Наконец, поскольку контрастное вещество не использовалось, исходные и текущие различия в воспалительной активности на МРТ неизвестны.

Это двухлетнее пилотное исследование 1200 мг ежедневно LA продемонстрировало значительное снижение PCBV у пациентов с SPMS по сравнению с контрольной группой.Небольшой размер выборки не позволил выявить клиническую пользу, хотя высказывались предположения об уменьшении времени ходьбы и значительном уменьшении числа падений. Хотя ЛА в целом безопасен и хорошо переносится, в будущих исследованиях необходимо установить клинические преимущества и изучить механизмы действия ЛА при прогрессирующем РС.

ВКЛАД АВТОРА

Ребекка Испания: концепция и дизайн исследования, надзор за исследованием, анализ и интерпретация данных, составление рукописи и полученное финансирование. Кэтрин Пауэрс: сбор данных, анализ МРТ и составление рукописи.Чарльз Мурчисон: статистический анализ и составление рукописи. Элизабет Хериза: сбор данных и обзор рукописи. Kimberly Winges: обзор OCT, анализ данных и интерпретация данных, а также обзор рукописи. Виджайши Ядав, Мишель Камерон и Эдвард Ким: сбор данных. Фэй Хорак: концепция исследования и рецензия на рукопись. Джек Саймон: концепция исследования и дизайн, анализ и интерпретация данных, а также составление рукописи. Деннис Бурдетт: концепция и дизайн исследования, руководство исследованием, анализ и интерпретация данных, а также критический обзор рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

При поддержке Департамента по делам ветеранов (B7493-W, Р. Испания), NIH (UL1TR000128).

РАСКРЫТИЕ ИНФОРМАЦИИ

R. Испания получила исследовательскую поддержку от Департамента по делам ветеранов, Орегонского института клинических и трансляционных исследований, Системы здравоохранения Портленда, Орегонского университета здоровья и науки, Национального общества рассеянного склероза, Фонда Конрада Хилтона, Фонда медицинских исследований Орегона, и гонка, чтобы стереть MS. К. Пауэрс, К. Мерчисон, Э. Хериза, К.Winges не сообщают о раскрытии информации. В. Ядав консультировал компании Bayer, Biogen и Teva MS; работал в бюро спикеров Novartis и Biogen; и получил исследовательскую поддержку от Biogen, Департамента по делам ветеранов, Фонда Макдугалла, Национального общества РС, Фонда Race to Erase MS и NIH. М. Кэмерон получил финансирование на поездку от Консорциума центров рассеянного склероза и VA Portland Research; является членом редакционной коллегии журнала Journal of Hand Therapy ; редактор раздела Nature Reviews Neuroscience ; получает гонорары за публикацию от Elsevier; консультировал ReWalk Corporation и Adamas Corporation; получил исследовательскую поддержку от Департамента по делам ветеранов, Службы исследований и разработок в области реабилитации, Национального общества рассеянного склероза и Фонда парализованных ветеранов Америки.Э. Ким входила в научно-консультативный совет Genzyme и Teva и получала исследовательскую поддержку от Национального общества рассеянного склероза. Ф. Хорак входил в состав научного консультативного совета Общества РС и NIH NCMRR; получал финансирование командировок и / или гонорары докладчикам за лекции и образовательные мероприятия, не финансируемые промышленностью; работал помощником редактора в Gait and Posture , Cerebellum и Encyclopedia for Neuroscience ; входил в состав редакционной коллегии журнала Journal of Biomechanics , Frontiers in Neurology и Frontiers in Neuro-Otology ; имеет патенты на устройство для поддержания баланса и координации движений, Инструментальную систему подвижности для объективного измерения баланса и походки; получает гонорары за публикацию от McGraw-Hill; получил исследовательскую поддержку от MRF NCI, NIH, SBIR, MRF, MRF Mentor, STTR, NIA, NCI, NIH / CCHD / NCMRR MJFF, NMSS, Национального института неврологических расстройств и инсульта, наставника NMSS и MRAA армии США; и владеет акциями APDM, Inc.Дж. Саймон входил в состав научно-консультативного совета компании Biogen; получает гонорары за публикацию от Cambridge University Press; и консультировал Biogen, благотворительный фонд Guthy-Jackson. Д. Бурдетт получил финансирование на поездку от Национального общества рассеянного склероза, Консорциума центров рассеянного склероза и Парализованных ветеранов Америки; входит в редколлегию журнала Neurology ; имеет патенты на лечение рассеянного склероза циклическими пептидными производными циклоспорина и тромиметическими препаратами для стимуляции ремиелинизации при рассеянном склерозе; консультировали Magellan Health, Best Doctors, Inc.; и получил исследовательскую поддержку от Национального общества рассеянного склероза. Посетите Neurology.org/nn для получения полных форм раскрытия информации.

ПОДТВЕРЖДЕНИЕ

Pure Encapsulations, Садбери, Массачусетс, предоставили липоевую кислоту и плацебо. Авторы благодарят участников исследования, доктора Элизабет Херизу за руководство исследованием, а также членов совета по безопасности и мониторингу данных за ежегодные обзоры данных.

Сноски

• Информация о финансировании и раскрытие информации приведены в конце статьи.Посетите Neurology.org/nn для получения полных форм раскрытия информации. Плата за обработку статьи была оплачена авторами.

• Дополнительные данные на Neurology.org/nn

• Получено 7 марта 2017 г.
• Принято в окончательной форме 15 мая 2017 г.

• Авторские права © 2017 Автор (ы). Опубликовано Wolters Kluwer Health, Inc. от имени Американской академии неврологии.

Сульфорафан и α-липоевая кислота усиливают экспрессию π-класса глутатион-S-трансферазы посредством активации c-Jun и Nrf2 | Журнал питания

Аннотация

Антиканцерогенное действие содержащихся в пище сероорганических соединений частично объясняется их модуляцией активности и экспрессии ферментов детоксикации фазы II.Наши предыдущие исследования показали, что аллилсульфиды чеснока усиливают экспрессию π-класса глутатион- S -трансферазы (GSTP) через активаторный белок-1 путь. Здесь мы исследовали модулирующий эффект сульфорафана (SFN) и α-липоевой кислоты (LA) или дигидролипоевой кислоты (DHLA) на экспрессию GSTP в клетках печени крыс клона 9. Клетки обрабатывали LA или DHLA (50–600 мк моль / л) или SFN (0,2–5 мк моль / л) в течение 24 ч. Иммуноблоттинг и ПЦР в реальном времени показали, что SFN, LA и DHLA дозозависимо индуцируют экспрессию белка и мРНК GSTP.По сравнению с индукцией сероорганическим соединением чеснока диаллилтрисульфидом (DATS) эффективность была в следующем порядке: SFN> DATS> LA = DHLA. Увеличение активности фермента GSTP в клетках, обработанных 5 μ моль / л SFN, 50 μ моль / л DATS и 600 μ моль / л LA и DHLA, составило 172, 75, 122 и 117%. соответственно ( P <0,05). Репортерный анализ показал, что энхансер I GSTP (GPEI) необходим для индукции GSTP сероорганическими соединениями.Анализ сдвига в геле с электромобильностью показал, что связывание ДНК GPEI с ядерными белками достигает максимума через 0,5–1 ч после обработки SFN, LA и DHLA. Анализ супер-сдвига показал, что факторы транскрипции c-jun и ядерный фактор, связанный с эритроидом-2, фактор 2 (Nrf2) были связаны с GPEI. Эти результаты предполагают, что SFN и LA в окисленной или восстановленной форме активируют транскрипцию гена GSTP путем активации связывания c-jun и Nrf2 с энхансерным элементом GPEI.

Введение

Эпидемиологические исследования показали, что люди, которые потребляют большое количество овощей и фруктов в своем рационе, могут снизить риск рака (1,2).Частично это можно объяснить высоким содержанием многочисленных фитохимических веществ в овощах и фруктах, включая полифенольные соединения, каротиноиды и сероорганические соединения (2–5). Накопленные данные подтверждают, что аллилсульфиды чеснока, полученные из аллиина, и изотиоцианаты семейства крестоцветных защищают животных от различных химических канцерогенов (1,6). Эту химиопрофилактику можно частично объяснить способностью этих фитохимических веществ модулировать активность и экспрессию генов детоксикационных ферментов фазы II (7–9).

Глутатион S -трансфераза (GST) ⁵ — это фермент фазы II, который катализирует конъюгацию глутатиона с различными электрофильными ксенобиотиками и облегчает их выведение. У млекопитающих 8 изоферментов GST, включая A (α), M ( μ ), O (ω), P (π), S (σ), T (θ), Z (ζ) и K (κ). , были идентифицированы (10). В последнее время возрос интерес к физиологическим свойствам π-класса GST (GSTP) не только из-за его функции в детоксикации лекарств, но и из-за его возможной роли в трансформации клеток и канцерогенезе (11,12).Активность GSTP была использована для оценки эффективности химиопрофилактических агентов при раке, вызванном бензо [ a ] пиреном (13). Важность GSTP в профилактике рака дополнительно подтверждается тем фактом, что рак кожи, вызванный 7,12-диметилбензантраценом, значительно повышен у GSTP-нулевых мышей (14). Два усиливающих элемента были идентифицированы в 5′-восходящей области гена GSTP и были названы GSTP-энхансером I (GPEI, –2,5 т.п.н.) и II (GPEII, –2,2 т.п.н.) (15). GPEI содержит 2 форбол-12- O -тетрадеканоат-13-ацетат-подобных элементов (TRE) -подобных элементов, которые считаются необходимыми для базальной и индуцибельной экспрессии GSTP (16).Усилители экспрессии GSTP регулируются множеством факторов, включая активаторный белок-1 (AP-1), который, как известно, является гетеродимером или гомодимером, состоящим из продуктов c-Jun и c-fos (17). Поскольку TRE-подобные элементы в GPEI имеют общие последовательности, сходные с последовательностями элемента антиоксидантного ответа (ARE), фактор 2, связанный с ядерным фактором эритроид-2 (Nrf2), также рассматривается как возможный транскрипционный фактор, который связывается с GPEI (18).

Сульфорафан (SFN), изотиоцианатное соединение, богатое овощами семейства крестоцветных, продемонстрировало свою высокую эффективность в обеспечении защиты от химически индуцированного рака на животных моделях (6,9).Эта цитозащита с помощью SFN может быть объяснена его активацией апоптоза, а также его эффективной индукцией экспрессии ферментов детоксикации фазы II и антиоксидантных ферментов, включая α-класс GST (GSTA), μ класс GST (GSTM), NAD ( P) H-зависимые хинон оксидоредуктазы 1 (NQO1) и γ-глутамилцистеинсинтаза (9,19,20). Недавно было показано, что повышение экспрессии генов цитопротекторных генов с помощью SFN зависит от Nrf2-ARE (21,22).

α-Липоевая кислота (LA) — тиоловый антиоксидант, содержащийся в овощах, включая брокколи, шпинат и помидоры (23).LA и его восстановленная форма, дигидролипоевая кислота (DHLA), не только действуют как мощные поглотители свободных радикалов и хелаторы металлов (24), но также участвуют в переработке других клеточных антиоксидантов, включая витамин C, витамин E и глутатион (25). Недавно сообщалось, что экспрессия нескольких ферментов фазы II модулируется LA и DHLA. В клетках лейкемии человека HL-60 и клетках нейробластомы SH-SY5Y LA эффективна в повышении регуляции транскрипции гена NQO1 (26,27). Индукция экспрессии GSTA2 с помощью ЛА, вероятно, связана с фосфатидилинозитол-3-киназным путем (8).Что касается GSTP, однако, неясно, индуцируют ли LA и DHLA экспрессию этого фермента детоксикации.

Недавно мы сообщили, что чесночное масло и два его основных серорганических компонента, диаллилдисульфид и диаллилтрисульфид (DATS), могут эффективно регулировать экспрессию мРНК GSTP и белка. Более того, GPEI необходим для индукции этого фермента фазы II (28-30). В дополнение к аллилсульфидам чеснока, мы также были заинтересованы в изучении того, эффективны ли сероорганические соединения, не полученные из чеснока, в повышающей регуляции экспрессии GSTP и возможных вовлеченных факторов транскрипции.Поэтому в настоящем исследовании мы изучили модулирующий эффект SFN, LA и DHLA на экспрессию GSTP в клетках клона 9 печени крысы. Кроме того, мы сравнили относительную эффективность индукции на GSTP DATS, LA, DHLA и SFN.

Материалы и методы

Материалы.

Все остальные химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich, если не указано иное. SFN и DATS были получены от LKT Laboratories. Среда RPMI-1640 и раствор пенициллин-стрептомицин были получены из лаборатории Gibco.Ингибитор РНКазы, олиго dT и ОТ вируса мышиного лейкоза Молони были приобретены у Promega. Праймер для GSTP и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) был получен от Applied Biosystems. Фетальная бычья сыворотка была приобретена у Hyclone. Тризол и липофектамин заказывались в Invitrogen.

Культура клеток.

Clone 9, которые были получены из печени нормальной крысы, были получены из Центра сбора и исследования биоресурсов. Их выращивали в среде RPMI-1640 с добавлением 10 ммоль / л HEPES, 100 kU / л пенициллина, 100 мг / л стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ и 95% воздуха.Для всех исследований использовали клетки между пассажами 4 и 10. Клетки высевали на 35-миллиметровые пластиковые чашки для культивирования тканей (Falcon) при плотности 2,5 × 10 ⁵ клеток / чашку и оставляли для роста в течение 24 часов. Затем добавляли свежую культуральную среду, содержащую различные концентрации DATS, LA, DHLA или SFN, и клетки инкубировали в течение указанного времени. Клетки, обработанные только 0,1% диметилсульфоксидом (ДМСО), использовали в качестве контроля.

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг.

Клетки дважды промывали холодным PBS и затем собирали в 300 мкл л 20 ммоль / л калий-фосфатного буфера (pH 7,0). Супернатанты центрифугировали при 10,000 × g в течение 30 мин при 4 ° C. Концентрации белка определяли с помощью набора реагентов для анализа белка Coomassie Plus (Pierce Chemical). Четыре микрограмма клеточных белков из каждого образца наносили на 10% SDS-полиакриламидные гели и электрофоретически переносили на поливинилиденфторидные мембраны (Millipore).Мембраны блокировали при 4 ° C в течение ночи с помощью 50 г / л обезжиренного сухого молочного раствора, а затем инкубировали с первичными антителами против GSTP (Transduction Laboratories), GSTA, GSTM (все от Oxford Biomedical Research), NQO1, c-Jun, phospho. -c-Jun, Nrf2 (все от Santa Cruz Biotechnology) или β-актин в течение 70 минут при комнатной температуре, а затем инкубировали с козьим антикроличьим IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена, козьим антимышиным IgG (все от Perkinelmer Life Sciences ) или вторичное антитело кролика против козьего IgG (R&D Systems).Полосы визуализировали с использованием набора для усиленной хемилюминесценции (Perkin-Elmer Life Science).

ПЦР в реальном времени.

Общая РНК была экстрагирована с использованием реагента Trizol. Всего 0,8 мкг г РНК использовали для синтеза первой кДНК. RT проводили в программируемом термоциклере и проводили в 20 мкл л, содержащих 25 ммоль / л Трис-HCl (pH 8,3), 50 ммоль / л (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0,3 % β-меркаптоэтанола, 0.1 г / л бычьего сывороточного альбумина, 5 ммоль / л MgCl ₂ , 1 ммоль / л каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 2,5 ед. Ингибитора РНКазы и 2,5 ммоль / л олиго-dT и RT вируса мышиного лейкоза Молони. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 цикла при 42 ° C 15 мин, 99 ° C 5 мин и 4 ° C 10 мин. ПЦР в реальном времени проводили в детекторе последовательностей ABI Prism 7000 (Applied Biosystems), добавляя 5 мкл л кДНК, 10 мкл л мастер-смеси, 5 мкл мкл ddH ₂ O и 1 мкл. л GSTP (Rn02770492_gh) и праймера GAPDH (Mm99999915_gl) в каждую микролунку.Реакцию проводили по следующей программе: 1 цикл при 50 ° C в течение 2 минут и 95 ° C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты. Сравнительный метод Ct (порогового цикла) был использован для определения относительного количества мРНК GSTP (31). Метод ΔCt использовался для количественной оценки амплифицированных генных мишеней в соответствии с протоколом производителя (Applied Biosystems). Вкратце, количество циклов, необходимых для достижения порогового уровня логарифмической флуоресценции (значение Ct), было нормализовано к значению Ct гена GAPDH в каждом образце.Относительное значение экспрессии для гена GSTP было рассчитано как 2 ^{— ΔΔCt} , где ΔΔCt представляет собой разность Ct между геном GSTP и геном GAPDH (ΔCt = Ct _{, ген GSTP} — Ct _{, ген GAPDH} ; ΔΔCt = ΔCt _{GSTP. ген} — калибратор ΔCt ).

Анализ активности ферментов.

GST измеряли с использованием этакриновой кислоты в качестве субстрата из-за ее лучшей селективности по отношению к изоферменту π-класса (32). Вкратце, реакционная смесь в конечном объеме 1 мл содержала 100 ммоль / л калий-фосфатного буфера (pH 6.5), 0,5 ммоль / л глутатиона, 0,2 ммоль / л этакриновой кислоты и соответствующее количество общих белков. Образующийся конъюгат этакринат-глутатион измеряли при 270 нм. Активность GST измеряли с использованием 1-хлор-2,4-динитробензола, тогда как активность NQO-1 определяли с использованием 2,6-дихлориндофенола в качестве субстрата (33).

Экспрессионные и репортерные конструкции.

Репортер pTA-GSTP Luc с промоторной областью гена GSTP был сконструирован, как описано ранее (28).Фрагмент гена GSTP размером 2,7 т.п.н. вставляли в сайт Mlu I и Nhe I вектора pTA-SEAP / Luc (Clontech). В дополнение к полноразмерной конструкции (Luc-2713) были созданы 2 конструкции с делециями от -2713 до -2605 п.н. (Luc-2604) и от -2713 до -2376 п.н. (Luc-2375). Репортер с фрагментом GPEI был сконструирован путем лигирования сегмента от -2713 до -2605 п.н. в вектор pTA-SEAP / Luc и был обозначен как Luc-GPE.

Переходная трансфекция и анализ активности люциферазы.

Clone 9 высевали с плотностью 2,5 × 10 ⁵ клеток на 35-миллиметровые пластиковые чашки для тканевых культур и чашки инкубировали до достижения 70% слияния. Клетки временно трансфицировали в течение 5 часов 0,1 мкл г векторов pTA-GSTP Luc с помощью липофектаминового реагента, а затем подвергали воздействию каждого из сероорганических соединений в течение дополнительных 15 часов. Затем клетки дважды промывали PBS и лизировали в 100 мкл л лизирующего буфера. Люциферазную активность измеряли с использованием реагента для анализа люциферазы (Clontech) в соответствии с инструкциями производителя.Активность люциферазы каждого образца корректировали на основе активности β-галактозидазы, которую измеряли при 420 нм с O -нитрофенил β-D-галактопиранозидом в качестве субстрата. Значение для клеток, обработанных только носителем ДМСО, было расценено как 1.

Анализ сдвига в геле электромобильности.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) был проведен в соответствии с нашим предыдущим исследованием (29). Клетки дважды промывали холодным PBS, а затем соскребали с чашек PBS.Гомогенаты клеток центрифугировали при 2000 × g в течение 5 мин. Осадок клеток давали набухнуть на льду в течение 15 мин после добавления 200 мкл л гипотонического буфера, содержащего 10 ммоль / л HEPES, 10 ммоль / л KCl, 1 ммоль / л MgCl ₂ , 1 ммоль / л ЭДТА, 0,5 ммоль / л дитиотреитола (DTT), 0,5% Nonidet P-40, 4 мг / л лейпептина, 20 мг / л апротинина и 0,2 ммоль / л фенилметилсульфонилфторида. После центрифугирования при 6000 × g в течение 15 мин осадки, содержащие сырые ядра, ресуспендировали в 50 мкл л гипертонического буфера, содержащего 10 ммоль / л HEPES, 400 ммоль / л KCl, 1 ммоль / л MgCl ₂ , 1 ммоль / л ЭДТА, 0.5 ммоль / л DTT, 10% глицерин, 4 мг / л лейпептина, 20 мг / л апротинина и 0,2 ммоль / л фенилметилсульфонилфторида и инкубировали еще 30 мин на льду. Затем ядерные экстракты получали центрифугированием при 10,000 × g в течение 15 мин и замораживали при -80 ° C до проведения EMSA.

Набор LightShift Chemiluminescent EMSA (Pierce Chemical) и синтетический биотин-меченный двухцепочечный консенсусный олигонуклеотид GPEI (прямой: 5′-AGTAGTCAGTCACTATGATTCAGCAAC-3 ‘; обратный: 5’-GTTGCTGAATCATAGTGACT’GACT) были использованы для измерения эффекта ACT-GACT). сероорганические соединения на активность связывания ядерного белка GPEI с ДНК.Немеченый двухцепочечный GPEI (200 нг) и мутантный двухцепочечный олигонуклеотид также использовали для подтверждения специфического связывания. Два микрограмма ядерного белка, поли (dI-dC) и меченного биотином двухцепочечного олигонуклеотида GPEI смешивали со связывающим буфером до конечного объема 20 мкл л и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Комплекс ядерный белок-ДНК разделяли электрофорезом в 6% геле трисборной кислоты-ЭДТА-полиакриламид и затем электропереносили на нейлоновую мембрану Hybond-N ⁺ (GE Healthcare).Мембрану обрабатывали стрептавидин-пероксидазой хрена, и полосы ядерный белок-ДНК проявляли с использованием набора для усиленной хемилюминесценции. В анализе супер-сдвига ядерный белок инкубировали с 1 мкл г моноклонального антитела против c-Jun в течение 30 мин после реакций связывания и подвергали электрофорезу, как описано выше.

Иммунопреципитация.

Всего 15 мкМ г ядерных белков сначала инкубировали с 1 мкг мкг антитела против Nrf2 в течение ночи при 4 ° C.Клетки смешивали с шариками протеин A-сефароза 0,1 г / л в течение 1 ч при 4 ° C. Иммунопреципитированные комплексы осаждали центрифугированием при 16000 × g в течение 2 мин при 4 ° C. Осадок 5 раз промывали 1 мл IP-буфера (40 ммоль / л Трис-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 150 ммоль / л NaCl, 5 ммоль / л EGTA, 1 ммоль / л DTT, 1 ммоль. / Л фенилметилсульфонилфторида, 1 мг / л апротинина, 1 мг / л лейпептина, 20 ммоль / л фторида натрия, 1 ммоль / л ортованадата натрия) и затем подвергали электрофорезу с последующим вестерн-блоттингом.

Статистический анализ.

Статистический анализ выполнялся с помощью имеющегося в продаже программного обеспечения (SAS Institute). Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа, а значительная разница между лечебными средствами оценивалась с помощью теста Тьюки. Различные конструкции с делециями в одной обработке анализировали с помощью отдельного дисперсионного анализа. Значение P <0,05 считалось значимым.

Результаты

Экспрессия белка GSTP.

В данном исследовании клетки Clone 9 инкубировали с 50 мкл моль / л DATS, 50-600 мк моль / л LA или DHLA или 0,2–5 мкл моль / л SFN в течение 24 часов. Чтобы гарантировать отсутствие цитотоксичности в результате обработки этими сероорганическими соединениями, мы сначала провели анализ жизнеспособности клеток. Метод с 3- (4,5-диметилтиазол-2ил) -2,5-дифенилтетразолийбромидом показал, что каждое из сероорганических соединений, испытанных при концентрациях, указанных выше, приводило к жизнеспособности клеток> 95% (данные не показаны).

Иммуноблоттинг показал, что LA, DHLA и SFN дозозависимо индуцировали экспрессию белка GSTP в клетках клона 9 (рис. 1). LA и DHLA при 600 μ моль / л вызывали повышение уровня GSTP в 5,4 и 4,8 раза соответственно по сравнению с контрольными клетками ( P <0,05). Эта индукция была аналогична индукции, отмеченной в клетках, обработанных 50 мкл моль / л DATS. Интересно отметить, что SFN продемонстрировала наибольшую эффективность в повышении экспрессии GSTP среди всех протестированных сероорганических соединений.8,1-кратная индукция экспрессии GSTP была достигнута при воздействии на клетки 5 мкМ моль / л SFN.

РИСУНОК 1

Уровни белка GSTP, индуцированные сероорганическими соединениями. Клетки культивировали только с 0,1% ДМСО (-) или с различными концентрациями DATS, LA, DHLA или SFN в течение 24 часов. Белок GSTP определяли методом иммуноблоттинга. Всего для электрофореза использовали 4 мкл г белка для каждого образца. Изменения экспрессии белка GSTP измеряли денситометрией.Данные были нормализованы по экспрессии β-актина. Уровень в контрольных ячейках был установлен на 1. Каждое значение представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение, n = 4. Средние значения без общей буквы отличаются, P <0,05.

РИСУНОК 1

Уровни белка GSTP, индуцированные сероорганическими соединениями. Клетки культивировали только с 0,1% ДМСО (-) или с различными концентрациями DATS, LA, DHLA или SFN в течение 24 часов. Белок GSTP определяли методом иммуноблоттинга. Всего для электрофореза использовали 4 мкл г белка для каждого образца.Изменения экспрессии белка GSTP измеряли денситометрией. Данные были нормализованы по экспрессии β-актина. Уровень в контрольных ячейках был установлен на 1. Каждое значение представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение, n = 4. Средние значения без общей буквы отличаются, P <0,05.

Сероорганические соединения влияют на уровень и активность мРНК GSTP.

С помощью ПЦР в реальном времени увеличение уровней мРНК GSTP соответствовало изменениям, отмеченным в экспрессии белка. DATS вызвал ошибку 1.1-кратное увеличение уровня мРНК GSTP по сравнению с контрольными клетками ( P <0,05). Наблюдалась дозозависимая индукция мРНК GSTP в клетках, обработанных LA, DHLA и SFN. Увеличение экспрессии, вызванное SFN, было выше, чем вызванное LA или DHLA ( рис. 2 A ). Опять же, активность фермента по отношению к этакриновой кислоте дозозависимо увеличивалась под действием LA, DHLA и SFN (рис. 2B).

РИСУНОК 2

Экспрессия мРНК и ферментативная активность GSTP, индуцированная сероорганическими соединениями.Клетки обрабатывали одним ДМСО (-) или различными концентрациями DATS, LA, DHLA или SFN в течение 24 часов. ( A ) ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК GSTP. Уровень мРНК GSTP в контрольных клетках принимали за 1. ( B ) активность GST, определяемую с использованием этакриновой кислоты в качестве субстрата. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n = 3–4. Группы без общей буквы различаются, P <0,05.

РИСУНОК 2

Экспрессия мРНК и ферментативная активность GSTP, индуцированная сероорганическими соединениями.Клетки обрабатывали одним ДМСО (-) или различными концентрациями DATS, LA, DHLA или SFN в течение 24 часов. ( A ) ПЦР в реальном времени экспрессии мРНК GSTP. Уровень мРНК GSTP в контрольных клетках принимали за 1. ( B ) активность GST, определяемую с использованием этакриновой кислоты в качестве субстрата. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n = 3–4. Группы без общей буквы различаются, P <0,05.

Активность промотора GSTP.

Конструкции различной длины временно трансфицировали в клетки клона 9, чтобы проверить, модулируется ли промоторная активность гена GSTP сероорганическими соединениями, и найти возможные ответные сайты.С репортером Luc-2713, 600 мкМ моль / л LA или DHLA и 5 мкл моль / л SFN приводили к активности люциферазы в 2,0, 1,5 и 3,7 раза соответственно, чем в контрольные клетки ( P <0,05) (фиг. 3A). 1,7-кратное увеличение репортерной активности было отмечено в клетках, обработанных 50 мкМ моль / л DATS. Однако, когда область от -2713 до -2605 п.н. (GPEI) промотора GSTP (Luc-2604) была удалена, это увеличение репортерной активности полностью прекратилось, и активность была аналогична активности, отмеченной в клетках, трансфицированных Luc -2375.

РИСУНОК 3

GPEI необходим для активации GSTP с помощью сероорганических соединений, производных от фито. ( A ) Клетки трансфицировали различными конструкциями, а затем обрабатывали 50 μ моль / л DATS, 600 μ моль / л LA, 600 μ моль / л DHLA или 5 μ моль / л. Л СФН за 15 ч. Люциферазная активность клеток, трансфицированных pTA-2713 и обработанных только DMSO (-), была расценена как 1. ( B ) Конструкция, связанная с GPEI, трансфицировалась в клетки и клетки обрабатывались DATS, LA, DHLA или SFN за 15 ч.Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n = 3–4. Группы в одной конструкции без общей буквы различаются: P <0,05. # В отличие от 2 делеционных конструкций в одной обработке, P <0,05.

РИСУНОК 3

GPEI требуется для активации GSTP с помощью сероорганических соединений, производных от фито. ( A ) Клетки трансфицировали различными конструкциями, а затем обрабатывали 50 μ моль / л DATS, 600 μ моль / л LA, 600 μ моль / л DHLA или 5 μ моль / л. Л СФН за 15 ч.Люциферазная активность клеток, трансфицированных pTA-2713 и обработанных только DMSO (-), была расценена как 1. ( B ) Конструкция, связанная с GPEI, трансфицировалась в клетки и клетки обрабатывались DATS, LA, DHLA или SFN за 15 ч. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n = 3–4. Группы в одной конструкции без общей буквы различаются: P <0,05. # В отличие от 2 делеционных конструкций в одной обработке, P <0,05.

Чтобы дополнительно продемонстрировать важность GPEI в экспрессии GSTP в ответ на сероорганические соединения, была создана репортерная конструкция (Luc-GPE) путем лигирования геномного сегмента GPEI длиной 109 п.о. (от -2713 до -2605 п.о.) в кодирующую область люциферазы. .Результаты ясно показали, что DATS, LA, DHLA и SFN увеличивают активность репортера на 243, 189, 143 и 352% соответственно по сравнению с таковой в контрольных клетках ( P <0,05) (рис. 3B). Эти данные устанавливают, что GPEI несет элемент, реагирующий на сероорганическое соединение, и что этот элемент необходим для стимуляции активности промотора.

Белковая активность связывания GPEI по EMSA.

EMSA использовали для идентификации факторов транскрипции, которые были связаны с GPEI.В присутствии сероорганических соединений активность связывания ДНК достигает максимума через 0,5–1 ч (рис. 4А). Специфичность взаимодействия ДНК-белок для GPEI была продемонстрирована конкурентным анализом со 100-кратным избытком немеченого двухцепочечного олигонуклеотида (холодный), а также с мутантным двухцепочечным олигонуклеотидом (mut). Затем был проведен суперсдвиг с использованием высокоспецифичных антител, направленных против c-jun и Nrf2. Полоса ядерного белка GPEI была аннулирована, и суперсдвиг произошел в присутствии антитела против c-Jun (рис.4Б). Кроме того, перед EMSA проводили иммунопреципитацию антителом против Nrf2. Как уже отмечалось, антитело против Nrf2 уменьшало связывание ядерных белков с олигонуклеотидами GPEI (фиг. 4B). Сопровождаемый уменьшением связывания Nrf2-GPEI, Nrf2 в ядерных иммунопреципитатах увеличивался в клетках, обработанных сероорганическими соединениями (рис. 4C). Активация c-Jun после иммунопреципитации антителом против c-Jun согласуется с результатом индуцированного сероорганическим соединением накопления ядерного Nrf2 в ядре.После иммунопреципитации определяли, взаимодействует ли c-Jun с Nrf2, выступая в качестве партнера. Nrf2 не был обнаружен в ядерных иммунопреципитатах с антителом c-Jun (фиг. 4C). Точно так же в иммунопреципитатах Nrf2 не было обнаружено p-c-Jun.

РИСУНОК 4

Активация связывающей активности GPEI фитоорганическими соединениями серы. ( A ) Клетки обрабатывали 200 μ моль / л DATS, 600 μ моль / л LA, 600 μ моль / л DHLA или 5 μ моль / л SFN в течение указанного времени и ядерные экстракты были приготовлены для измерения активности связывания GPEI с помощью EMSA.Свободный зонд внизу не показан. ( B ) Ядерные белки, выделенные из клеток, обработанных DATS в течение 3 часов и LA, DHLA, SFN в течение 1 часа, сначала добавляли олигонуклеотиды GPEI в каждую реакцию в течение 30 минут, а затем инкубировали с антителами к c-Jun в течение дополнительные 30 мин при комнатной температуре. Последующие комплексы супер-сдвига разделяли электрофорезом в 6% акриламидном геле. Аликвоты супернатанта после иммунопреципитации антителом против Nrf2 использовали для EMSA.( C ) Ядерные экстракты, выделенные из клеток, обработанных DATS в течение 3 часов и LA, DHLA и SFN в течение 1 часа, подвергали иммунопреципитации (IP) антителами против Nrf2 или c-Jun. Аликвоты осадка после IP (15 мкл г) использовали для иммуноблоттинга (IB) с антителами против Nrf2 или против фосфо-c-Jun. Показанные результаты являются репрезентативными для 4 экспериментов.

РИСУНОК 4

Активация связывающей активности GPEI фитоорганическими соединениями серы. ( A ) Клетки обрабатывали 200 μ моль / л DATS, 600 μ моль / л LA, 600 μ моль / л DHLA или 5 μ моль / л SFN в течение указанного времени и ядерные экстракты были приготовлены для измерения активности связывания GPEI с помощью EMSA.Свободный зонд внизу не показан. ( B ) Ядерные белки, выделенные из клеток, обработанных DATS в течение 3 часов и LA, DHLA, SFN в течение 1 часа, сначала добавляли олигонуклеотиды GPEI в каждую реакцию в течение 30 минут, а затем инкубировали с антителами к c-Jun в течение дополнительные 30 мин при комнатной температуре. Последующие комплексы супер-сдвига разделяли электрофорезом в 6% акриламидном геле. Аликвоты супернатанта после иммунопреципитации антителом против Nrf2 использовали для EMSA.( C ) Ядерные экстракты, выделенные из клеток, обработанных DATS в течение 3 часов и LA, DHLA и SFN в течение 1 часа, подвергали иммунопреципитации (IP) антителами против Nrf2 или c-Jun. Аликвоты осадка после IP (15 мкл г) использовали для иммуноблоттинга (IB) с антителами против Nrf2 или против фосфо-c-Jun. Показанные результаты являются репрезентативными для 4 экспериментов.

Экспрессия других ферментов фазы II.

Мы также оценили экспрессию других ферментов детоксикации, которые, как известно, активируются Nrf2-зависимым механизмом, включая GSTA, GATM и NQO-1, с помощью иммуноблотов.Как указано, различные концентрации LA, DHLA и SFN дозозависимо стимулировали содержание белков GSTA, GSTM и NQO-1, а также концентрации, отмеченные для GSTP (фиг. 5A). Кроме того, активность фермента по отношению к 1-хлор-2,4-динитробензолу (фиг. 5B) и 2,6-дихлориндофенолу (фиг. 5C) увеличивалась под действием DATS, LA, DHLA и SFN.

РИСУНОК 5

Экспрессия белка и ферментативная активность ферментов детоксикации фазы II, индуцированная сероорганическими соединениями. Клетки культивировали с 0.1% ДМСО (-) или с различными концентрациями DATS, LA, DHLA или SFN в течение 24 часов. ( A ) Белки GSTA, GSTM и NQO1 определяли методом иммуноблоттинга. Для электрофореза использовали в общей сложности 8 мкл г белка для каждого образца. Белок был количественно определен денситометрией, и уровень в контрольных клетках был установлен равным 1. Значения представляют собой средние значения (SD), n = 3. Средние значения без общей буквы отличаются, P <0,05. Для определения GST ( B ) и активности NQO1 ( C ).Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n = 3–4. Группы без общей буквы различаются, P <0,05.

РИСУНОК 5

Экспрессия белка и ферментативная активность ферментов детоксикации фазы II, индуцированная сероорганическими соединениями. Клетки культивировали только с 0,1% ДМСО (-) или с различными концентрациями DATS, LA, DHLA или SFN в течение 24 часов. ( A ) Белки GSTA, GSTM и NQO1 определяли методом иммуноблоттинга. Для электрофореза использовали в общей сложности 8 мкл г белка для каждого образца.Белок был количественно определен денситометрией, и уровень в контрольных клетках был установлен равным 1. Значения представляют собой средние значения (SD), n = 3. Средние значения без общей буквы отличаются, P <0,05. Для определения GST ( B ) и активности NQO1 ( C ). Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n = 3–4. Группы без общей буквы различаются, P <0.05.

Обсуждение

Важность GSTP в профилактике рака подтверждается открытием, что у мышей, лишенных этого детоксикационного фермента, значительно повышается частота рака кожи, вызванного 7,12-диметилбензантраценом (14). Также сообщалось, что точечная мутация в гене GSTP, которая приводит к снижению активности фермента, связана с повышенным риском рака полости рта, мочевого пузыря, легких, яичек, гортани и груди (34). Более того, поскольку GSTP может быть вызван многочисленными диетическими факторами, считается, что усиление экспрессии и активности GSTP с помощью режима питания является практическим средством химиопрофилактики рака.Фактически, исследования показали, что подавление вызванного бензо [ a ] пиреном неопластического образования лесного желудка у мышей с помощью чеснока положительно связано с его способностью модулировать экспрессию фермента GSTP (13,35). Чесночное масло и аллилсульфиды чеснока, включая диаллилдисульфид и DATS, которые считаются мощными химиопрофилактическими агентами, являются эффективными индукторами GSTP в тонком кишечнике, печени и легких (36). В этом исследовании наши результаты показали, что сероорганические соединения из овощей, кроме чеснока, также действуют как индукторы GSTP с различной эффективностью.Более того, мы также показали, что такая повышающая регуляция транскрипции гена GSTP этими сероорганическими соединениями, вероятно, зависит от AP-1 и Nrf2.

В этом исследовании LA, DHLA и SFN дозозависимо увеличивали белок GSTP в клетках клона 9 (рис. 1). Из протестированных сероорганических соединений наибольшую эффективность в повышающей регуляции экспрессии GSTP показали SFN, за ней следовали DATS, тогда как LA и DHLA были наименее эффективными. Такое несоответствие между сероорганическими соединениями согласуется с их дифференциальным увеличением мРНК GSTP и ферментативной активности (рис.2). Более того, обработка LA, DHLA и SFN вызывала относительно большую индукцию по сравнению с контролем в белке GSTP, чем в мРНК GSTP или активности фермента. Это может быть связано с уникальной регуляцией стабильности мРНК GSTP и (или) посттрансляционными механизмами, включающими протеасомную деградацию вновь синтезированных белков GSTP этими соединениями (37). Представляет интерес понять, как эти сероорганические соединения по-разному регулируют экспрессию гена GSTP. Хотя объяснение этому открытию в настоящее время недоступно, возможным объяснением могут быть различные фармакологические свойства этих сероорганических соединений в клетках печени (38).Наши находки предполагают, что восходящая передача сигналов, активирующая AP-1 и Nrf2, вероятно, играет ключевую роль в дифференциальной транскрипции гена GSTP.

Чтобы продемонстрировать рабочий механизм, с помощью которого сероорганические соединения активируют транскрипцию GSTP, мы сконструировали Luc-репортеры с последовательной делецией 5′-фланкирующей области промотора гена GSTP. Эти результаты ясно показали, что участок от -2713 до -2605 п.н. необходим для индукции LA, DHLA и SFN экспрессии GSTP в клетках клона 9 (рис.3). Однако второй энхансер GPEII (от -2604 до -2376 п.н.), который находится рядом с GPEI, не влиял на индукцию гена GSTP. Этот вывод согласуется с работой Okuda et al. (16), которые сообщили, что GPEI является основным регуляторным элементом, ответственным за индукцию GSTP. Опубликованные данные свидетельствуют о том, что AP-1 является основным фактором транскрипции, который связывается с TRE-подобным элементом в GPEI (17). AP-1 в основном состоит из димеров белков c-Jun и c-Fos. Результаты нашего анализа супер-сдвига в настоящем исследовании ясно показали, что c-Jun участвует в образовании комплексов ядерный белок-GPEI, индуцированных LA, DHLA и SFN (рис.4Б).

Сообщается, что помимо AP-1 в повышающей регуляции экспрессии GSTP участвуют несколько других факторов транскрипции. В недифференцированных эмбриональных стволовых клетках F9, которые обладают очень низкой активностью AP-1, элемент GPEI активен AP-1-независимым образом (39). Nrf2 является одним из факторов транскрипции, который привлекает большое внимание из-за гомологии последовательностей между TRE-подобными последовательностями на GPEI (5′-AGTCAGTCACTATGATTCAGCA-3 ‘) и консервативными последовательностями ARE (5′-GTGACNNNGCA-3’ ).Связывание Nrf2 / MafK с GPEI и активация экспрессии GSTP крысы были показаны во время гепатоканцерогенеза (18). Однако при обработке эпителиальных клеток печени RL34 15-дезокси-Δ-простагландином j2 (12,14) считалось, что Nrf2 не является важным компонентом, ответственным за трансактивацию GPEI (40). Хотя роль Nrf2 в модулировании экспрессии GSTP у крыс не установлена, важность Nrf2 в регуляции транскрипции генов GSTP человека и мыши хорошо задокументирована (41,42).Например, было показано, что индукция GSTP 6-метилсульфинилгексилизотиоцианатом васаби, аналога SFN, полностью устраняется у мышей с дефицитом Nrf2 (43). Чтобы проверить, связывается ли Nrf2 с GPEI, мы провели анализ, сочетающий иммунопреципитацию и EMSA. Наши результаты ясно показали, что в дополнение к AP-1, Nrf2 может связываться с GPEI. Было показано, что c-Jun является связывающим фактором при активации ARE-зависимой транскрипции. Nrf2 в ассоциации с белками Jun регулирует ARE-опосредованную экспрессию и координированную индукцию генов, кодирующих детоксифицирующие ферменты (44).Результаты недавней работы Levy et al. (45) подтверждают, что c-Jun, по-видимому, является партнером Nrf2 в повышающей регуляции экспрессии ARE в эпителиальных клетках бронхов человека, подвергнутых воздействию 4-гидрокси-2-ноненаля, хотя ответ варьируется в зависимости от определенных генов и типов клеток. В этом исследовании результат иммунопреципитации показал, что Nrf2 не может напрямую связываться с c-Jun. Взятые вместе, результаты EMSA показали, что активация этого фермента детоксикации фазы II с помощью LA и SFN, вероятно, происходит через несколько белковых факторов, по крайней мере, c-Jun и Nrf2, которые могут действовать сложным образом.

В ответ на многочисленные прооксиданты и электрофильность Nrf2 диссоциирует от белка Keap и быстро перемещается из цитозоля в ядро, где он образует гетеродимер с малым Maf и связывается с ARE. Это связывание Nrf2 с ARE активирует транскрипцию многих ферментов цитозащиты. К ним относятся глутаматцистеинлигаза, гемоксигеназа 1, NQO1 и GST (21,27,43,46). Во многих типах клеток SFN рассматривается как мощный активатор Nrf2, который приводит к усилению регуляции изоферментов NQO1 и GST, включая GSTA и GSTM (43,47,48).Это повышение уровней этих детоксикационных ферментов объясняет, по крайней мере частично, защиту SFN от химических канцерогенов, таких как индуцированное бензо [ a ] пиреном образование опухолей желудка и толстой кишки (20,49). В настоящем исследовании увеличение GSTA, GSTM и NQO1 было также отмечено в клетках, обработанных SFN, что предполагает активацию пути Nrf2-ARE при обработке клеток Clone 9 SFN (рис. 5).

LA, помимо общепризнанной роли кофермента, является природным антиоксидантом (24).LA быстро поглощается клетками, где он может быть восстановлен до DHLA с помощью таких ферментов, как дигидролипоамиддегидрогеназа, глутатионредуктаза или тиоредоксинредуктаза. DHLA, продуцируемый внутри клетки, является мощным восстанавливающим агентом, который может даже восстанавливать дисульфиды белка до сульфгидрилов белка, а также восстанавливать цистин до цистеина, который является ограничивающим субстратом для синтеза глутатиона (50). Несколько исследований in vivo также предоставили доказательства того, что добавка LA снижает окислительный стресс и восстанавливает пониженные уровни других антиоксидантов при различных физиологических и патофизиологических условиях в тканях мозга и сердца, а также в эритроцитах (51,52).В дополнение к действию как кофермент и антиоксидант, недавняя работа показывает, что LA также может действовать как индуктор нескольких ферментов детоксикации фазы II, включая GSTA и NQO1, через белок связывания CCAAT / энхансер и Nrf2-зависимый путь (8). В этом исследовании мы также показали, что LA и DHLA активируют транслокацию AP-1 и Nrf2 в ядро, где они связываются с GPEI и активируют транскрипцию GSTP.

Таким образом, SFN, LA, DHLA и DATS являются эффективными индукторами транскрипции гена GSTP, и SFN проявляет наибольшую эффективность.Более того, связывание AP-1 и Nrf2 с энхансерным элементом GPEI необходимо для индукции этого фермента детоксикации фазы II.

C.K.L., H.W.C. и C.W.T. спланированное исследование; C.W.T., K.L.L. и C.K.L. проведенное исследование; Y.P.C. и A.H.L. проанализированные данные; C.K.L. и C.W.T. написал газету. C.W.T. несет основную ответственность за окончательный контент. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Цитированная литература

Мориарти

RM

Naithani

R

Surve

B

Сероорганические соединения в химиопрофилактике рака

Mini Rev Med Chem.

2007

7

827

38

Higdon

JV

Delage

B

Williams

DE

Dashwood

RH

Крестоцветные овощи и риск рака у человека: эпидемиологические данные и механистическая основа

Pharmacol Res.

2007

55

224

36

Howard

EW

Ling

MT

Chua

CW

Cheung

HW

Wang

X

Wong

YC

S-аллилмеркаптоцистеин, полученный из чеснока, является новым антиметастатическим средством in vivo при андрогеннезависимом раке простаты

Clin Cancer Res.

2007

13

1847

56

Wang

L

Gaziano

JM

Norkus

EP

Buring

JE

Sesso

HD

Связь каротиноидов плазмы с факторами риска и биомаркерами сердечно-сосудистых заболеваний у женщин среднего и старшего возраста

Am J Clin Nutr.

2008

88

747

54

Ogunleye

AA

Xue

F

Michels

KB

Потребление зеленого чая и риск или рецидив рака груди: метаанализ

Лечение рака груди.

2010

119

477

84

Джонс

SB

Брукс

JD

Умеренная индукция активности фермента фазы 2 в простате крысы F-344

BMC Рак.

2006

6

62

Hanlon

N

Okpara

A

Coldham

N

Sauer

MJ

Ioannides

C

Модуляция цитохромов печени и легких крыс P450 и ферментных систем фазы II эруцином, изотиоцианатом, структурно связанным с сульфорафаном

J Agric Food Chem.

2008

56

7866

71

Ki

SH

Kim

SG

Индукция фермента фазы II альфа-липоевой кислотой через фосфатидилинозитол-3-киназозависимую активацию C / EBPs

Xenobiotica.

2008

38

587

604

Вилла-Крус

В

Давила

J

Виана

MT

Васкес-Духальт

R

Влияние брокколи (Brassica oleracea) и ее фитохимического сульфорафана в сбалансированных диетах на уровни детоксикационных ферментов тилапии (Oreochromis niloticus), подвергшейся воздействию канцерогенных и мутагенных загрязнителей

Chemosphere.

2009

74

1145

51

Странно

RC

Спитери

MA

Рамачандран

S

Фритюрница

AA

Семейство ферментов глутатион-S-трансферазы

Mutat Res.

2001

482

21

6

Satoh

K

Kitahara

A

Soma

Y

Inaba

Y

Hatayama

I

Sato

K

Очистка, индукция и распространение плацентарной глутатионтрансферазы: новый фермент-маркер для предопухолевых клеток в химическом гепатоканцерогенезе крыс

Proc Natl Acad Sci USA.

1985

82

3964

8

Цучида

S

Sato

K

Трансферазы глутатиона и рак

Crit Rev Biochem Mol Biol.

1992

27

337

84

Hu

X

Benson

PJ

Srivastava

SK

Xia

H

Bleicher

RJ

Zaren

HA

Awasthi

S

Авасти

YC

Сингх

SV

Индукция глутатион-S-трансферазы pi в качестве биоанализа для оценки эффективности ингибиторов рака, индуцированного бензо [a] пиреном, на мышиной модели

Int J Cancer.

1997

73

897

902

Хендерсон

CJ

Smith

AG

Ure

J

Коричневый

K

Bacon

EJ

Wolf

CR

Повышенный онкогенез кожи у мышей, лишенных S-трансферазы глутатиона pi класса

Proc Natl Acad Sci USA.

1998

95

5275

80

Sakai

M

Okuda

A

Muramatsu

M

Множественные регуляторные элементы и реакция на форбол 12-O-тетрадеканоат 13-ацетат гена плацентарной глутатионтрансферазы крысы

Proc Natl Acad Sci USA.

1988

85

9456

60

Okuda

A

Imagawa

M

Maeda

Y

Sakai

M

Muramatsu

M

Структурный и функциональный анализ энхансера GPEI, имеющего последовательность, подобную чувствительному элементу форбол 12-O-тетрадеканоат 13-ацетат, обнаруженную в гене

J Biol Chem.

1989

264

16919

26

Angel

P

Imagawa

M

Chiu

R

Stein

B

Imbra

RJ

Rahmsdorf

HJ

Jonat

C

Herrlich

P

Karin

M

Гены, индуцируемые сложным эфиром форбола, содержат общий цис-элемент, распознаваемый TPA-модулируемым транс-действующим фактором

Cell.

1987

49

729

39

Икеда

H

Ниши

S

Сакаи

M

Фактор транскрипции Nrf2 / MafK регулирует ген глутатион-S-трансферазы плаценты крысы во время гепатоканцерогенеза

Biochem J.

2004

380

515

21

Zhu

H

Jia

Z

Strobl

JS

Ehrich

M

Misra

HP

Li

Y

Мощная индукция общих клеточных и митохондриальных антиоксидантов и ферментов фазы 2 крестоцветным сульфорафаном в гладкомышечных клетках аорты крысы: цитопротекция против окислительного и электрофильного стресса

Cardiovasc Toxicol.

2008

8

115

25

Bonnesen

C

Eggleston

IM

Hayes

JD

Диетические индолы и изотиоцианаты, полученные из овощей семейства крестоцветных, могут как стимулировать апоптоз, так и обеспечивать защиту от повреждения ДНК в линиях клеток толстой кишки человека

Cancer Res.

2001

61

6120

30

Кеум

YS

Yu

S

Chang

PP

Yuan

X

Kim

JH

Xu

C

Han

J

Агарвал

A

Kong

AN

Механизм действия сульфорафана: ингибирование митоген-активированных изоформ протеинкиназы p38, способствующих индукции опосредованной антиоксидантным ответом гемоксигеназы-1 в клетках гепатомы человека HepG2

Cancer Res.

2006

66

8804

13

Wagner

AE

Ernst

I

Iori

R

Desel

C

Rimbach

G

Сульфорафан, но не аскорбиген, индол-3-карбинол и аскорбиновая кислота активируют фактор транскрипции Nrf2 и индуцируют фазу-2 и антиоксидантные ферменты в кератиноцитах человека в культуре

Exp Dermatol.

2010

19

137

44

Пакер

L

Witt

EH

Tritschler

HJ

Альфа-липоевая кислота как биологический антиоксидант

Free Radic Biol Med.

1995

19

227

50

Bustamante

J

Lodge

JK

Marcocci

L

Tritschler

HJ

Packer

L

Rihn

BH

Альфа-липоевая кислота в метаболизме и заболеваниях печени

Free Radic Biol Med.

1998

24

1023

39

Biewenga

GP

Haenen

GR

Bast

A

Фармакология антиоксиданта липоевой кислоты

Gen Pharmacol.

1997

29

315

31

Jia

Z

Hallur

S

Zhu

H

Li

Y

Misra

HP

Сильная повышающая регуляция глутатиона и NAD (P) H: хинон оксидоредуктазы 1 альфа-липоевой кислотой в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y: защита от цитотоксичности, вызванной нейротоксикантами

Neurochem Res.

2008

33

790

800

Элангован

S

Hsieh

TC

Контроль клеточного окислительно-восстановительного статуса и активация хинонредуктазы NQO1 посредством активации Nrf2 альфа-липоевой кислотой в клетках HL-60 лейкемии человека

Int J Oncol.

2008

33

833

8

Цай

CW

Ян

JJ

Чен

HW

Шин

LY

Lii

СК

Сероорганические соединения чеснока повышают экспрессию класса pi глутатион-S-трансферазы в первичных гепатоцитах крысы

J Nutr.

2005

135

2560

5

Цай

CW

Чен

HW

Ян

JJ

Шин

LY

Lii

СК

Диаллилдисульфид и диаллилтрисульфид повышают экспрессию класса pi глутатион-S-трансферазы через AP-1-зависимый путь

J Agric Food Chem.

2007

55

1019

26

Wu

CC

Sheen

LY

Chen

HW

Kuo

WW

Tsai

SJ

Lii

CK

Дифференциальное влияние чесночного масла и трех его основных серорганических компонентов на систему детоксикации печени у крыс

J Agric Food Chem.

2002

50

378

83

Леманн

U

Крейпе

H

ПЦР-анализ в реальном времени ДНК и РНК, экстрагированных из фиксированных формалином и залитых парафином биоптатов

Методы.

2001

25

409

18

Mannervik

B

Alin

P

Guthenberg

C

Jensson

H

Tahir

MK

Warholm

M

Jornvall

H

Идентификация трех классов цитозольной глутатионтрансферазы, общих для нескольких видов млекопитающих: корреляция между структурными данными и ферментативными свойствами

Proc Natl Acad Sci USA.

1985

82

7202

6

Jamieson

D

Wilson

K

Pridgeon

S

Margetts

JP

Edmondson

RJ

Leung

HY

Knox

R

Кузов

AV

NAD (P) H: активность и экспрессия хинон оксидоредуктазы 1 и nrh: хинон оксидоредуктазы 2 при раке мочевого пузыря и яичников и более низкая активность NRH: хинон оксидоредуктазы 2, связанная с однонуклеотидным полиморфизмом экзона 3 NQO2

Clin Cancer Res.

2007

13

1584

90

Taningher

M

Malacarne

D

Izzotti

A

Ugolini

D

Parodi

S

Полиморфизмы метаболизма лекарственных средств как модуляторы предрасположенности к раку

Mutat Res.

1999

436

227

61

Hu

X

Benson

PJ

Srivastava

SK

Mack

LM

Xia

H

Gupta

V

Zaren

HA

Сингх

SV

Глутатион S-трансферазы печени и лесного желудка самок мышей A / J и их дифференциальная индукция антиканцерогенными органосульфидами чеснока

Arch Biochem Biophys.

1996

336

199

214

Lii

CK

Tsai

CW

Wu

CC

Аллилсульфиды чеснока демонстрируют дифференциальную модуляцию цитохрома P450 2B1 крысы и плацентарной формы глутатион-S-трансферазы в различных органах

J Agric Food Chem.

2006

54

5191

6

Чернг

SH

Hsu

SL

Ян

JL

Yu

CT

Lee

H

Подавляющее действие 1-нитропирена на индуцированную бензо [α] пиреном экспрессию белка CYP1A1 в клетках HepG2

Toxicol Lett.

2006

161

236

43

Kasuga

S

Uda

N

Kyo

E

Ushijima

M

Morihara

N

Itakura

Y

Фармакологическая активность экстракта выдержанного чеснока по сравнению с другими препаратами из чеснока

J Nutr.

2001

131

S1080

4

Okuda

A

Imagawa

M

Sakai

M

Muramatsu

M

Функциональная кооперативность между двумя TPA-чувствительными элементами в недифференцированных эмбриональных стволовых клетках F9

EMBO J.

1990

9

1131

5

Kawamoto

Y

Nakamura

Y

Naito

Y

Torii

Y

Kumagai

T

Osawa

T

Ohigashi

H

Satoh

K

Imagawa

M

Циклопентеноновые простагландины как потенциальные индукторы ферментов детоксикации фазы II. 15-дезокси-дельта (12,14) -простагландин j2-индуцированная экспрессия S-трансфераз глутатиона

J Biol Chem.

2000

275

11291

9

Nishinaka

T

Ichijo

Y

Ito

M

Kimura

M

Katsuyama

M

Iwata

K

Miura

T

Терада

Т

Ябе-Нишимура

С

Куркумин активирует экспрессию человеческой глутатион-S-трансферазы P1 через элемент

Toxicol Lett.

2007

170

238

47

Ikeda

H

Serria

MS

Kakizaki

I

Hatayama

I

Satoh

K

Tsuchida

S

Muramatsu

M

Ниси

S

Сакаи

M

Активация гена мышиной глутатион-S-трансферазы Pi-класса Nrf2 (фактор 2, связанный с NF-E2) и андрогеном

Biochem J.

2002

364

563

70

Morimitsu

Y

Nakagawa

Y

Hayashi

K

Fujii

H

Kumagai

T

Nakamura

Y

Osawa

T

Хорио

F

Ито

К

Аналог сульфорафана, который сильно активирует Nrf2-зависимый путь детоксикации

J Biol Chem.

2002

277

3456

63

Венугопал

R

Jaiswal

AK

Nrf2 и Nrf1 в ассоциации с белками Jun регулируют экспрессию, опосредованную элементами антиоксидантного ответа, и координированную индукцию генов, кодирующих детоксифицирующие ферменты

Онкоген.

1998

17

3145

56

Леви

S

Jaiswal

AK

Forman

HJ

Роль фосфорилирования c-Jun в активации EpRE генов фазы II

Free Radic Biol Med.

2009

47

1172

9

Шенви

SV

Smith

EJ

Hagen

TM

Регуляция транскрипции гена каталитической субъединицы гамма-глутамат цистеинлигазы крысы опосредуется через дистальный элемент антиоксидантного ответа

Pharmacol Res.

2009

60

229

36

Гао

X

Талалай

P

Индукция генов фазы 2 с помощью сульфорафана защищает клетки пигментного эпителия сетчатки от фотоокислительного повреждения

Proc Natl Acad Sci USA.

2004

101

10446

51

Ritz

SA

Wan

J

Diaz-Sanchez

D

Стимулированная сульфорафаном индукция фермента фазы II подавляет выработку цитокинов эпителиальными клетками дыхательных путей, стимулированными дизельным экстрактом

Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.

2007

292

L33

9

Fahey

JW

Haristoy

X

Dolan

PM

Kensler

TW

Scholtus

I

Stephenson

KK

Talalay

P

Лозневский

А

Сульфорафан подавляет внеклеточные, внутриклеточные и устойчивые к антибиотикам штаммы Helicobacter pylori и предотвращает индуцированные бензо [a] пиреном опухоли желудка

Proc Natl Acad Sci USA.

2002

99

7610

5

Сух

JH

Ван

H

Лю

RM

Лю

J

Hagen

TM

(R) -альфа-липоевая кислота обращает связанную с возрастом потерю окислительно-восстановительного статуса GSH в постмитотических тканях: доказательства повышенной потребности в цистеине для синтеза GSH

Arch Biochem Biophys.

2004

423

126

35

Ghibu

S

Lauzier

B

Delemasure

S

Amoureux

S

Sicard

P

Vergely

C

Muresan

A

Могосан

C

Rochette

L

Антиоксидантные свойства альфа-липоевой кислоты: влияние на проницаемость красной кровяной мембраны и адаптацию изолированного сердца крысы к обратимой ишемии

Mol Cell Biochem.

2009

320

141

8

Bilska

A

Dubiel

M

Sokolowska-Jezewicz

M

Lorenc-Koci

E

Wlodek

L

Альфа-липоевая кислота по-разному влияет на вызванный резерпином окислительный стресс в полосатом теле и префронтальной коре головного мозга крысы

Неврология.

2007

146

1758

71

Сокращения

• AP-1

• ARE

  антиоксидантный ответный элемент

• DATS

• DHLA

• DMSO

• DTT

• EMSA

  Электромобильность анализ сдвига 900

  GAPDH

  глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

• GPEI

  π-класс глутатиона S -трансфераза энхансер I

• GST

  глутатион S -трансфераза

  GST

  α-трансфераза

  глутатион S -трансфераза

• GSTM

  μ класс глутатиона S -трансфераза

• GSTP

  π -класс глутатиона S -трансфераза

  LA

НАД (Ф) Н-зависимый хинон окс идоредуктазы 1

• Nrf2

  ядерный фактор, связанный с эритроидом-2 фактор 2

• SFN

• TRE

  12- O -тетрадеканоилфорбол-13-ацетатный реагирующий элемент

Заметки автора

© 2010 Американский институт питания

Исследование NATHAN 1 — Mayo Clinic

@article {6a595008bfbe4c8db42ed4abecf0604b,

title = «Эффективность и безопасность антиоксидантного лечения α-липоевой кислотой в течение 4 лет при диабетической полинейропатии:» Исследование NATHAN 116 аннотация «,

author =» Дэн Зиглер и Лоу, {Филипп А.} и Личи, {Уильям Дж.} И Бултон, {Эндрю Дж. М.} и Виник, {Аарон И.}, Рой Фриман, Рустем Самигуллин и Ханс Тритшлер и Ульрих Мюнцель, Иоахим Маус и Клеменс Ш {\ «у} тте и Дик, {Питер Дж.}»,

год = «2011»,

месяц = ​​сентябрь,

doi = «10.2337 / dc11-0503»,

language = «English (US)»,

volume = «34»,

pages = «2054-2060»,

journal = «Diabetes Care»,

issn = «1935-5548»,

publisher = «Американская диабетическая ассоциация Inc.»,

number =» 9 «,

}

Амитриптилин по сравнению с альфа-липоевой кислотой в лечении болезненной диабетической полинейропатии

Амитриптилин по сравнению с альфа-липоевой кислотой в лечении болезненной диабетической полинейропатии Болезненная диабетическая полинейропатия Болезненная диабетическая полинейропатия — серьезная проблема для здоровья. Существует потребность в лекарствах, которые обеспечивают значимое облегчение боли, улучшают качество жизни и хорошо переносятся. В настоящее время амитриптилин является золотым стандартом в лечении полинейропатии.Результаты недавних исследований показывают эффективность альфа-липоевой кислоты (ALA) в уменьшении боли у пациентов, страдающих диабетической полинейропатией. Целью этого исследования было сравнить эффективность и безопасность АЛК и амитриптилина в облегчении боли, связанной с диабетической полинейропатией. Это первое прямое исследование, в котором сравниваются оба агента. [Br] В этом рандомизированном, слепом, клиническом исследовании 32 пациента с диабетической полинейропатией, у которых была оценка боли не менее 40 мм по шкале ВАШ от 0 до 100 мм, были назначен для последовательного лечения 600 мг α-липоевой кислоты один раз в день внутривенно и плацебо перорально в течение 3 недель или для лечения амитриптилином перорально в минимальных эффективных дозах в диапазоне 25-75 мг (13 пациентов, получавших 25 мг, 1 [ndash] 50 мг и 2 [ndash] 75 мг) и плацебо внутривенно в течение 3 недель.Лечение тем же препаратом перорально в ранее установленных дозах продолжалось в амбулаторных условиях в течение 3 месяцев. Облегчение боли (SFMPQ-VAS), улучшение качества жизни (EuroQol EQ-5D) и возникновение нежелательных явлений оценивались еженедельно во время госпитализации и ежемесячно в течение периода амбулаторного наблюдения. [Br] A [sup3] Снижение на 50% ВАШ была отмечена у 7 (44%) пациентов, получавших альфа-липоевую кислоту, и у 6 (38%) пациентов, получавших амитриптилин ([курсив] P [/ курсив] = 0,19). Сравнимое снижение интенсивности боли было получено с обоими препаратами с первой недели ([Delta] VAS -13 [plusmn] 13 мм vs.-13 [plusmn] 14 мм, [курсив] P [/ курсив] = 0,94 соответственно). Улучшение качества жизни было значительно выше у пациентов, получавших амитриптилин, через 1 и 3 недели наблюдения по сравнению с ALA (соответственно: [Delta] EQ [sub] 1week [/ sub] 9 [plusmn] 13 vs. -1 [plusmn] 10, [Delta] EQ [sub] 3week [/ sub] 28 [plusmn] 21 против 12 [plusmn] 20, [курсив] P [/ курсив] [lt] 0,05). О нежелательных явлениях сообщалось только при приеме амитриптилина, причем сухость во рту была наиболее распространенной. [Br] В заключение, амитриптилин и α-липоевая кислота одинаково эффективны при лечении болезненной диабетической полинейропатии.Амитриптилин оказывает большее положительное влияние на качество жизни, но связан с более высоким риском побочных эффектов.

alexxlab