Калий арарат: Калия оротат таблетки 500 мг инструкция по применению

Калия оротат в таблетках. Инструкция и способ применения

Круглые плоскоцилиндрические таблетки белого цвета с фаской, с риской на одной стороне.

Состав на одну таблетку
Действующее вещество:
Калия оротат –500,0 мг
Вспомогательные вещества:
Лактозы моногидрат – 165,0 мг
Крахмал картофельный – 55,0 мг
Повидон К-17 – 22,5 мг
Кальция стеарат – 7,5 мг

Препарат представляет собой калиевую соль оротовой кислоты. Оротовая кислота является одним из предшественников пиримидиновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, которые участвуют в синтезе белковых молекул, в связи с чем соли оротовой кислоты рассматриваются как вещества анаболического действия и применяются при нарушениях белкового обмена для их стимуляции. Калия оротат стимулирует синтез нуклеиновых кислот, продукцию альбумина в печени, особенно в условиях длительной гипоксии (недостаточности кислорода), повышает аппетит, обладает диуретическим (мочегонным) и регенерирующим свойствами.

После приема внутрь в желудочно-кишечном тракте абсорбируется (всасывается) 10 % принятой внутрь дозы. В печени превращается в оротидин-5-фосфат. Выводится почками (30 % в виде метаболитов).

В период лечения желательным является соблюдение диеты.

Препарат не вызывает сонливости и уменьшения скорости психомоторных реакций.

Таблетки, 500 мг. По 10 таблеток в контурную ячейковую упаковку из пленки поливинилхлоридной и фольги алюминиевой печатной лакированной. 2, 5 контурных ячейковых упаковок по 10 таблеток с инструкцией по применению помещают в пачку из картона.

В сухом месте при температуре не выше 25 °С в упаковке производителя. Хранить в недоступном для детей месте. 4 года. По истечении срока годности, указанного на упаковке, не использовать.

Калия оротат 500 мг №10 табл.

Инструкция

по медицинскому применению

лекарственного средства

Калия оротат

Торговое название

Калия оротат

Международное непатентованное название
Оротовая кислота

Лекарственная форма

Таблетки 0.5 г

Состав

Одна таблетка содержит

активное вещество – калия оротат 0.5 г,

вспомогательные вещества: лактоза моногидрат, крахмал картофельный,  желатин, кислота стеариновая

Описание

Таблетки белого цвета плоскоцилиндрической формы, с гладкой поверхностью, c риской и фаской

Фармакотерапевтическая группа

Анаболические стероидные препараты для системного использования. Прочие анаболические стероидные препараты. Код АТХ  А14В

Фармакологические свойства

Фармакокинетика

Абсорбируется в пищеварительном тракте не полностью, всасывается не более 10 % принятой дозы. Превращается в печени в оротидин-5-фосфат  и выводится с мочой в виде различных метаболитов.

Фармакодинамика

Нестероидное анаболическое средство. Оказывает общее стимулирующее действие на обменные процессы. Является стимулятором синтеза нуклеиновых кислот, участвующих в синтезе белка, усиливает репаративные и регенеративные процессы в тканях. Оротовая кислота усиливает образование альбуминов в печени, особенно в условиях длительной гипоксии, возникающей при некоторых заболеваниях, например, при сердечной недостаточности. Препарат улучшает переносимость сердечных гликозидов, способствует увеличению диуреза.

Показания к применению

В составе комплексной терапии:

— заболеваний печени, вызванных острыми и хроническими интоксикациями

— прогрессирующей мышечной дистрофии

— инфаркта миокарда

— алиментарной и алиментарно-инфекционной дистрофии у детей

— анемии и другие состояния, требующие стимуляции анаболических процессов, в том числе при значительных физических нагрузках.

Способ применения и дозы

Препарат принимают за 1 час до или через 4 часа после еды. Доза для взрослых от 0,5 до 1,5 г в сутки (по 0,25 г — 0,5 г 2 – 3 раза в сутки). Курс лечения длится в среднем 20-30 дней. Максимальная суточная доза для взрослых – 3 г.

Детям при алиментарной и алиментарно-инфекционной гипотрофии, при анемиях, во время реконвалесценции препарат назначают из расчета  10-20 мг на 1 кг массы тела в сутки (в 2 — 3 приема). Курс лечения 3-5 недель.

При необходимости курс лечения повторяют после месячного перерыва.

Применять по назначению врача.

Побочные действия

— аллергические кожные реакции

— диспепсия

— гиперкалиемия.

Противопоказания

— повышенная чувствительность к компонентам препарата

— цирроз печени с асцитом

— гиперкалиемия

С осторожностью

— почечная недостаточность

— беременность и период лактации

Лекарственные взаимодействия

При взаимодействии с калийсберегающими диуретиками и ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента (каптоприл, лизиноприл и другими), возможно возникновение гиперкалиемии.

Эффективность калия оротата повышается при одновременном применении с фолиевой кислотой, цианкобаламином и препаратами магния.

Калия оротат несколько снижает токсичность сердечных гликозидов. Вяжущие и обволакивающие средства могут снизить всасывание калия оротата в желудочно-кишечном тракте.

Особые указания

Препарат назначают под контролем уровня калия в крови.

Калия оротат нельзя использовать как калийзамещающий препарат.

Беременность и лактация

В связи с отсутствием необходимых клинических данных препарат не рекомендуется назначать в период беременности и лактации (грудного вскармливания). Применение препарата возможно только после тщательной оценки лечащим врачом соотношения польза/риск.

Особенности влияния лекарственного средства на способность управлять транспортным средством или  потенциально опасными механизмами

Препарат не оказывает влияние на управление транспортным средством и потенциально опасными механизмами.

Передозировка

Не выявлена.

Форма выпуска  и упаковка

По 10 таблеток в контурной безъячейковой упаковке из бумаги, ламинированной полиэтиленом.

Контурные безъячейковые упаковки вместе с инструкциями по медицинскому применению на государственном и русском языках помещают в коробки из картона.

Условия хранения

Хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25 ºС.

Хранить в недоступном для детей месте!

Срок хранения

4 года

Не применять препарат после истечения срока годности.

Условия отпуска из аптек

Без рецепта

Производитель

ОАО «Лубныфарм».

37500, Украина,  г. Лубны, Полтавской обл., ул. Петровского, 16.

Владелец регистрационного удостоверения

ОАО «Лубныфарм», Украина.

Адрес организации, принимающей на территории Республики Казахстан претензии от потребителей по качеству продукции (товара)

Влияние оротата калия на неоколлагеногенез при имплантации полипропиленового эндопротеза и эндопротеза из полипропилена с полимолочной кислотой в эксперименте

Основой патогенеза развития грыжи передней брюшной стенки является нарушение коллагенового обмена, что обусловливает слабость апоневроза. В конце прошлого столетия внимание герниологов привлекла проблема возникновения грыжи передней брюшной стенки с точки зрения коллагенового обмена. Была предложена концепция, отражающая нарушение соотношения коллагена I и III типов и, как следствие, появление грыжи [1—3]. Определенное соотношение коллагена I и III типов обеспечивает прочность соединительной ткани. Изменение этого соотношения в сторону уменьшения коллагена III типа ведет к слабости и снижению механической функции передней брюшной стенки [4—8].

Синтез коллагеновых фибрилл является многоэтапным и сложным процессом, происходящим в организме, и на каждом из этапов возможны нарушения. Восполнение недостающих элементов нормализует этот процесс [9—11]. Оротовая кислота, входящая в состав восстанавливающего агента 4-оксипролина, необходима для сохранения атома железа при гидроксилировании пролина [12]. Пищевыми источниками оротовой кислоты являются свиная печень, кисломолочные продукты, дрожжи [13]. В медицине известен препарат калия оротат, который влияет на обменные процессы в организме, участвует в синтезе коллагеновых волокон, стимулирует деление клеток [14].

Анализируя данные литературы, мы не выявили работ, описывающих действие калия оротата на формирование соединительной ткани и изменения соотношения типов коллагена в апоневрозе при грыже передней брюшной стенки, что определило актуальность нашего исследования.

Материал и методы

Экспериментальное исследование выполнено на 185 особях сингенных белых лабораторных мышей-самцов средней массой 45—50 г. Эксперименты, проводимые на животных, выполняли в соответствии с утвержденной Советом Европы в Страсбурге в 1986 г. Конвенцией о защите позвоночных животных при проведении экспериментов и в других целях и Директивой Совета от 24.11.86.

В зависимости от вида имплантированного эндопротеза и применения препарата калия оротата все животные были разделены на 4 группы.

Животным 1-й группы (n=43) имплантировали эндопротез из полипропилена. Во 2-й группе (n=47) использовали комбинированный эндопротез, в структуру которого входили нити из полипропилена с полимолочной кислотой. 3-ю группу (n=46)составили животные, которым имплантировали эндопротез из полипропилена, а в кормовой рацион добавляли препарат калия оротат в виде порошка из расчета 0,75 мг на одно животное в сутки. Животным 4-й группы (n=49) имплантировали комбинированный эндопротез и также в кормовой рацион добавляли калия оротат. Животные 3-й и 4-й групп получали препарат на протяжении всего эксперимента.

Эксперимент проводили в условиях операционного блока НИИ экологической медицины на базе Курского государственного медицинского университета. Оперативные вмешательства выполняли в асептических условиях с использованием эфирного наркоза. Далее производили разрез кожи на передней брюшной стенке длиной 1 см и помещали подкожно стерильный эндопротез размером 0,5×1,0 см без последующей его фиксации. Рану ушивали непрерывным швом.

Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 7, 10, 30, 60, 90-е сутки. Для получения гистологических препаратов брали участок передней брюшной стенки размером 1,0×1,5 см вместе с эндопротезом, после чего его фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Затем фрагменты брюшной стенки заключали в парафиновые блоки, из которых получали срезы толщиной 7—10 мкм. Полученные срезы помещали на предметные стекла и окрашивали пикросириусом красным по стандартной методике [3, 9, 15, 16]. Препараты исследовали под поляризационном микроскопом Altami Polar 2 в обычном и поляризационном свете при объективах ×10, ×25, ×40. Анализ соотношения типов коллагена в соединительной ткани вокруг эндопротеза проводили по цветовой гамме, индивидуальной для каждого типа. Так, коллаген I типа при поляризационной микроскопии имел красную окраску, коллаген III типа — зеленую. Для определения соотношения коллагена I и III типов использовали программный комплекс Altami Studio 3.0 и Image J. Для изучения плотности коллагеновых волокон вычисляли их концентрацию в пикселях на 1 дюйм графического редактора [17].

При анализе гистологических микропрепаратов в поляризационном свете во всех группах на 7-е и 10-е сутки эксперимента не выявлено достоверных различий в динамике соотношения коллагена I и III типов и плотности коллагеновых волокон (см. рис. 1, а, б).

Рис. 1. Микрофотографии на 10-е сутки эксперимента. Зоны имплантации эндопротеза из полипропилена (а) и комбинированного эндопротеза (б). В обоих случаях с добавлением в кормовой рацион калия оротата. Окраска пикрофуксином красным. Ув. соответственно 250 и 400.

На 30-е сутки эксперимента в 1-й группе визуализировалась соединительнотканная капсула вокруг нитей эндопротеза со строгой направленностью и непрерывностью пучков коллагеновых волокон, в которой отмечались «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, что говорило о ее незрелости. Плотность коллагеновых волокон составила 114,9±15,6 пикселя на 1 дюйм (табл. 1).

Таблица 1. Плотность коллагеновых волокон

В препаратах, полученных на 30-е сутки эксперимента при имплантации комбинированного эндопротеза, капсула имела плотную структуру, в которой отсутствовали «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы, плотность коллагеновых волокон составила 149,5±13,3 пикселя на 1 дюйм (см. табл. 1).

При поляризационной микроскопии препаратов 2-й группы, полученных на 60-е сутки эксперимента, отмечено, что структура парапротезной капсулы была более выраженной по сравнению с таковой в 1-й группе. Наблюдались организованно направленные пучки коллагеновых волокон, плотно расположенные относительно друг друга. Анализ цветовой гистограммы показал явное преобладание красного цвета, что свидетельствовало о значительном доминировании коллагена I типа по сравнению с его содержанием в предыдущий срок. Соотношение коллагена I и III типов составило 1,96, что было достоверно больше, чем в 1-й группе животных.

К 90-м суткам эксперимента отмечалось значительное преобладание коллагена I типа над III типом при использовании обоих видов эндопротезов (табл. 2). Однако в группе с применением комбинированного эндопротеза капсула более интенсивно окрашивалась в красный цвет, пучки волокон плотно располагались относительно друг друга. Плотность коллагеновых волокон составила 278,1±19,5 пикселя на 1 дюйм, что было достоверно больше, чем в группе животных, в которой использовали полипропилен (см. табл. 1). Соотношение типов коллагена при использовании эндопротеза из полипропилена составило 1,75, что практически в 1,5 раза меньше по сравнению с этим показателем в группе, в которой использовался комбинированный эндопротез.

Таблица 2. Соотношение коллагена Iи III типов в области имплантации эндопротеза Примечание. * — р≤0,05 при сравнении между эндопротезами в одинаковые сроки эксперимента; # — р≤0,05 при сравнении между типами эндопротезов и в зависимости от использования калия оротата; m — стандартное отклонение; ТК — типы коллагена.

При поляризационной микроскопии препаратов, полученных на 30-е сутки эксперимента в 3-й и 4-й группах, определялись достоверные рзличия в соотношении типов коллагена по сравнению с таковым в предыдущие сроки. Соотношение коллагена I и III типов на 30-е сутки при имплантации эндопротеза из полипропилена в 3-й группе (рис. 2, а) было достоверно меньше, чем в 4-й группе животных, которым имплантировали комбинированный эндопротез (рис. 2, б), — 1,49 и 1,92 соответственно. Плотность коллагеновых волокон в 4-й группе составила 219,1±18,4 пикселя на 1 дюйм.

Рис. 2. Микрофотографии на 30-е сутки эксперимента. Зоны имплантации эндопротеза из полипропилена (а) и комбинированного эндопротеза (б). В обоих случаях с добавлением в кормовой рацион калия оротата. Окраска пикрофуксином красным. Ув. 400.

На 60-е сутки эксперимента в 3-й группе животных отмечалась многослойная парапротезная капсула без дефектов, плотность которой составила 262,7±16,4 пикселя на 1 дюйм. При использовании калия оротата и комбинированного эндопротеза на 60-е сутки эксперимента соотношение коллагена I и III типов составило 2,94, плотность парапротезной капсулы — 305,2±21,2 пикселя на 1 дюйм.

При экспериментальном использовании полипропиленового эндопротеза в сочетании с калия оротатом на 90-е сутки капсула имела незначительные «рыхлые» участки соединительнотканной капсулы (рис. 3, а), плотность коллагеновых волокон была равна 323,9±13,2 пикселя на 1 дюйм, что по сравнению с 4-й группой животных было достоверно меньше.

Рис. 3. Микрофотографии на 90-е сутки эксперимента. Зоны имплантации эндопротеза из полипропилена (а) и комбинированного эндопротеза (б). В обоих случаях с добавлением в кормовой рацион калия оротата. Окраска пикрофуксином красным. Ув. 400.

Применение калия оротата в 4-й группе животных в срок 90 сут (рис. 3, б) позволило значительно увеличить показатели плотности коллагеновых волокон (364,5±13,1 пикселя на 1 дюйм), соотношения типов коллагена (3,44) по сравнению с этими показателями в группах, в которых использовали эндопротез из полипропилена, и в группах животных, которым препарат в кормовой рацион не добавляли.

Изучение парапротезной капсулы на 7-е и 10-е сутки эксперимента при использовании калия оротата в 3-й и 4-й группах животных показало явное отсутствие различий в соотношении типов коллагена между собой, а также по сравнению с теми группами животных, в которых препарат не применяли. Вероятнее всего, отсутствие различий в соотношении типов коллагена было связано с воспалительной реакцией и сменой фаз воспаления (альтерации и экссудации) в эти сроки исследования, что свойственно нормальному ответу организма на травму и внедрение инородного тела (синтетического материала).

При сравнении результатов исследования соотношения типов коллагена в группах с использованием одного и того же эндопротеза, начиная с 30-х суток и в последующие сроки эксперимента, отмечались достоверно лучшие результаты в группах, в которых выполняли стимуляцию коллагеногенеза калия оротата. Помимо явного влияния этого препарата на синтез коллагена, полученные результаты могли быть обусловлены сменой фаз воспаления и наступлением фазы пролиферации в эти сроки (30 сут и далее).

Также в ходе нашего исследования, начиная с 30-х суток и до окончания эксперимента, было выявлено лучшее течение процесса коллагеногенеза и формирование соединительнотканной парапротезной капсулы при использовании комбинированного эндопротеза, чем в группе животных с эндопротезом из полипропилена. С учетом полученных результатов, вероятнее всего, произошла стимуляция коллагеногенеза полимолочной кислотой, покрывающей нити комбинированного эндопротеза.

Микроскопическая оценка препаратов на 90-е сутки эксперимента показала, что соединительнотканная капсула по плотности коллагеновых волокон, соотношению коллагена I и III типов достигает своего максимума в обеих группах. При анализе цветовой гистограммы выявлено преобладание красного цвета, свидетельствовавшее о доминировании коллагена I типа над III. Такое преобладание говорило о лучшей прочности парапротезной капсулы, что важно для предотвращения возникновения рецидива вентральной грыжи. Учитывая явное стимулирующее действие калия оротата на коллагеногенез и преобладание коллагена I типа, наблюдавшиеся в ходе эксперимента, можно рекомендовать применение калия оротата для профилактики возникновения рецидива грыжи брюшной стенки у пациентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Калия оротат инструкция, цена в аптеках Украины

Состав и форма выпуска

Состав

• действующее вещество: 1 таблетка содержит калия оротата (в пересчете на 100% сухое вещество) 500 мг;
• Вспомогательные вещества: лактоза, магния стеарат, сорбит (Е 420).

Форма выпуска

Таблетки (по 10 таблеток в блистере).

Основные физико-химические свойства

Таблетки белого цвета, плоскоцилиндрической формы, со скошенными краями (фаской) и риской.

Фармакологическое действие

Калия оротат оказывает общий стимулирующее влияние на обменные процессы, участвует в белковом и углеводном обменах. Основным структурным элементом калия оротата является оротовая кислота.

Оротовая кислота обеспечивает синтез пиримидиновых оснований (урацила, тимина, цитозина) в процессе синтеза нуклеиновых кислот, которые участвуют в синтезе белковых молекул. Участие оротовой кислоты в углеводном обмене заключается в ее нормализующее влияние на обмен галактозы.

Калия оротат как анаболический препарат применяют для восстановления нарушений белкового обмена и стимуляции процессов метаболизма.

Показания к применению

Калия оротат применяют в составе комплексной терапии:

• заболеваний печени и желчных путей, вызванных острыми и хроническими интоксикациями (кроме цирроза печени с асцитом)
• дистрофии миокарда
• инфаркта миокарда
• хронической сердечной недостаточности II-III стадии;
• аритмий (экстрасистолий)
• алиментарной и алиментарно-инфекционной гипотрофии у детей
• прогрессирующей мышечной дистрофии;
• анемии
• галактоземии;
• дерматозов.

Применяют также при повышенных физических нагрузках и в период восстановления после тяжелых заболеваний.

Противопоказания

• Повышенная чувствительность к компонентам препарата;
• цирроз печени с асцитом;
• острая и выраженная хроническая почечная недостаточность;
• лимфогрануломатоз;
• злокачественные заболевания органов кроветворения;
• гиперкалиемия.

Способ применения и дозы

Калия оротат применять внутрь за 1 час до еды или через 4 часа после еды. Таблетки глотать не разжевывая, запивая 150-200 мл воды.

Взрослым назначать по 250-500 мг 2-3 раза в сутки. Суточная доза составляет 500-1500 мг. В отдельных случаях, при необходимости повышения терапевтического эффекта, суточную дозу для взрослых увеличить до 3000 мг.

Курс лечения — 3-5 недель, при необходимости курс лечения повторить через месяц.

У детей старше 5 лет Калия оротат применять в суточной дозе 10-20 мг на кг массы тела. Указанную суточную дозу разделить на 2-3 приема.

Передозировка

Информации о случаях передозировки нет. Возможно усиление побочных эффектов.

Побочные действия

Препарат обычно хорошо переносится. В отдельных случаях возможны аллергические (дерматит, кожная сыпь) и диспепсические (тошнота, рвота, диарея) явления, которые быстро проходят при отмене препарата.

При применении в высоких дозах на фоне низкобелковой диеты возможно развитие жировой дистрофии печени.

Возможно развитие гиперкалиемии, сопровождающееся парестезиями, изменениями показателей ЭКГ.

Особые указания

Применение в период беременности и кормления грудью

Применение препарата в период беременности оправдано только в том случае, когда предполагаемая польза для матери превышает потенциальный риск для плода. В случае применения препарата кормление грудью следует прекратить.

Дети

Не рекомендуется применять детям до 5 лет.

Способность влиять на скорость реакции при управлении автотранспортом или другими механизмами

Препарат не влияет на скорость реакции при управлении автотранспортом или работе с другими механизмами.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами и другие формы взаимодействия

Эффективность Калия оротата повышается при одновременном применении с фолиевой кислотой и цианокобаламином. Калия оротат улучшает переносимость сердечных гликозидов (например, дигоксин, целанид).

При одновременном применении с калийсберегающими диуретиками, ингибиторами АПФ (АПФ) возможно развитие гиперкалиемии.

Препарат можно применять одновременно с витаминами, кардиотоническими препаратами.

Вяжущие и обволакивающие средства (например, где этанол, сукральфат, алгелдрат, магния гидроксид) могут несколько уменьшить всасывание калия оротата в желудочно-кишечном тракте.

При одновременном применении с ГКС, инсулином, миорелаксантами, оральными контрацептивами уменьшается эффективность оротовой кислоты.

Условия хранения

В оригинальной упаковке при температуре не выше 25°С.

В недоступном для детей месте.

Срок годности — 4 года.

Обратите внимание!

Описание препарата Калия оротат на этой странице — упрощенная авторская версия сайта apteka911, созданная на основании инструкции/ий по применению. Перед приобретением или использованием препарата вы должны проконсультироваться с врачом и ознакомиться с оригинальной инструкцией производителя (прилагается к каждой упаковке препарата).

Информация о препарате предоставлена исключительно с ознакомительной целью и не должна быть использована как руководство к самолечению. Только врач может принять решение о назначении препарата, а также определить дозы и способы его применения.

Калия оротат :: Инструкция :: Цена :: Описание препарата

Инструкция составлена коллективом авторов и редакторов сайта Piluli. Список авторов справочника лекарств представлен на странице редакции сайта: Редакция сайта.

Ссылки на использованные источники информации.

Количество просмотров: 10303.

Арарат Балларат Калийная сетка геодезическая

Всплывающее окно расширенного поиска позволяет создавать / уточнять сложные запросы в одном всплывающем окне с вкладками. Из расширенного поиска вы можете создавать логические поисковые запросы и применять к поиску одну или несколько категорий фильтров.

Обратите внимание, что нет определенного порядка вкладок в расширенном поиске, и вы можете применять фильтры в любом порядке по вашему выбору. Если есть несколько вариантов для категории фильтра, например (Субъекты) отображаемые параметры и количество записей основаны на вашем запросе.Каждый раз, когда вы переключаете вкладки, доступные параметры фильтра и счетчики записей обновляются, чтобы отразить любые изменения на предыдущей вкладке.

Просмотр расширенного поиска

По мере создания / уточнения поиска во всплывающем окне расширенного поиска вы можете просмотреть весь поиск и количество результатов, которые будут возвращены, выбрав вкладку «Обзор». Вкладка также позволяет вам изменять поиск, удаляя фильтры.

Конструктор запросов поисковых запросов

Конструктор запросов предоставляет способ поиска записей с использованием нескольких комбинаций поисковых терминов и логических операторов.

Строки запроса

Расширенные запросы, созданные с помощью конструктора запросов, состоят из строк. Каждая строка состоит из поля, оператора условия и значения. Значение указывает поиску, что искать, Поле указывает поиску, где искать, а Оператор условия сообщает поиску, должна ли запись «содержать» или «исключать» значение.

• Несколько условий поиска, введенных в одно значение условия, рассматриваются поиском как разделенные логическим оператором AND.
• Условия поиска обрабатываются как нечувствительные к регистру. «Дождь» — это то же самое, что «дождь».
• Точные фразы можно также вводить в «Значения условий», используя кавычки «» Например. «ледяные щиты»
• The? Символ может использоваться для поиска по подстановочному знаку, состоящему из одного символа. Например. Организации.
• Символ * может использоваться для поиска по нескольким символам с подстановочными знаками. Например. Продлить *

Примечание. Подстановочные знаки можно применять к отдельным условиям поиска, но не к фразам.

Логические операторы

Конструктор запросов поддерживает использование логических операторов «И» и «ИЛИ» между строками запроса. Операторы применяются на уровне поиска, то есть все строки запроса разделяются одним и тем же логическим значением. Изменение логического значения между двумя строками запроса изменит значение между всеми строками запроса.

Пример — построение расширенного запроса

Здесь мы шаг за шагом построим расширенный запрос, в котором мы хотели бы найти все записи, которые содержат «дождь» в заголовке и «наводнение» и «погода» в описании.

1. Убедитесь, что вы начали новый поиск, удалив все предыдущие поиски.
2. Откройте всплывающее окно расширенного поиска и убедитесь, что вы находитесь на вкладке «Поисковые запросы». По умолчанию должны отображаться две строки запроса.
3. В раскрывающемся списке «Поле» в 1-й строке запроса выберите «Заголовок».
4. В пустом поле значения в 1-й строке запроса введите поисковый запрос «Дождь».
5. В раскрывающемся списке «Поле» во 2-й строке запроса выберите «Описание».
6. В пустом поле значения во 2-й строке запроса введите поисковый запрос «наводнение».
7. Нажмите кнопку «Добавить строку», чтобы добавить третью строку запроса.
8. В раскрывающемся списке «Поле» в третьей строке запроса выберите «Описание».
9. В пустом поле значения в третьей строке запроса введите поисковый запрос «погода».
10. Нажмите кнопку «Поиск», чтобы выполнить поиск.

Тематический фильтр

Вкладка «Тема» позволяет уточнить поиск, выбрав темы, которые использовались для описания записей данных. Тематический словарь по умолчанию в Research Data Australia, который постоянно используется поставщиками данных, — это ANZSRC Field of Research.Также доступны другие поддерживаемые тематические словари, которые можно выбрать с помощью раскрывающегося списка, отображаемого в верхней части вкладки (обратите внимание, что для их загрузки может потребоваться некоторое время).

Тематические словари отображаются в виде иерархических деревьев с возможностью просмотра. Литералы темы, отображаемые в виде зеленых ссылок, можно щелкнуть, чтобы отобразить или скрыть дочерние темы.

Предметы могут быть добавлены или удалены из вашего поиска с помощью флажка, отображаемого рядом с каждым литералом темы. Можно выбрать несколько предметов в рамках одного предметного словаря, а также из разных словарей.

Количество записей с темой будет отображаться в конце каждого предметного литерала, например, «Экономика (30)». Обратите внимание, что, поскольку отношения между записями и субъектами могут быть много-много, подсчет, отображаемый с предметами, не обязательно будет соответствовать количеству записей, возвращаемых вашим поиском. Например, вы можете увидеть 3 объекта со знаком (1) рядом с ними. Это может разрешить одну запись, содержащую всех трех субъектов. Если записей с предметным значением не существует, с литералом будет отображаться (0).

Фильтр поставщика данных

Вкладка «Поставщик данных» позволяет ограничить поиск записями, опубликованными в Research Data Australia конкретными поставщиками. Количество записей, доступных от поставщиков, будет отображаться в конце каждого литерала поставщика, например «Университет Бонда (25)».

Поставщики данных могут быть добавлены или удалены из поиска с помощью флажка, отображаемого с каждым литералом поставщика данных.

Фильтр доступа

Вкладка «Доступ» позволяет ограничить поиск записями с определенными типами доступа.Записи данных в Research Data Australia делятся на один из четырех типов доступа:

Открыть

Легкодоступные и повторно используемые данные.

Условный

Доступные и повторно используемые данные при соблюдении определенных условий (например, требуется бесплатная регистрация)

Ограничено

Доступ к данным каким-то образом ограничен (например, доступен только определенной группе пользователей или в определенном физическом месте)

Другое

<нет значения> или <пользовательское настраиваемое значение>

Количество записей, доступных для каждого типа доступа, будет отображаться в конце литерала доступа E.g «Открытый (23)».

Типы доступа могут быть добавлены или удалены из поиска с помощью флажка, отображаемого с каждым литералом доступа.

Лицензионный фильтр

Количество записей, доступных в каждой группе фильтров лицензий, будет отображаться в конце буквенного обозначения лицензии, например, «Нет лицензии (57)».

Лицензионные группы могут быть добавлены или удалены из поиска с помощью флажка, отображаемого рядом с каждым лицензионным литералом.

Фильтр периода времени

Вкладка «Период времени» позволяет ограничить поиск только записями, которые содержат информацию о временном охвате *, попадающую в определенный годовой диапазон. Фильтр реализован в виде пары текстовых полей, позволяющих ввести «С года». и «Год». Текст-заполнитель, отображаемый в текстовых полях, указывает доступный временной диапазон, в котором вы можете выполнять поиск.

Чтобы отфильтровать результаты по периоду времени: Откройте всплывающее окно расширенного поиска и убедитесь, что вы находитесь на вкладке «Период времени».Введите диапазон периода времени с помощью полей From Year и To Year. Нажмите кнопку «Поиск», чтобы выполнить поиск.

* Временное покрытие = период времени, в течение которого были собраны данные или проводились наблюдения

Примечание: если записи в вашем поиске не содержат временной информации, на вкладке будет отображаться следующее сообщение: «Результаты поиска не содержат информации о периоде времени».

Фильтр местоположения

Вкладка «Местоположение» позволит вам отфильтровать результаты поиска только для записей, для которых описана сопоставимая информация о местоположении, которая попадает в указанный регион.

1. Откройте всплывающее окно расширенного поиска и убедитесь, что вы находитесь на вкладке «Местоположение».
2. Используйте инструменты навигации по карте в левой части карты, пока не получите требуемый вид карты.
3. Выберите инструмент «Коробка» ().
4. Щелкните карту и перетащите мышь, чтобы нарисовать прямоугольник.
5. Отпустите кнопку мыши, чтобы закончить. Если есть записи с информацией о местоположении, доступной для вашего выбора, для первых 15 записей будет отображаться красный маркер.
6. Нажмите кнопку «Поиск», чтобы выполнить поиск.

Примечание. Чтобы изменить или перерисовать область, просто выполните указанные выше действия еще раз.

Kv2 образуют соединения эндоплазматического ретикулума / плазматической мембраны посредством взаимодействия с VAPA и VAPB

Значимость

Помимо функционирования в качестве канала замедленного выпрямления K ⁺ , Kv2.1 взаимодействует с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом (ER) в нейроны гиппокампа с образованием соматических соединений ER / плазматической мембраны (ER / PM).Активность нейронов и инсульт вызывают высвобождение Kv2.1 из кортикального ER и последующее удаление ER из PM. Нейрональные контакты ER / PM составляют> 10% поверхности клетки и играют роль в мембранном переносе, регуляции импульсного возбуждения, гомеостазе Ca ²⁺ и контроле липидов PM. Мы сообщаем здесь, что взаимодействие канала Kv2 с VAMP-ассоциированным белком (VAP) связывает кортикальный ER с PM через неканонический мотив FFAT, содержащийся в C-конце канала. Поскольку VAPs обладают широким диапазоном взаимодействия, Kv2-индуцированное ремоделирование ER и концентрация VAP в контактах ER / PM, вероятно, играют центральную роль в физиологии нейронов.

Abstract

Kv2.1 демонстрирует две различные формы паттернов локализации на плазматической мембране нейронов: одна популяция является свободно диффузионной и регулирует электрическую активность через зависящую от напряжения проводимость K ⁺ , а вторая локализуется в кластерах микрометрового размера, которые содержат плотно упакованные, но непроводящие каналы. Мы ранее установили, что эти кластеры представляют соединения эндоплазматического ретикулума / плазматической мембраны (ER / PM), которые функционируют как концентраторы мембранного переноса, и что Kv2.1 играет структурную роль в формировании этих участков контакта с мембраной как в первичных культурах нейронов, так и в трансфицированных клетках HEK. Кластеризация и образование контактов ER / PM регулируются фосфорилированием в пределах C-конца канала, предлагая клеткам быстрый динамический контроль над физическими взаимоотношениями между кортикальным ER и PM. Настоящее исследование обращается к механизмам, с помощью которых Kv2.1 и связанный с ним канал Kv2.2 взаимодействуют с мембраной ER. Используя методы биотинилирования на основе близости в трансфицированных клетках HEK, мы идентифицировали ER VAMP-ассоциированные белки (VAP) как потенциальные Kv2.1 интеракторы. Для подтверждения того, что Kv2.1 и -2.2 связывают VAPA и VAPB, использовались анализы на основе колокализации / перераспределения, нокдауна siRNA и резонансного переноса энергии Ферстера (FRET). Химеры CD4, содержащие последовательность от С-конца Kv2.1, использовали для идентификации неканонического VAP-связывающего мотива. VAP были впервые идентифицированы как белки, необходимые для высвобождения нейротрансмиттеров в Aplysia , и теперь известно, что они являются многочисленными каркасными белками, участвующими в формировании сайтов контакта с мембраной по всему ER.Интерактом VAP включает AKAP, киназы, механизмы мембранного транспорта и белки, регулирующие транспорт невезикулярных липидов от ER к PM. Следовательно, Kv2-индуцированная концентрация VAP в местах контакта ER / PM, по прогнозам, будет иметь широкое влияние на биологию нейрональных клеток.

Kv2.1 и Kv2.2 представляют собой многочисленные потенциал-управляемые каналы K ⁺ в головном мозге млекопитающих. Kv2.1 является преобладающим каналом в гиппокампе, в то время как оба канала по-разному экспрессируются в коре головного мозга (1).Оба канала локализуются в кластерах микрометрового размера на нейрональной поверхности сомы, проксимальных дендритах и ​​начальном сегменте аксона (AIS) in vivo и in vitro (2). Кластерные каналы Kv2.1 рассеиваются в ответ на ишемические или гипоксические условия, нейрональную активность и индуцированную глутаматом эксайтотоксичность посредством кальциневрин-зависимого дефосфорилирования С-конца канала (3, 4). Хотя кластеризация Kv2.1 была впервые предложена для регулирования зависимости напряжения канала (5), несколько исследований указывают на слабую связь между кластеризацией каналов и регулированием проводимости (6-8).Фактически, наши данные свидетельствуют о том, что популяция свободно диффузионных каналов обеспечивает зависящую от напряжения проводимость K ⁺ , которая регулирует электрическую активность нейронов, в то время как сгруппированные каналы являются непроводящими и имеют другие функции. Ранее мы сообщали, что кластеры представляют собой центры трафика, в которых локализованы вставка и извлечение мембранного белка на поверхности клетки (9). Эти данные согласуются с результатами Lotan и соавторов (10), которые указывают на одну непроводящую функцию Kv2.1 заключается в усилении высвобождения плотных сердцевинных пузырьков из нейроэндокринных клеток. Недавние исследования также показывают, что кластеры Kv2.1 регулируют экзоцитоз инсулина из бета-клеток поджелудочной железы (11, 12). Взятые вместе, эти исследования убедительно подтверждают, что кластеризация Kv2.1 играет структурную роль, связанную с клеточной биологией на поверхности нейронов. Действительно, мы недавно определили, что кластерный паттерн локализации обусловлен взаимодействием Kv2.1 с кортикальным эндоплазматическим ретикулумом (ER) и индукцией стабильных участков контакта ER / плазматической мембраны (ER / PM) (13).В нейронах гиппокампа крыс это кортикальное ремоделирование ER регулируется активностью, так как обработка глутаматом вызывает декластеризацию Kv2.1, за которой вскоре следует ретракция кортикального ER с поверхности клетки (13). Хотя контакты ER / PM лучше всего поняты из-за их роли в поступлении кальция и невезикулярном переносе липидов из ER на поверхность клетки (14), дополнительные исследования показывают, что эти микродомены регулируют нейрональную вспышку (15) и уровни PIP2 в плазматической мембране ( 16). Кроме того, недавнее исследование, проведенное Hess и соавторами (17), показывает, что сайты контакта нейронов с ER / PM составляют ~ 12% соматической поверхности in vivo.Учитывая обилие и функциональную значимость контактов нейронов ER / PM, а также вероятность того, что на процессы в этих доменах влияет взаимодействие Kv2.1-ER, чрезвычайно важно понять механизмы, лежащие в основе зависимого от активности взаимодействия между каналами Kv2 и корковый ER.

Наша настоящая работа демонстрирует, что каналы Kv2 взаимодействуют с VAMP-ассоциированными белками (VAP), встроенными в мембрану ER. VAP были впервые обнаружены у Aplysia , где они необходимы для быстрого высвобождения нейромедиаторов (18).В настоящее время известно, что VAP являются повсеместными каркасными белками ER с большим и постоянно растущим списком взаимодействующих, включая AKAP, протеинкиназы, Rab и белки-переносчики липидов (19, 20). Интересно, что замены одной аминокислоты в VAP-B вызывают позднюю мышечную атрофию позвоночника и боковой амиотрофический склероз (БАС) типа 8 (21, 22), что интригует, учитывая, что кластеризация Kv2.1 над кортикальным ER также существует в альфа-диапазоне. мотонейроны (23). И кластеризация каналов Kv2, и индукция соединений ER / PM происходит через неканонический мотив связывания VAP, содержащийся в С-конце канала Kv2.Этот связывающий мотив содержит сайты фосфорилирования, которые, как известно, регулируют кластеризацию Kv2 и ремоделирование кортикального ER. Баланс фосфорилирования / дефосфорилирования в этих сайтах, вероятно, управляет сродством к VAPs, таким образом объясняя зависимость от фосфорилирования взаимодействия Kv2-ER. Так как каналы Kv2 концентрируют VAPs в месте контакта ER / PM, взаимодействие Kv2-VAP, обобщенное в настоящей работе, вероятно, будет иметь большое влияние на физиологию нейронов.

Результаты

Идентификация VAP в качестве предполагаемого партнера по связыванию Kv2 ER.

Предыдущие исследования, в которых применялась аффинная очистка Kv2.1 на основе антител либо из трансфицированных клеток HEK, либо из мозга крысы, выделяли белок канала, свободный от каких-либо избыточных взаимодействующих белков (24). Этот результат не является неожиданным, поскольку большая часть Kv2.1 нерастворима в неионогенных детергентах, используемых для аффинной очистки (24⇓ – 26), и макромолекулярные комплексы, содержащие Kv2.1, вероятно, будут находиться в этой нерастворимой в детергенте фракции. Действительно, при визуализации кластеров GFP-Kv2.1 в трансфицированных клетках HEK во время нанесения 1% TX-100 при 37 ° C, условиях, которые солюбилизируют предполагаемые структуры липидного рафта (27), кластеры оставались неповрежденными, поскольку остальная часть мембраны оставалась неизменной. солюбилизированный.Поскольку попытки биохимической очистки этих нерастворимых в детергенте микродоменов с использованием различных процедур фракционирования оказались безуспешными, мы использовали методы биотинилирования APEX (28) в трансфицированных клетках HEK для идентификации предполагаемых Kv2.1-взаимодействующих резидентных белков ER, ответственных за образование Переходы ER / PM. APEX в присутствии биотин-фенолов и перекиси водорода генерирует свободно диффундирующие, но короткоживущие радикалы биотина, которые неразборчиво биотинилируют близлежащие белки.Чтобы максимизировать биотинилирование соседних белков, в отличие от самого Kv2.1, APEX был присоединен к цитозольному концу бета-субъединицы Kv2.1 AMIGO, как показано на рис. 1 A . С-концевая последовательность Kv2.1, о которой известно, что она участвует в кластеризации и фенотипе связывания ER, обозначена ранее описанными точечными мутациями, которые отменяют кластеризацию сомы и взаимодействие ER, выделенными черным цветом (29). AMIGO, единственная молекула трансмембранной клеточной адгезии, ассоциируется с кластером Kv2.1 каналы при коэкспрессии (30, 31). Важно отметить, что в наших клетках HEK AMIGO на PM не кластеризуется и не связывается с кортикальным ER, когда экспрессируется отдельно. Как показано на фиг. 1 B , совместная экспрессия CFP-Kv2.1 и AMIGO-YFP-APEX индуцировала биотинилирование белка вблизи кластеров Kv2.1, на что указывает связывание стрептавидина, конъюгированного с CF640R. Связывание стрептавидина было наиболее заметным в кластерах поверхности клеток Kv2.1, указывая на локализованное биотинилирование (фиг. 1 B , нижняя правая вставка ).Затем был проведен вестерн-блоттинг для характеристики биотинилированных белков. Нетрансфицированные клетки и клетки, экспрессирующие растворимый APEX, исследовали в дополнение к клеткам, в которых AMIGO-YFP-APEX экспрессировался отдельно, с Kv2.1 или с некластеризованным точечным мутантом Kv2.1 (S586A) (13). Вестерн-блоты зондировали стрептавидином, конъюгированным с флуорофором, для обнаружения биотинилированных белков. Как указано звездочкой на фиг. 1 C , белок 33 кДа был обнаружен в клетках, котрансфицированных AMIGO и Kv2.1, но не в клетках, трансфицированных либо одним AMIGO, либо AMIGO плюс точечный мутант Kv2.1 (S586A), который не взаимодействует с ER. VAP представляют собой многочисленные ER-белки размером 33 кДа, которые участвуют в формировании мембранных сайтов контакта между ER и различными органеллами (20). Таким образом, очевидным кандидатом стали ВАП.

Использование бесконтактного биотинилирования для идентификации потенциальных интеракторов Kv2.1. ( A ) Схема подъезда. APEX был присоединен к C-концевому концу субъединицы бета Kv2.1, AMIGO.( B ) Локализация биотинилирования, опосредованного APEX. Клетки HEK трансфицировали Kv2.1 и AMIGO-YFP-APEX, обрабатывали биотином и H ₂ O ₂ , а затем фиксировали с использованием формальдегида и метили стрептавидином, конъюгированным с CF640R, для визуализации биотинилированных белков, как показано с помощью лазерного сканирования. конфокальный микроскоп. Биотинилирование, локализованное в соединениях ER / PM, происходит только в клетках, экспрессирующих AMIGO-YFP-APEX и Kv2.1 (см. , нижняя правая вставка для улучшенного представления о биотинилировании в Kv2.1 кластер). (Масштаб: 5 мкм.) ( C ) Параллельные образцы собирали и подвергали Вестерн-блот-анализу без аффинной очистки, используя стрептавидин-пероксидазу хрена для визуализации всех биотинилированных белков. Диапазон 33 кДа присутствует, когда AMIGO-YFP-APEX коэкспрессируется с каналом WT Kv2.1 (звездочка). Эта полоса отсутствует на указанных контрольных дорожках, т.е. без какой-либо трансфекции APEX, с экспрессией растворимого APEX и когда AMIGO-YFP-APEX экспрессируется отдельно или экспрессируется с мутантным Kv2.1 канал, который не может образовывать переходы ER / PM.

VAP специально перераспределяют для Kv2-индуцированных переходов ER / PM.

В то время как наша предыдущая работа (13) продемонстрировала индукцию Kv2.1 соединений ER / PM, в то время не было известно ни одного партнера по прямому связыванию. Наш первый подход к определению, взаимодействуют ли VAP с Kv2.1, заключался в проведении экспериментов по совместной локализации. VAPA-GFP или VAPB-GFP экспрессировались либо отдельно, либо с конструкцией Kv2.1-loopBAD, которая позволяла мечение CF640-стрептавидином только поверхностных каналов.Поскольку все клетки экспрессируют эндогенные VAP, экзогенные VAP, меченные GFP, действуют как маркер для эндогенных белков при экспрессии на низких уровнях (20). Как проиллюстрировано на фиг. 2 A , когда выражается отдельно, VAPA-GFP показывает равномерное распределение по всей ER, как и ожидалось. Рис. 2 B показывает, что в присутствии Kv2.1 локализация VAPA-GFP резко изменялась с очевидным перераспределением в пользу Kv2.1-индуцированных соединений ER / PM. Затем мы использовали junctophilin 4 (JPh5) для индукции соединений ER / PM независимо от Kv2.1, чтобы исключить возможность того, что VAP благоприятствует всем контактам ER / PM, независимо от молекулярного состава. JPh5 представляет собой мембранный белок ER, который индуцирует мембранные контакты путем связывания липида PM (32). Когда коэкспрессируется с mCherry-JPh5, VAPA-GFP остается равномерно диспергированным по всему ER, не обнаруживая концентрации на индуцированных JPh5 контактах ER / PM (фиг. 2 C ). Таким образом, наличие соединений ER / PM само по себе не влияет на распределение VAPA-GFP. Мы также совместно экспрессировали GFP-Kv2.2 с VAPB-Ruby2, начиная с Kv2.2 также кластеры над ER (1, 30). Фиг.2 D показывает, что Kv2.2 также концентрирует VAP на сайтах индуцированного контакта с ER / PM. Когда Kv2.1 и Kv2.2 коэкспрессируются с VAPB, все три белка колокализуются в одних и тех же сайтах контакта ER / PM, как показано в SI Приложение , Fig. S1 A . Чтобы определить, зависит ли перераспределение VAP в Kv2.1-индуцированные контакты ER / PM от связывания мотива FFAT с помощью VAP, мы соэкспрессировали мутант VAPA K87D / M89D (20), который неспособен связывать мотивы FFAT, с Kv2.1, как показано на рис. 2 E . Этот мутант VAP показал меньшее перераспределение в Kv2.1-индуцированные соединения ER / PM, но все еще был немного обогащен в кластерах Kv2.1. Взятые вместе, эти данные предполагают, что концентрация VAP в соединениях ER / PM зависит от присутствия Kv2 каналов и что эта локализация в значительной степени зависит от функционального FFAT-связывающего мотива в белке VAP.

каналов Kv2 влияют на локализацию VAPA и VAPB в ячейках HEK. ( A ) VAPA-GFP, экспрессируемый отдельно, демонстрирует однородную локализацию по всей ER.( B ) VAPA-GFP, экспрессируемый с помощью Kv2.1-loopBAD, перераспределяется в индуцированные Kv2.1 соединения ER / PM. ( C ) VAPA, экспрессируемый с помощью белка, образующего соединение ER / PM, JPh5, не перераспределяется по соединениям. ( D ) Kv2.2, коэкспрессируемый с VAPB-GFP, перераспределяет этот VAP в индуцированные соединения ER / PM. ( E ) VAPA (K87D / M89D) обладает пониженной способностью перераспределяться в соединения ER / PM, индуцированные Kv2.1. (Масштабные полосы: 5 мкм.) ( F ) Гистограмма, суммирующая перераспределение VAP путем расчета отношения флуоресценции в переходах ER / PM к флуоресценции в ER глубже внутри клетки, когда соединения формируются с использованием Kv2 и / или JPh5, как указано.Только Kv2.1 и Kv2.2 увеличивают коэффициент флуоресценции VAP. Для анализа использовалось логарифмическое преобразование, чтобы удовлетворить условие однородности дисперсии, и был выполнен односторонний дисперсионный анализ, F (8, 36) = 25,699, P = 1,106 × 10 ⁻¹² с апостериорным попарным Тесты Тьюки. * P <0,0001, значительная разница по сравнению с контролем dsRedER. ^# P <0,01 значимость. Планки погрешностей представляют SEM. В каждом случае исследовали двадцать пять областей интереса из пяти ячеек.

Эффект экспрессии Kv2.1 на локализацию VAP суммирован на рис. 2 F . Здесь мы рассчитали отношение флуоресценции VAP-GFP в PM к цитоплазматическому сигналу ER, расположенному дальше внутри клетки (коэффициент флуоресценции), чтобы количественно оценить степень концентрации VAP в соединениях ER / PM, образованных различными белками. dsRedER, растворимый маркер ER, имел отношение 0,67, что указывает на более низкую интенсивность ER в кластерах Kv2.1 на PM по сравнению с сигналом в ER глубже внутри клетки.Это соотношение существенно не отличалось от соотношений VAPA и VAPB при совместной экспрессии с JPh5 (соотношение 0,64, P = 1 для VAPA и соотношение 0,62, P = 0,9996 для VAPB). В отличие от того, что наблюдалось с соединениями, индуцированными JPh5, VAP были значительно более сконцентрированы в соединениях Kv2.1 ER / PM (соотношение 2,9, P ≤ 0,0001, для VAPA и соотношение 2,9, P ≤ 0,0001, для ВАПБ). Обратите внимание, что JPh5 и Kv2.1 образуют схожие по внешнему виду переходы ER / PM (рис.2 C ) и, фактически, Kv2.1 и JPh5 совместно локализуются в пределах одних и тех же соединений, когда выражаются вместе, как показано в приложении SI , рис. S1 B . Присутствие Kv2.1 рядом с JPh5 в местах контакта ER / PM приводит к значительному перераспределению VAPA, не наблюдаемому, когда JPh5 формирует только соединения (соотношение 2,90 против 0,67, P = ≤0,0001, по сравнению с одним JPh5). Обратите внимание, что хотя соотношение 0,87 для VAPA (K87D / M89D) не было статистически значимым по сравнению с контролем dsRedER, наблюдалась тенденция к увеличению концентрации, причем это перераспределение было заметно заметно в некоторых клетках.Эти данные подтверждают идею, что связывание мотива FFAT является критическим для перераспределения VAP в Kv2.1-индуцированные соединения ER / PM; однако может существовать вторичный механизм, с помощью которого VAPs концентрируются на Kv2.1-содержащих соединениях ER / PM, который не зависит от связывания мотива FFAT.

Анализ резонансной передачи энергии Фёрстера поддерживает прямое взаимодействие Kv2.1 – VAP на соединениях ER / PM, индуцированных Kv2.1.

Данные, представленные до сих пор, подтверждают взаимосвязь между каналами Kv2 и VAP, но не демонстрируют прямого связывания между двумя белками.Поэтому мы использовали резонансный перенос энергии Ферстера (FRET), чтобы определить, вероятно ли, что эти два белка находятся в прямом контакте. Мы прикрепили акцептор FRET (mRuby2) и донор (Clover) к цитоплазматическим доменам VAP и N-концам Kv2.1 соответственно. Связанная тандемная конструкция Clover – mRuby2 использовалась в качестве положительного контроля, тогда как совместная экспрессия растворимых несвязанных mRuby2 и Clover служила отрицательным контролем. Сигналы FRET, полученные от этих двух элементов управления, и FRET, наблюдаемые между Kv2.1 и VAPA, показаны на рис.3 A , справа . Сигналы FRET, наблюдаемые во всех экспериментах, представлены на рис. 3 B . Мы наблюдали значительную эффективность FRET между Kv2.1 и как VAPA, так и VAPB (75% связанного контроля и 63% связанного контроля, P ≤ 0,000001 и P ≤ 0,000001 по сравнению с несвязанным контролем, соответственно), что указывает на белок– белковое взаимодействие. Напротив, несвязанные Clover и mRuby2 отображали значения эффективности FRET, которые составляли только 3% от связанного контроля.Дополнительный положительный контроль исследовал эффективность FRET, существующую между субъединицами Kv2.1 в пределах гетеромерного канала, то есть субъединицами mRuby2- и Clover-Kv2.1 (68% связанного контроля). Снижение FRET между субъединицами Kv2.1 по сравнению с положительным контролем Clover-mRuby2, вероятно, связано со случайной сборкой тетрамера канала. Интересно, что второй отрицательный контроль, мутант VAPA (K87D / M89D), который неспособен связывать мотивы FFAT (33), показал уменьшенное, но все же значительное (16% связанного контроля, P ≤ 0.000001 по сравнению с несвязанным контролем) Эффективность FRET. Этот сигнал может быть связан с олигомеризацией с эндогенными VAP через трансмембранный домен, как было описано ранее (34). По сути, мутант VAPA (K87D / M89D), неспособный связывать Kv2.1, олигомеризуется с эндогенными VAP, которые связаны с каналом. Такой механизм позволит накопление VAP с доступными доменами связывания мотивов FFAT в пределах Kv2.1-индуцированных контактов ER / PM.

FRET между Kv2.1 и оба VAP в трансфицированных клетках HEK. ( A ) Репрезентативные изображения эффективности донора, акцептора и FRET между указанными конструкциями. Величина эффективности FRET проиллюстрирована типичными тепловыми картами. (Шкала: 5 мкм.) ( B ) Количественная оценка эффективности FRET. Здесь сигналы FRET были стандартизированы по сигналам, полученным с помощью связанного положительного контроля Clover-Ruby2. Положительные контроли обозначены черными полосами, отрицательные контроли — светло-серыми, а взаимодействия Kv2.1 / VAP — более темными серыми.Был проведен односторонний дисперсионный анализ, F (5, 481) = 195,7, P = 1,81 × 10 ^-133 с апостериорным тестом Тьюки для проверки значимости. * P <0,000001, значительная разница относительно несвязанного отрицательного контроля. Планки погрешностей представляют SEM. n = 109 связанных, 104 VAPA, 76 VAPA (мутантных), 48 VAPB, 75 Kv2.1 и 58 несвязанных клеток. В каждой ячейке было исследовано 15 областей интереса.

Нокдаун белка VAP влияет на кластерное поведение Kv2.1.

Подтвердить, что VAP напрямую участвуют в Kv2.1, кластеризация над ER, мы использовали подход siRNA для снижения экспрессии эндогенного VAP в клетках HEK. Как проиллюстрировано на фиг. 4 A , в то время как скремблированный контроль миРНК не влиял ни на экспрессию VAPA, ни на экспрессию VAPB, объединение обеих миРНК значительно снижало как VAPA, так и VAPB. Затем мы исследовали влияние нокдауна VAP на кластеризацию Kv2.1, как показано на рис. 4 B и суммировано на рис. 4 C . Как показано на фиг. 4 B , отключение как VAPA, так и VAPB визуально уменьшало степень GFP-Kv2.Кластеризация 1-loopBAD, как показано на изображении со связыванием CF640-SA с биотинилированными каналами на поверхности клетки. Поскольку размер и интенсивность кластера Kv2.1 зависят от уровней экспрессии Kv2.1, мы количественно оценили эффект нокдауна VAP, просто сравнив процент клеток с кластерами, наблюдаемыми при различных обработках siRNA. Чтобы ячейка была классифицирована как бескластерная Kv2.1, она должна иметь однородное поверхностное распределение, показанное двумя ячейками ( ii и iii ) на рис.4 B , Нижний правый . Ячейка и была классифицирована как обладающая кластеризованным Kv2.1. При использовании этого количественного подхода эффекты снижения уровней VAPA или VAPB суммированы на фиг. 4 C (83,4% и 83,1%, NS, по сравнению с контролем скремблированной siRNA). Комбинация обеих миРНК оказала наибольшее влияние на процент кластеризации Kv2.1, уменьшив кластеризацию со 100% до 58,9% ( P <0,00001) по сравнению с контрольным скремблированным миРНК. Таким образом, результаты, представленные на рис.4 указывают на то, что обе изоформы VAP участвуют в кластеризации Kv2.1, то есть в связывании с кортикальным ER в клетках HEK. Хотя это не видно на фиг. 4, siRNA VAP, по сравнению со скремблированным контролем siRNA, снижает общую поверхность Kv2.1 до 41% от контроля и снижает интенсивность кластеров Kv2.1 до 40%. Интенсивность GFP снижена до 55% от контроля. Таким образом, нокдаун VAP подавлял поверхностные уровни Kv2.1 в несколько большей степени, чем общая экспрессия Kv2.1. Связаны ли уровни VAP с Kv2.1 биосинтез, торговля или стабильность остается открытым вопросом.

Эффект siRNA-опосредованного нокдауна VAPA и VAPB на кластеризацию Kv2.1. ( A ) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий эффективность миРНК VAPA и VAPB. Протеиновый блот анализировали антителом против VAPB, которое перекрестно реагирует с VAPA. ( B ) Типичное изображение кластеризации GFP-Kv2.1-loopBAD в присутствии скремблированных миРНК или VAPA и VAPB, полученное с помощью микроскопии с вращающимся диском. Показаны проекции максимальной интенсивности z -стека.На изображении вверху справа все три ячейки ( a – c ) были оценены как имеющие сгруппированный Kv2.1. На изображении нижнего правого только ячейка i была оценена как имеющая кластеры. Обратите внимание, что это изображение представлено просто, чтобы проиллюстрировать определение кластеризации, в отличие от количественной оценки эффекта обработки миРНК. (Шкала: 5 мкм.) ( C ) Количественная оценка процента клеток, демонстрирующих кластеризацию Kv2.1 после различных обработок миРНК.Восемьдесят шесть клеток, получающих скремблированную миРНК, 90 клеток, получающих миРНК VAPA, 61 клетку, получающую миРНК VAPB, и 144 клетки, получающие миРНК VAPA и VAPB, были исследованы в пределах 26, 27, 21 и 41 изображений соответственно. Планки погрешностей представляют SEM. Для анализа был выполнен односторонний дисперсионный анализ, F (3, 111) = 13,61, P = 1,27 × 10 ^-7 , с апостериорными тестами Тьюки. * P <0,01 значимость.

Время резидентности VAP на соединениях ER / PM, индуцированных Kv2.1, давно существует.

Наш предыдущий анализ поведения Kv2.1 на уровне одной молекулы показал, что отдельные каналы Kv2.1 могут находиться в кластере более 25 мин (35), что свидетельствует об очень стабильном взаимодействии между C-концом Kv2.1 и его ER-связывающий партнер. Чтобы изучить стабильность связывания Kv2.1 VAP, мы измерили кинетику диссоциации фотоактивируемого GFP (paGFP) VAPA в кластерах Kv2.1 после фотоактивации. Мы выборочно активировали и количественно измерили флуоресценцию VAP-paGFP только в поле TIRF, чтобы избежать активации флуоресценции, удаленной из PM, как показано на рис.5 А . Активация paGFP и затем измерение его потери из-за диффузии в цитоплазматический ER позволили нам измерить относительную стабильность взаимодействия VAP-Kv2.1 (Fig. 5 B ). Мы обнаружили, что VAPs были явно более стабильными в соединениях Kv2.1, чем в соединениях, индуцированных JPh5, как и ожидалось, если каналы Kv2.1 и VAPs взаимодействуют с образованием этого соединения. Как показано на Рис. 2, хотя VAPs не концентрируются в этих областях, VAPs присутствуют в соединениях мембраны JPh5 исключительно потому, что они существуют по всему ER.Флуоресценция paGFP снижалась до исходного уровня с индуцированными JPh5 соединениями, в то время как в присутствии Kv2.1 стабильно сохранялась приблизительно одна треть исходного VAPA-paGFP, что указывает на стабильное взаимодействие Kv2.1-VAP, продолжающееся более 10 мин. Если VAP действительно функционируют как каркасные белки в контактах ER / PM, эта стабильность делает возможным существование долгоживущих комплексов. Для соответствия данным потребовалось двухэкспоненциальное затухание, показывающее постоянные времени 9,1 с и 80,5 с для мембранных переходов JPh5 по сравнению с 13.9 с и 186,3 с для контактов ER / PM, индуцированных Kv2.1. Эти постоянные времени, вероятно, являются результатом диффузии VAP в более глубокий ER, который удаляется из PM. Увеличение постоянной времени, наблюдаемое в присутствии Kv2.1, может быть связано с увеличением молекулярного скопления в присутствии Kv2.1 по сравнению с JPh5.

Photoactivatable-GFP (paGFP) стабильности VAPA на Kv2.1-индуцированных соединениях ER / PM. ( A ) Типичные TIRF-микроскопические изображения VAPA-paGFP при любом Kv2.1- или JPh5-индуцированные переходы ER / PM через 1, 120 и 600 с после индуцированной 405 нм фотоактивации в TIRF. (Шкала: 5 мкм.) ( B ) Динамика потери флуоресценции paGFP. Нормализованные измерения флуоресценции соответствовали двухэкспоненциальному затуханию, черные линии (y = y0 + A1e- (x-x0) / t1 + A2e- (x-x0) / t2). VAPA был значительно менее стабильным на соединениях ER / PM, индуцированных JPh5 (τ1 = 9,1, τ2 = 80,5), чем на соединениях Kv2.1 (τ1 = 13,9, τ2 = 186,3), P = 0,0395 при 600 с. Планки погрешностей представляют SEM.Использовали двадцать пять областей интереса от 5 клеток, экспрессирующих Kv2.1, и 20 областей интереса от 20 клеток, экспрессирующих JPh5.

Связывание с VAP опосредуется концами Kv2.1 и Kv2.2 C.

VAP связывают слабо выраженный мотив FFAT (два фенилаланина в кислотном тракте), содержащийся в их партнерах по связыванию. Кластеризация Kv2.1 требует ранее определенного мотива внутри С-конца канала, как показано на фиг. 6 A (29), с подчеркнутыми серинами, вероятно, представляющими фосфорилированные аминокислоты, участвующие в Kv2.1 кластеризация над ER (13, 29). Однако очевидные VAP-связывающие мотивы FFAT, которые имеют консенсусную последовательность EFFDAxE (20), отсутствуют как на C-концах Kv2.1, так и на -2.2 (по сравнению с фиг. 6 A ). В качестве первого шага к идентификации последовательностей в каналах Kv2, которые участвуют в связывании VAP, мы добавили аминокислоты 445–609 из Kv2.1 и аминокислоты 552–911 из Kv2.2 к однопроходному трансмембранному белку CD4, как показано на рис. 6 В . Эти аминокислоты были выбраны для сохранения общей длины аминокислот от PM до областей, которые, как известно, необходимы для кластеризации, как можно ближе к WT Kv2.1 насколько это возможно, так как есть основания полагать, что расстояние между ER – PM мембраной может иметь глубокий эффект на локализацию белков в соединениях ER / PM (36). CD4 был выбран потому, что CD4 дикого типа демонстрирует гомогенное распределение на клеточной поверхности как в трансфицированных нейронах гиппокампа крысы, так и в клетках HEK. Таким образом, легко обнаруживается любое скопление или концентрация в кортикальном ER. Поскольку структурные исследования показывают, что CD4 образует димер (37), мы предполагаем, что каждая из этих химерных конструкций содержит два С-концевых домена Kv.Затем химеры CD4 / Kv2 коэкспрессировали с VAPA-GFP в клетках HEK, а CD4 локализовали с использованием конъюгированного с CF640 моноклонального антитела против CD4, направленного против внеклеточного эпитопа. Как показано на фиг. 6 C , химера С-конца CD4 / Kv2.1 сгруппировалась на поверхности клетки и сконцентрировала VAPA, аналогично полноразмерному Kv2.1 на фиг. 2 B . Такая же кластеризация и перераспределение VAPA наблюдались с C-концевой химерой CD4 / Kv2.2 (фиг. 6 D ). Таким образом, неканонический VAP-связывающий мотив, вероятно, присутствует в этих С-концевых последовательностях.

Kv2-канала C-конца достаточно для формирования соединений ER / PM посредством взаимодействия VAP. ( A ) Сравнение последовательностей C-концов Kv2.1 и Kv2.2. Обратите внимание на высокую степень сохранности в области, необходимой для кластеризации, но ее отсутствие в других местах. Известная последовательность, необходимая для кластеризации в Kv2.1, обозначена пурпурной линией. Известные аминокислоты, необходимые для кластеризации, выделены голубым цветом. ( B ) Схема WT CD4 справа и конструкции CD4-Kv2.1: 445–609 слева.Критические аминокислоты для кластеризации Kv2.1 выделены черным. ( C ) Присоединение аминокислот 445–609 Kv2.1 к C-концу CD4 приводит к соединениям ER / PM, которые концентрируют VAPA на PM. ( D ) С-конец Kv2.2, присоединенный к CD4, также дает конструкцию, которая объединяется в кластеры и взаимодействует с VAP. ( E ) Экспрессия VAPA-GFP с помощью конструкции CD4-Kv2.1: 445-609, в которой серины, подчеркнутые в A , были мутированы в аланины. ( F ) Экспрессия VAPA-GFP с CD4-Kv2.1: 445–609, в которой серины, подчеркнутые в A , были мутированы в аспарагиновые кислоты. (Масштаб: 5 мкм.)

Поскольку считается, что фосфорилирование регулирует взаимодействие Kv2.1-ER и результирующий фенотип кластеризации каналов, мы затем мутировали подчеркнутые серины, выделенные на рис. 6 A , в любой из аланинов, неспособных к фосфорилированию. (CD4-Kv2.1: AAAA) или аспарагиновые кислоты для создания фосфомиметиков (CD4-Kv2.1: DDDD). CD4-Kv2.1 С-концевые химеры, содержащие эти замены в пределах присоединенных 445-609 аминокислотных остатков Kv2.1 затем коэкспрессировались с VAPA-GFP, и оценивалось перераспределение VAPA. Как показано на фиг. 6, замена аланина E предотвращает как кластеризацию химер, так и перераспределение VAPA, тогда как фиг. 6 F показывает устойчивую кластеризацию и перераспределение VAPA с фосфомиметическими заменами. Эти данные дополнительно подтверждают идею, что взаимодействие Kv2.1-VAP регулируется с помощью фосфорилирования в пределах небольшого участка С-конца канала.

Kv2.1 формирует соединения ER / PM посредством взаимодействия с VAP через неканонический мотив FFAT.

Чтобы идентифицировать точную С-концевую последовательность Kv2.1, участвующую в связывании VAP, мы создали серию химер CD4, содержащих различные количества С-концевой последовательности Kv2.1 (суммировано на фиг. 7 D ). Чтобы обеспечить достаточную глубину цитоплазмы для контакта с кортикальным ER, мы добавили β2-микроглобулин между CD4 и последовательностью канала, чтобы создать жесткий линкер. Гибкие линкеры переменной длины также вставляли между микроглобулином и длинами короткой последовательности Kv2.1, чтобы поддерживать постоянное расстояние между ER и PM.В качестве положительного контроля мы также добавили классическую последовательность FFAT оксистерин-связывающего белка (OSBP) с фланкерами как выше, так и ниже по течению (см. SI Приложение , Дополнительные материалы и методы для дополнительных деталей). OSBP — это белок-переносчик липидов, который является известным взаимодействующим с VAP и имеет хорошо охарактеризованный мотив FFAT (14, 20, 38). Мы начали с подтверждения того, что аминокислотная последовательность, которая, как уже известно, отвечает за кластерное поведение каналов Kv2.1 [аминокислоты 573–598 (29)], также отвечает за связывание VAP.Как показано на фиг. 7 A , химера CD4-Kv2.1 с С-концом, содержащая только аминокислоты 579-592 из Kv2.1, как кластерные, так и концентрированные VAPA на стыке ER / PM. Напротив, химеры с аминокислотами 586-598 не смогли ни кластеризовать, ни перераспределять VAP, как показано на фиг. 7 B . Фиг. 7 C показывает связывание VAP, наблюдаемое с положительным контролем на мотив CD4-OSBP FFAT. Последовательность и поведение этих и других конструкций суммированы на фиг. 7 D .Для сравнения включена С-концевая последовательность Kv2.2, использованная на фиг. 6 D . Сравнения, показанные на фиг. 7 D , предполагают, что существует неканонический мотив FFAT, присутствующий как на Kv2.1, так и на -2.2 C-концах. 7 аминокислотных остатков желтого цвета представляют собой основной мотив, в котором отсутствует второй ожидаемый фенилаланин. Расположенные выше аминокислоты синим цветом, вероятно, заменяют расположенный выше кислотный тракт, очевидный в последовательности OSBP. В Kv2.1 фосфорилирование серина, вероятно, обеспечивает отрицательный заряд, необходимый для управления взаимодействием Kv2-VAP, подобно другим изученным FFAT-содержащим белкам, которые, как известно, взаимодействуют с VAPs (20).Это необходимое фосфорилирование объясняет индуцированную кальциневрином декластеризацию Kv2.1, которая происходит в ответ на эксайтотоксичность или нейрональное повреждение (3, 39, 40). Обратите внимание, что 579-592 строят кластеры только тогда, когда VAP котрансфицируются, указывая тем самым, что отсутствие нижестоящей последовательности снижает сродство VAP. Мы не можем сказать, увеличивают ли эти специфические аминокислоты сродство связывания или какая-либо случайная последовательность после мотива FFAT может служить этой цели; насколько нам известно, никогда не было описано ни одного мотива FFAT, локализованного на самом конце любого белка, как в случае с этой химерой CD4.

Определение минимального домена, необходимого для взаимодействия Kv2.1 – VAP. ( A ) CD4-Kv2.1: 579–592, образуя соединения ER / PM в клетках HEK посредством взаимодействия VAP. Эта конструкция представляет минимальную последовательность аминокислот, которую мы наблюдали, способную к такому поведению (однако, см. Звездочку в D ). ( B ) CD4-Kv2.1: 586–598 не способен образовывать соединения ER / PM посредством взаимодействия VAP. ( C ) Конструкция CD4-OSBP, демонстрирующая, что образование ER / PM и концентрация VAP происходят в присутствии классического белка, содержащего мотив FFAT, на PM.(Масштаб: 5 мкм.) ( D ) Схема, показывающая идентичность аминокислот и относительное положение фрагментов последовательности Kv2.1, присоединенных к основной цепи CD4. Правая сторона указывает, какие химеры образуют кластеры на мембране с сопутствующей релокализацией VAP в эти места. * CD4-Kv2.1: 579–592 был способен образовывать соединения ER / PM, если VAP коэкспрессировался, но не формировал эти микродомены только с эндогенными уровнями VAP.

Интересно, что 3 из 4 уже признаны критическими для кластеризации Kv2.1 (S586, F587, S589) находятся непосредственно в мотиве FFAT (13, 29). Четвертый критический остаток (S583) расположен всего на 3 аминокислотных остатка выше и внутри фланкерной области мотива FFAT, которая, как известно, важна для связывания VAP (20). Серин 586 является известным сайтом фосфорилирования (41).

Kv2.1 и Kv2.2 взаимодействуют и регулируют локализацию VAPA и VAPB в нейронах гиппокампа крыс.

Чтобы подтвердить, что взаимодействия Kv2 VAP также происходят в нейронах гиппокампа, Kv2.1-loopBAD коэкспрессировался с VAPA-GFP в нейронах гиппокампа крысы DIV 7, как показано на рис.8 А . Опять же, VAPA концентрируется на Kv2.1-индуцированных соединениях ER / PM. На рис. 8 B показан аналогичный результат при совместной экспрессии GFP-Kv2.2 и VAPB-mRuby2. Каналы Kv2 также образуют соединения ER / PM внутри AIS (42, 43), и Рис. 8 C и D иллюстрирует концентрацию VAP здесь в присутствии Kv2.1 и Kv2.2, соответственно. Рис. 8 E иллюстрирует взаимодействие химеры CD4-Kv2.1: 573–589 с VAPA внутри AIS. Недавние работы показывают, что Kv2.1, вероятно, содержит два независимых сигнала локализации AIS в пределах C-конца; один содержится в последовательности, показанной на рис. 6 A , а другой расположен дистально на аминокислотах 720–745 (44). У химеры CD4 отсутствует этот вторичный сигнал локализации AIS, что демонстрирует, что связывание VAP само по себе может локализовать Kv2.1 в AIS. Количественное определение взаимодействия Kv2-VAP показано на рис. 8 F . Здесь указан процент трансфицированных нейронов, концентрирующих либо VAPA, либо VAPB в Kv2-индуцированных соединениях ER / PM.Химеры CD4, которые не смогли взаимодействовать с VAP в клетках HEK (рис. 7), также не смогли связать VAP в нейронах. Эти данные показывают, что взаимодействие Kv2-VAP сходно между клетками HEK и нейронами гиппокампа крысы, что неудивительно, учитывая, что клетки HEK имеют нейрональное происхождение (45) и кальциневрин-зависимая регуляция кластеризации Kv2.1 сохраняется между этими двумя клетками. типы (46).

Kv2 с VAP в нейронах гиппокампа крысы. ( A ) Совместное выражение Kv2.1-loopBAD и VAPA-GFP. Поверхность Kv2.1-loopBAD визуализировали с помощью стрептавидина, конъюгированного с CF640. ( B ) Коэкспрессия GFP-Kv2.2 и VAPB-mRuby2. ( C — E ) Совместная локализация Kv2.1-loopBAD, GFP-Kv2.2 и химеры CD4-Kv2.1: 573–589 с VAPA-GFP, VAPB-mRuby2 и VAPA-GFP соответственно , в АИС. AIS был подтвержден окрашиванием антител против нейрофасцина, как показано в приложении SI , рис. S2. (Шкала: 5 мкм.) ( F ) Сводная информация о проценте нейронов, концентрирующих VAP на индуцированных соединениях ER / PM.Планки погрешностей указывают на SEM. Значения P при сравнении взаимодействия первых трех химер CD4-Kv2.1 с VAPA или VAPB с WT Kv2.1 не были значимыми, со значениями ANOVA Краскела – Уоллиса P = 0,37 и P = 0,1, соответственно.

Discussion

Наши данные демонстрируют, что взаимодействие Kv2 канал-VAP связывает PM с кортикальным ER, как суммировано на Рис. 9. Формирование этого сайта контакта с мембраной дает начало кластерам каналов Kv2 на поверхности нейронов.VAPA и VAPB обильно экспрессируются в гиппокампе, кортикальном слое и двигательных нейронах на основе методов вестерн-блоттинга и иммуноокрашивания, и эти типы нейронов обнаруживают заметные кластеры Kv2.1 на соматической поверхности (47). Однако ранее не сообщалось о концентрации VAP в кластерах, связанных с плазматической мембраной, возможно, потому что доступные антитела нацелены на домены VAP, связанные со связыванием мотива FFAT, тем самым предотвращая иммунное мечение VAP в собранном комплексе. Хотя ранее мы предполагали, что отдельные каналы Kv2 в этих микродоменах должны быть загнаны за цитоскелетным забором из-за их высокой латеральной подвижности внутри PM (35), и подвижность, и кластеризация теперь лучше всего объясняются связыванием со свободно диффундирующими VAP внутри ER. .Эксперименты с FRET, представленные на рис. 3, показывают, что Kv2.1 и VAP находятся в пределах 1–10 нм друг от друга (48), что позволяет предположить, что они находятся в прямом контакте. Кинетика потери флуоресценции после фотоактивации VAP-paGFP (рис. 5) предполагает, что это взаимодействие является относительно долгоживущим (> 10 мин), что согласуется с нашими предыдущими исследованиями, показывающими, что отдельные каналы Kv2.1 могут оставаться в кластере в течение 25 минут или более. в условиях покоя (35). Эксперименты по нокдауну siRNA VAP (рис. 4) подтверждают идею, что VAPs необходимы для Kv2.1 и указывают, что в этом процессе участвуют как VAPA, так и VAPB. Однако поверхностная экспрессия Kv2.1 снижалась на 60% после нокдауна как VAPA, так и VAPB. Означает ли этот результат, что VAPs специфически участвуют в биосинтезе, трафике или стабильности Kv2.1, остается открытым вопросом. Однако каналы Kv2.1 доставляются на клеточную поверхность в Kv2.1-индуцированных соединениях ER / PM (9), что делает вероятным, что нарушение этого сайта контакта с мембраной будет влиять на доставку Kv2.1. Обратите внимание, что когда Kv2.1 сначала синтезируется в трансфицированной клетке HEK, он доставляется на поверхность клетки через небольшие и динамические контакты ER / PM, которые существуют в отсутствие Kv2.1 (49). По мере того как Kv2.1 накапливается на поверхности, он начинает связывать ER VAP и формировать большие и стабильные мембранные соединения.

Рабочая модель, в которой каналы Kv2 концентрируют ER VAP как путем прямого связывания через C-концевой неканонический мотив FFAT, так и за счет олигомеризации VAP через трансмембранный домен VAP.

ВАП связывают мотивы FFAT через положительно заряженную поверхность, расположенную в их основном подобном белку сперматозоиду домену (20).Ядро мотива FFAT представляет собой последовательность из 7 аминокислотных остатков, которые, как правило, вытянуты вверх по кислотному тракту. Связывание мотива VAP-FFAT инициируется неспецифическими отрицательно заряженными аминокислотами выше основного мотива, как показано на фиг. 7 классическим мотивом FFAT нашей конструкции CD4-OSBP (FFAT). Хотя первоначально определенная последовательность для доменов FFAT — EFFDAxE, этот мотив может допускать высокую степень вариабельности. Например, два фенилаланина не присутствуют во всех VAP-связывающих последовательностях; например, протрудин имеет мотив, подобный FFAT, с лизином в положении 3 (по сравнению с изолейцином в Kv2.1) (20). VAP-связывающие домены Kv2.1 и -2.2, идентифицированные в нашей настоящей работе, SFISCAT и SFTSCAT, соответственно, снова демонстрируют, что два фениаланина не являются необходимыми для связывания и что фосфорилированные серины, вероятно, могут замещать кислотные остатки. Важно отметить, что последовательности Kv2 соответствуют минимальным требованиям для FFAT-подобных мотивов: F / Y в положении 2, отрицательный остаток в положении 4, небольшой остаток в положении 5 и отрицательный фланг. Тем не менее, критерии, предложенные для поиска мотивов FFAT, поместят последовательности Kv2 ниже установленного порога (20).Особенность, которая сделала эти мотивы обнаруживаемыми, — это предыдущее точное отображение на конце C Kv2.1 (29).

Кластеризация Kv2.1 и в меньшей степени Kv2.2 регулируется фосфорилированием (1, 3, 50) и фосфорилированием серинового остатка 586 в начале неканонического мотива FFAT, что подтверждается масс-спектрометрией и фосфорилированием. специфическое связывание антител (41, 50), вероятно, генерирует отрицательный заряд, необходимый для облегчения связывания VAP. Уже известно, что фосфорилирование остатков, окружающих мотивы FFAT, для облегчения связывания происходит в других взаимодействующих VAP (20).В настоящее время неизвестно, фосфорилируется ли серин 583 в вышестоящем линкере, необходимый для кластеризации Kv2.1 (29), или серин 589, критический остаток мотива FFAT. Известно, что нейрональные инсульты, такие как ишемия и активность нейронов, приводят к кальциневрин-зависимому дефосфорилированию канала, рассредоточению кластеров каналов и ретракции кортикального ER (3, 13, 39, 40). Как кальциневрин получает доступ к фосфорилированным серинам, участвующим в связывании VAP, неясно. Возможно, индивидуальные взаимодействия мотивов FFAT и VAP достаточно динамичны, чтобы обеспечить доступ кальциневрина в течение 2-минутного периода, необходимого для значительной индуцированной глутаматом декластеризации и ретракции ER (13).Важно отметить, что каналы Kv2 являются тетрамерными. Это текущее исследование не исследовало стехиометрию, участвующую во взаимодействии Kv2-VAP, но вполне вероятно, что один тетрамер Kv2 может связывать до четырех VAP. Отдельные VAP, связывающие и быстро связывающие различные α-субъединицы как в пределах одного канала, так и между каналами, могут объяснять временный доступ кальциневрина к FFAT и все же согласовываться с общей долгосрочной стабильностью белков в этих доменах. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования для выяснения точных механизмов, лежащих в основе зависимого от фосфорилирования взаимодействия VAP.

Данные, представленные на рис. 2 и 3 предполагают, что мутант VAPA (K87D / M89D), который не способен связывать мотивы FFAT, все еще локализуется в соединениях ER / PM, индуцированных каналом Kv2, хотя и в меньшей степени по сравнению с WT VAPA. Поскольку VAP могут образовывать гомомерные и гетеромерные олигомеры, возможно, через трансмембранный мотив GxxxG (34), мутантный GFP-меченный VAPA может собираться в олигомеры с эндогенными WT VAP, которые связаны с каналами Kv2 в местах соединения. Такой механизм позволил бы локализовать VAP в этих микродоменах, которые обладают FFAT-связывающими мотивами, доступными для взаимодействия с дополнительными партнерами, кроме каналов Kv2 (см.рис.9 для изображения). VAP имеют растущий список взаимодействующих, включая AKAP, протеинкиназы, регуляторы киназ, факторы транскрипции, Rab и белки-переносчики липидов (19, 20, 38), и любая концентрация этих белков в сайтах контакта ER / PM должна быть физиологически значимой. Принимая во внимание, что взаимодействие Kv2-VAP, вероятно, непосредственно регулируется фосфорилированием внутри и рядом с С-концевым мотивом FFAT Kv2, возможно, что вовлеченные киназы и фосфатазы связаны с VAP. Однако, насколько нам известно, известный Kv2.1-модифицирующие киназы (CDK5, p38 MAPK, src) (51⇓ – 53) и фосфатазы (кальциневрин) (3, 40) не подтверждены как часть взаимодействия VAP (19). Однако белки, содержащие мотив FFAT, участвуют в невезикулярном переносе церамидов, холестерина и фосфотидилинозитолов между ER и поздними секреторными органеллами, включая TGN и PM. Каналы Kv2 могут устанавливать соединение ER / PM, в котором концентрированные VAP функционируют как каркасный узел, делая эти участки контакта с мембраной не только функционально отличными от контактов ER / PM, таких как те, которые индуцируются STIM1 или расширенными синаптотагминами (14), но и регулируются. по активности нейронов и чувствительны к оскорблениям.Кроме того, возможно обратное, когда VAP-опосредованная концентрация каналов Kv2 придает определенные функции соединению ER / PM за счет доменов, содержащихся в самом канале. Kv2.1 содержит синтаксин-связывающую область (10, 54), ионную пору и домен, чувствительный к напряжению, который даже в непроводящем канале реагирует на мембранный потенциал (8). В дополнение к локализованному связыванию белка SNARE или проводимости K ⁺ , возможно, Kv2.1 передает электрическую активность нейронов функциям, возникающим в контактах ER / PM.

Контактные сайты ER / PM составляют ~ 12% соматической поверхности in vivo, но не все соединения создаются одинаковыми (17). Соединения могут быть образованы протяженными синаптотагминами, белками STIM, юнктофилинами и другими белками (14) в дополнение к каналам Kv2, и очевидный вопрос связан с динамическим составом этих мембранных контактов в любое конкретное время. Вероятно, что могут присутствовать белки, образующие множественные соединения, и что эти компоненты будут по-разному рекрутировать специфические интеракторы, как предложено здесь для рекрутирования Kv2 VAPs.Kv2.1 и Kv2.2 по-разному экспрессируются в типах клеток по всему мозгу и демонстрируют разные функциональные свойства, включая реакцию на стимулы, такие как острая гипоксия, при этом Kv2.2 менее отзывчив с точки зрения как кластеризации, так и измененной зависимости от напряжения (1) . Кажется вероятным, что эти различия в расположении и стабильности соединений, а также в функциональности значительны по отношению к разным типам клеток. Кроме того, Kv2.1 демонстрирует различное поведение в зависимости от субклеточного компартмента, в котором он расположен.Каналы Kv2.1 на AIS более устойчивы к индуцированной глутаматом декластеризации по сравнению с каналами на соме (44, 55). Хотя наши данные указывают на то, что связывание на основе VAP происходит в обоих компартментах, существует домен ниже мотива FFAT (аминокислоты 720–745), который является достаточным для AIS-специфической локализации (44). Возможно, во время эволюции добавление второго мотива нацеливания на ER гарантирует, что активность нейронов не изменяет контакты Kv2.1-ER внутри AIS.

Как и во многих ионных каналах, мутации в Kv2.1, что изменение проводимости связано с заболеванием человека, а мутации, которые изменяют селективность ионов и чувствительность к напряжению, связаны с эпилепсией и задержкой развития (56, 57). Однако три недавно описанные мутации Kv2.1 приводят к преждевременным стоп-кодонам, которые, как предполагается, не изменяют проводимость Kv2.1 (58). Эти мутации происходят ниже доменов консервативных каналов, попадая между последним трансмембранным доменом и неканоническим мотивом FFAT, идентифицированным в настоящей работе. Одна из этих мутаций урезает Kv2.1 на остатке аргинина непосредственно перед фланкерной областью мотива FFAT (R571). Все три мутации приводят к задержке развития, и ожидается, что все три устранят соединения ER / PM, образованные с помощью Kv2.1. Таким образом, мутации, которые специфически мешают связыванию Kv2.1-VAP, вероятно, вовлечены в заболевание человека.

Материалы и методы

Конструкции ДНК.

Плазмиды, кодирующие флуоресцентный белок и акцепторный домен биотина, меченный Kv2.1, были описаны ранее (25, 35, 59).Вкратце, флуоресцентные белки прикреплены к N-концу канала, а акцепторный домен биотина (BAD) вставлен во внеклеточную петлю между первым и вторым трансмембранными доменами. Котрансфекцию биотинлигазой BirA в векторе pSec проводили, как описано ранее, для биотинилирования определенного лизина в последовательности BAD (35, 60, 61). Kv2.1 содержит два остатка метионина, разделенных пятью остатками, в начале кодирующей последовательности, каждый из которых был выбран в качестве исходной аминокислоты в различных публикациях.Таким образом, в литературе по Kv2.1 / KCNB1 в настоящее время используются две отдельные системы нумерации. Для согласованности между этой статьей и ранее опубликованной работой, касающейся последовательности Kv2, критической для кластеризации (29, 41), мы решили сохранить исходную нумерацию аминокислот, которая устанавливает второй метионин как аминокислоту 1. Синтетический полноразмерный Kv2. 2 была получена от Genewiz и вставлена ​​в вектор экспрессии peGFP-C1 (Clontech). AMIGO в pDONR221 был получен из репозитория плазмид DNASU (плазмида ID HsCD00296150), и из этого AMIGO-YFP был создан с использованием сайтов разрезания ApaI и XhoI и помещения фрагмента AMIGO в вектор peYFP-N1.Дополнительные подробности относительно конструкции плазмиды представлены в SI Приложение , Дополнительные материалы и методы .

Культура клеток, трансфекция и маркировка поверхностных химер Kv2.1 и CD4.

Клетки HEK 293 [Американская коллекция типовых культур (АТСС), пассажи 45–48] культивировали, трансфицировали указанными конструкциями ДНК посредством электропорации и высевали на покрытые матригелем чашки для покровного стекла с 35-мм стеклянным дном, покрытые матригелем (Matsunami Glass Corporation), как описано ранее (13).Котрансфекцию BirA использовали для индукции биотинилирования BAD, содержащего конструкции Kv2.1, например GFP-Kv2.1-loopBAD. Визуализацию проводили через 24 часа после трансфекции. Чтобы пометить поверхность Kv2.1-loopBAD, клетки инкубировали с разведением 1: 1000 CF640-конъюгированного стрептавидина (CF640-SA) (Biotium) в течение 10 минут в физиологическом солевом растворе HEK [146 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl ₂ , 0,6 мМ MgSO ₄ , 1,6 мМ NaHCO ₃ , 0,15 мМ NaH ₂ PO ₄ , 0.1 мМ аскорбиновая кислота, 8 мМ глюкоза и 20 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (Hepes), pH 7,4]. Несвязанный CF640-SA удаляли с помощью солевых растворов для визуализации. Химеры CD4 на клеточной поверхности специфически детектировались путем инкубации трансфицированных клеток с разведением 1: 1000 конъюгированных с CF640 анти-CD4-антител, нацеленных на внеклеточный эпитоп, в течение 10 мин.

Нейроны гиппокампа были изолированы от эмбриональных (E18) животных, подвергнутых глубокой анестезии с использованием изофлурана, в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Университета штата Колорадо (идентификатор протокола: 15-6130A).Были собраны эмбрионы обоих полов, и, таким образом, культуры нейронов содержат смешанную популяцию мужских и женских клеток. Нейроны диссоциировали и культивировали, как описано ранее (13, 60, 61). На DIV7 чашки нейронов гиппокампа крыс промывали физиологическим раствором для нейрональной визуализации (NIS) (126 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 2,5 CaCl ₂ , 0,6 мМ MgSO ₄ , 0,15 мМ NaH ₂ PO ₄ , 0,1 мМ аскорбиновой кислоты, 8 мМ глюкозы и 20 мМ Hepes, pH 7,4) с последующей инкубацией либо с CF640-конъюгированным стрептавидином, либо с антителом против CD4, как описано выше.При необходимости использовали моноклональные антитела против нейрофасцина для идентификации начального сегмента аксона. Здесь антитело против NF186 (Neuromab) использовали в разведении 1: 1000 в течение 10 минут с последующими двумя промываниями NIS и 10-минутной инкубацией с флуоресцентными (Alexa 594 или 647) вторичными антителами козы против мыши, разведенными 1: 1000. . Посуду трижды ополаскивали и сразу снимали.

Бесконтактное биотинилирование на основе APEX.

Беспорядочное биотинилирование компонентов соединения ER / PM осуществляли путем трансфекции клеток HEK с помощью AMIGO-YFP-APEX, в действительности APEX2 (62), с другими плазмидами или без них, как указано.Через 24 часа после трансфекции клетки инкубировали с 500 мкМ биотинфенола в DMEM + 10% FBS в течение 30 минут, обрабатывали 1 мМ H ₂ O ₂ в течение 1 минуты и затем фиксировали в 4% формальдегиде в течение 15 минут перед маркировка 2 нг / мл стрептавидина, конъюгированного с CF640 (CF640-SA), и последующая визуализация. Для вестерн-блот-анализа незакрепленные клетки соскребали с планшетов в PBS, содержащем полный мини-ингибитор протеазы (Roche), и центрифугировали, и осадок клеток ресуспендировали в SDS-геле, буфере для образцов Laemmli (Biorad), содержащем β-меркаптоэтанол.После обработки ультразвуком и кипячения в течение 10 мин неочищенные образцы фракционировали стандартным электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле на 10% геле. После переноса на нитроцеллюлозные мембраны белки исследовали либо мышиным анти-Kv2.1 (Neuromab) в разведении 1: 1000, либо мышиным антителом против AMIGO (Neuromab) в разведении 1: 1000. Связывание антител детектировали с помощью козьих антимышиных антител LiCor IRDye800CW. Биотинилированные белки детектировали с помощью стрептавидина LiCor IRDye 680RD в соотношении 1: 10 000.Визуализацию проводили с использованием двухцветной системы Odyssey CLx LiCor. Таким образом, любые биотинилированные резидентные белки ER были визуально отделены от любых потенциальных продуктов распада белка Kv2.1 или AMIGO.

Микроскопия.

Лазерное сканирование и микроскопия с вращающимся диском использовались в дополнение к визуализации TIRF. Если в подписях к рисункам не указано иное, использовалась система с вращающимся диском. Дополнительные сведения о микроскопии представлены в Приложении SI , дополнительных материалах и методах и наших ранее опубликованных исследованиях (13, 60, 61).

FRET.

FRET с сенсибилизированной эмиссией, визуализированный в живых клетках, использовали пары Clover-Ruby2, проанализированные, как описано в ссылке. 63. Клетки HEK 293 трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (2 мкл; Invitrogen) и 100 мкл OptiMEM (Life Technologies) на чашку, используя следующие ДНК: 1 мкг Clover-Kv2.1, 1 мкг Ruby2-Kv2.1, 200 нг. pcDNA3.1-Clover-Ruby2 (тандем), 200 нг mClover-C1, 200 нг mRuby2-C1, 600 нг Ruby2-VAPA, 600 нг Ruby2-VAPAmut и 600 нг Ruby2-VAPB. Изображения FRET были получены на конфокальном микроскопе с вращающимся диском Olympus / Andor.Для каждой ячейки было собрано четыре изображения: ( i ) возбуждение с 488 нм в паре с полосовым фильтром 500/25 (изображение донора), ( II ) возбуждение с 488 нм в паре с полосовым фильтром 600/50 (FRET изображение), ( iii ) возбуждение 561 нм в паре с полосовым фильтром 600/50 (Acceptor image) и ( iv ) DIC-изображение. Используя ImageJ, 15 представляющих интерес областей размером 3 на 3 пикселя (ROI) были помещены в кластеры Kv2.1 (или случайным образом в случае тандемных и растворимых условий), и была измерена интенсивность флуоресценции каждого канала.Клетки, экспрессирующие только конструкции донора (Clover) или акцептора (Ruby2), были визуализированы для расчета коэффициентов просачивания для расчетов эффективности FRET. Коэффициенты просачивания ( BT _Clover или BT _Ruby2 ) рассчитывались как средняя интенсивность канала FRET ( I _FRET ), деленная на среднюю интенсивность донора или акцептора ( I _Clover или I _Ruby2 ).Для наших экспериментальных условий BT _Clover = 11% и BT _Ruby2 = 4,3%. Хотя есть много вариантов для расчета FRET, мы решили использовать N _FRET из-за его поправки на уровни экспрессии донора и акцептора и его полезности при изучении межмолекулярных взаимодействий белков (64). Для расчета FRET ( N _FRET ) использовалась следующая зависимость, как описано ранее (63): NFRET = (IFRET-BTClover × IClover-BTRuby2 × IRuby2) √ (IClover × IRuby2).

изображений эффективности FRET были созданы с помощью калькулятора изображений в ImageJ и применения математических преобразований к FRET и изображениям донора и акцептора, как описано в уравнении выше. После выполнения всех преобразований к каждому изображению применялась королевская таблица поиска (LUT) в ImageJ.

Клетки HEK 293, помещенные либо в чашки для культивирования тканей диаметром 100 мм, либо в чашки для покровного стекла диаметром 35 мм, трансфицировали 250 нМ миРНК (Dharmacon), используя реагент для трансфекции DharmaFECT в соответствии с инструкциями производителя.Через 24 часа клетки на 35-миллиметровых чашках для покровного стекла снова трансфицировали siRNA и плазмидами GFP-Kv2.1-loopBAD и BirA, 1 мкг и 0,5 мкг соответственно. Клетки на 100-миллиметровых чашках не получали плазмидную ДНК, кодирующую Kv2.1, во время второго раунда трансфекции миРНК. Еще через 24 часа клетки на 35-миллиметровых чашках для покровного стекла были визуализированы для оценки кластеризации Kv2.1, в то время как клетки на 100-миллиметровых чашках собирали, как описано выше для вестерн-блот-анализа экспрессии VAP.Инкубация с мышиными антителами против VAPA и -VAPB (разведения 1: 1000 и 1: 2000, MAB5820 и MAB58551, соответственно; R&D Systems) с последующим введением конъюгированных с HRP козьих антимышиных антител и обнаружение с помощью SuperSignal West Dura (продукт 34075; Thermo Scientific) были использованы для оценки экспрессии VAP в присутствии различных миРНК.

Обработка и анализ изображений.

Обработка изображений выполнялась с помощью ImageJ. Изображения были псевдоцветными, обрезаны и скорректированы по контрастности и яркости.Анализ изображений был выполнен с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ или Volocity. Подробности, относящиеся к каждому эксперименту, представлены в Результатах или в подписях к рисункам. Если не указано иное, представлены одиночные конфокальные плоскости.

Экспериментальный план и статистический анализ.

Большинство наших экспериментов проводилось на клетках HEK 293 в отличие от культивируемых нейронов гиппокампа, поскольку эти клетки хорошо подходят для демонстрации межбелковых взаимодействий, которые происходят только в определенных компартментах живых клеток.Кроме того, в клетках HEK 293 отсутствуют субъединицы ионных каналов, которые могли бы собираться с экспрессируемыми конструкциями, и они менее гетерогены, чем культуры нейронов. Наша основная забота в отношении дизайна экспериментов была сосредоточена на вопросах сверхэкспрессии, поскольку экспрессия высокого уровня может вызывать взаимодействия белков, которые в противном случае не существовали бы. Уровни Kv2.1, экспрессируемые как в трансфицированных клетках HEK 293, так и в нейронах, аналогичны уровню эндогенного Kv2.1, как описано ранее (7, 9, 59), где иммуноокрашивание трансфицированных клеток сравнивали с окрашиванием эндогенного канала в культивируемые нейроны гиппокампа.Уровни экспрессии CD4-химеры были аналогичны уровням экспрессии эндогенных каналов. Мы не использовали более высокие уровни экспрессии, чтобы избежать потенциальных артефактов, и наша цель состояла в том, чтобы экспрессировать ровно столько флуоресцентных меченых белков VAP, чтобы действовать как индикатор для эндогенных белков, тем более, что любое перераспределение VAP теряется при сверхэкспрессии. Кроме того, сверхэкспрессия VAP изменяет морфологию ER, как описано ранее (33), чего мы не наблюдали с нашими уровнями экспрессии трансфицированных VAP. Обратите внимание, что высокие уровни экспрессии не были необходимы, учитывая чувствительность наших микроскопов TIRF и вращающегося диска, которые оба способны отображать отдельные молекулы.

Для статистического анализа был проведен односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) со специальными тестами Тьюки с использованием программного обеспечения Origin 2018b. Для данных, представленных на рис. 8, был проведен дисперсионный анализ Крускала – Уоллиса. Количество исследованных областей интереса и ячеек и значения P указаны в Результатах .

Благодарности

Мы благодарим Эмили Иден (Университетский колледж Лондона) и Диего Крапфа (Университет штата Колорадо) за полезные обсуждения и Энн Хесс (Статистическая лаборатория Graybill, Университет штата Колорадо) за помощь в проведении статистического анализа.Эта работа была поддержана грантом R01GM109888 Национального института здравоохранения (M.M.T.).

Сноски

• Вклад авторов: B.J., A.N.L., L.S., E.E.M., T.P.L. и M.M.T. спланированное исследование; B.J., A.N.L., L..S., E.E.M. и M.M.T. проведенное исследование; T.P.L. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; B.J., A.N.L., L..S., E.E.M. и M.M.T. проанализированные данные; и B.J., A.N.L., L.S., E.E.M., T.P.L. и M.M.T. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• См. Комментарий на стр. 7849.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1805757115/-/DCSupplemental.

Арарат Василий Информация и факты

Описание / вкус

Сезоны / Наличие

Текущие факты

Пищевая ценность

Приложения

Этническая / культурная информация

География / История

Атаракс Пероральный: использование, побочные эффекты, взаимодействия, изображения, предупреждения и дозировка

Перед приемом гидроксизина сообщите своему врачу или фармацевту, если у вас на него аллергия; или цетиризину; или левоцетиризину; или если у вас есть другие аллергии.Этот продукт может содержать неактивные ингредиенты, которые могут вызвать аллергические реакции или другие проблемы. Поговорите с вашим фармацевт для получения более подробной информации.

Перед использованием этого лекарства расскажите своему врачу или фармацевту о своей истории болезни, особенно о: проблемах с дыханием (таких как эмфизема, астма), высоком давлении в глазах (глаукома), высоком кровяном давлении, проблемах с почками, проблемах с печенью, судорогах, Проблемы с желудком / кишечником (например, язва, закупорка), гиперактивность щитовидной железы (гипертиреоз), затрудненное мочеиспускание (например, из-за увеличения простаты).

Hydroxyzine может вызвать состояние, которое влияет на сердечный ритм (удлинение интервала QT). Удлинение интервала QT редко может вызывать серьезные (редко со смертельным исходом) учащенное / нерегулярное сердцебиение и другие симптомы (например, сильное головокружение, обмороки), которые требуют немедленной медицинской помощи.

Риск удлинения интервала QT может увеличиваться, если у вас есть определенные заболевания или вы принимаете другие препараты, которые могут вызвать удлинение интервала QT. Перед тем, как принимать гидроксизин, сообщите своему врачу или фармацевту обо всех принимаемых вами лекарствах, и если у вас есть какие-либо из следующих состояний: определенные проблемы с сердцем (сердечная недостаточность, медленное сердцебиение, удлинение интервала QT на ЭКГ), семейный анамнез некоторых проблем с сердцем (QT пролонгирование ЭКГ, внезапная сердечная смерть).

Низкий уровень калия или магния в крови также может увеличить риск удлинения интервала QT. Этот риск может увеличиваться, если вы принимаете определенные лекарства (например, диуретики / «водные таблетки») или если у вас есть такие состояния, как сильное потоотделение, диарея или рвота. Поговорите со своим врачом о безопасном приеме гидроксизина.

Этот препарат может вызвать у вас головокружение, сонливость или помутнение зрения. Алкоголь или марихуана (каннабис) могут вызвать у вас головокружение или сонливость. Не садитесь за руль, не пользуйтесь механизмами и не делайте ничего, что требует бдительности или ясного зрения, пока вы не научитесь делать это безопасно.Избегайте алкогольных напитков. Поговорите со своим врачом, если вы употребляете марихуану (каннабис).

Перед операцией расскажите своему врачу или стоматологу обо всех продуктах, которые вы используете (включая рецептурные лекарства, лекарства, отпускаемые без рецепта, и растительные продукты).

Жидкие продукты могут содержать сахар и / или спирт. Рекомендуется соблюдать осторожность, если у вас диабет, заболевание печени или любое другое состояние, которое требует от вас ограничения / отказа от этих веществ в своем рационе. Спросите своего врача или фармацевта о безопасном использовании этого продукта.

Дети могут быть более чувствительны к побочным эффектам этого препарата. Этот препарат часто может вызывать у маленьких детей возбуждение, а не сонливость.

Пожилые люди могут быть более чувствительны к побочным эффектам этого препарата, особенно к сонливости, спутанности сознания, запорам, проблемам с мочеиспусканием или удлинению интервала QT (см. Выше). Сонливость и спутанность сознания могут увеличить риск падения.

Во время беременности этот препарат следует использовать только в случае крайней необходимости. Обсудите риски и преимущества с вашим врачом.

Неизвестно, проникает ли этот препарат в грудное молоко. Перед кормлением грудью проконсультируйтесь с врачом.

Как важно получать больше кальция в ваших растениях | Рекламодатель Арарата

образ жизни, садоводство, Джон Габриэле, основные элементы растений, здоровье растений, кальций

Хорошее здоровье — это хорошее питание, а растениям необходимы 16 основных элементов для роста. Когда все основные элементы доступны, рост будет сильным, продуктивным и здоровым.Как только одного элемента не хватает, растения отклоняются от нормального роста и становятся более восприимчивыми к вредителям и болезням. Помимо трех основных элементов азота, фосфора и калия, растениям также требуется легкодоступный источник кальция. Кальций известен как строительный материал для растений; он обеспечивает структуру клеточных стенок, а также используется растениями для передачи сигналов в ответ на стресс, где он преобразует стимулы окружающей среды в клеточные ответы растений. Довольно впечатляющий материал, который подчеркивает его важность как важного элемента.Больше образа жизни: Итак, если кальций так важен, почему бы просто не добавить в почву немного извести? К сожалению, не все так просто. Наиболее распространенные формы кальция, доступные садоводам, — это сельскохозяйственная или садовая известь и доломит. Проблема с этими продуктами заключается в том, что, хотя они добавляют кальций как элемент в почву, он не находится в легкодоступной форме для растений, а также повышает pH почвы. Вы спросите, что это? Проще говоря, pH просто относится к кислотности или щелочности почвы, которая является показателем того, кислая или сладкая почва.Шкала pH варьируется от 0 до 14, семь из которых являются нейтральными, ниже этого значения кислотные, а выше — щелочные, а доступность питательных веществ в почве в значительной степени определяется pH почвы. Так как же нам увеличить доступность кальция для растений, не повышая pH? Ответ на этот вопрос — применение кальция в хелатной форме. Один из лучших способов добиться этого — использовать продукт, содержащий нитрат кальция в растворимой форме, легко доступной для усвоения растениями, например Seasol Gold. Прелесть этого продукта в том, что он содержит только поддерживаемые уровни питательных веществ, поэтому регулярное внесение не окажет непосредственного влияния на pH почвы, но будет иметь положительное влияние на продуктивность растений.Преимущества, которые можно ожидать от использования этого состава раствора морских водорослей, включают улучшенный рост корней, защиту от стресса и повышение продуктивности растений, цветов и фруктов, поэтому, когда дело доходит до получения максимальной производительности от ваших растений, выбирайте золото.

/images/transform/v1/crop/frm/jess.wallace/c07d0c6b-fc94-4d30-bc1c-5e506fe08aa4.jpg/r3_307_5998_3694_w1200_h678_fmax.jpg

63

, а также три элемента фосфор из растений, азот, азот 3 и азот из трех растений. требуется легкодоступный источник кальция.Изображение: Shutterstock

Хорошее здоровье — это хорошее питание, а для роста растений необходимы 16 основных элементов.

Когда все основные элементы доступны, рост будет сильным, продуктивным и здоровым. Как только одного элемента не хватает, растения отклоняются от нормального роста и становятся более восприимчивыми к вредителям и болезням.

Помимо трех основных элементов азота, фосфора и калия, растениям также необходим легкодоступный источник кальция.

Кальций известен как строительный блок растений; он обеспечивает структуру клеточных стенок, а также используется растениями для передачи сигналов в ответ на стресс, где он преобразует стимулы окружающей среды в клеточные ответы растений. Довольно впечатляющий материал, который подчеркивает его важность как важного элемента.

Итак, если кальций так важен, почему бы просто не добавить в почву немного извести? К сожалению, не все так просто.

Самыми распространенными формами кальция, доступными для садоводов, являются сельскохозяйственная или садовая известь и доломит.

Проблема с этими продуктами заключается в том, что, хотя они добавляют кальций как элемент в почву, он не находится в легкодоступной форме для растений и также повышает pH почвы.

Что это, спросите вы? Проще говоря, pH просто относится к кислотности или щелочности почвы, которая является показателем того, кислая или сладкая почва.

Шкала pH колеблется от 0 до 14, семь из которых являются нейтральными и ниже этого уровня кислотными, а выше — щелочными, а доступность питательных веществ в почве в значительной степени определяется pH почвы.

Итак, как мы можем увеличить доступность кальция для растений, не повышая pH? Ответ на этот вопрос — применение кальция в хелатной форме.

Один из лучших способов добиться этого — использовать продукт, содержащий нитрат кальция в растворимой форме, легко доступной для усвоения растениями, например Seasol Gold.

Прелесть этого продукта в том, что он содержит только поддерживаемые уровни питательных веществ, поэтому регулярное внесение не окажет непосредственного влияния на pH почвы, но окажет положительное влияние на продуктивность растений.

Преимущества, которые можно ожидать от использования этого состава раствора морских водорослей, включают улучшенный рост корней, защиту от стресса и повышение продуктивности растений, цветов и фруктов, поэтому, когда дело доходит до получения максимальной производительности от ваших растений, выбирайте золото.

• Джон Габриэле — учитель садоводства, любит зеленые насаждения.
  

Что ждет артезианский бассейн в Араратской долине, озере Севан и реках в результате изменения климата и антропогенного воздействия

Каковы тенденции уменьшения и изменения качества ресурсов подземных вод в Араратской долине, какова потребность сообществ в воде, сколько воды они получают из-за потерь воды, каковы угрозы озеру Севан, реки можно очистить от горных сточных вод?

Лиана Маргарян, эксперт по качеству воды 4-го национального сообщения ПРООН по изменению климата, выступила с докладом по этим и другим вопросам на круглом столе на тему «Водная безопасность в Армении в рамках сценария климатического прогноза», состоявшемся 30 марта в пресс-клубе ЭкоЛур.

Лиана Маргарян отметила тенденцию к сокращению ресурсов подземных вод Араратской долины. По его словам, превышен средний допустимый объем водозабора — 1094,1 тыс. Кубометров, соответственно, составив 1753,4 тыс. Кубометров в 2013 году и 1608,50 тыс. Кубометров в 2016 году. Параллельно изменилось качество воды.

«С понижением уровня грунтовых вод повысился уровень минерализации воды.Такая картина наблюдалась в результате исследований питьевой воды в 16 селах Масисского района и 9 селах Армавирского района. Исследования показали, что подземные воды в Араратской долине характеризуются высокой минерализацией с преобладанием кальция, магния и углеводородов. Максимальное содержание минерализации в колодезной воде наблюдалось в поселке Мясникян, где минерализация составляла около 2000 мг / л, а жесткость — 20 мг-экв / л.

По сравнению с 1981 годом минерализация воды увеличилась на 1.2-1,8 раза в 2017 году. Наибольшая площадь наблюдалась в районе Масиса, где концентрации калия, натрия и хлоридов в воде увеличились в 1,7-2,3 раза. Это связано с понижением водного горизонта артезианского бассейна. Большое использование воды привело к изменению качественного состава », — сказал спикер.

По ее словам, одним из изменений качества питьевой воды является повышение уровня жесткости. Общая жесткость воды в колодцах Масисского района превышала норматив качества питьевой воды (7 мг-экв / л) на 1.В 5-1,8 раза, в Армавирской области — в 1,3-2,5 раза. Из-за отсутствия других источников питьевой воды Минздрав увеличил норму для Араратской долины с 7 мг-экв / л до 15 мг-экв / л. Общая жесткость колодезной воды общины Мясникян Армавирской области в 2,9 раза превышает армянский стандарт качества питьевой воды. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций, норма минерализации поливной воды составляет 2000 мг / л.

«Вроде можно использовать для полива, но в случае выше 1000 мг / л необходимо применять специальный режим полива, иначе почва будет засолена», — сказал спикер.По словам Лианы Маргарян, если уровень воды снизится или артезианский бассейн не будет постоянно восстанавливаться, качество воды будет продолжать ухудшаться, что в конечном итоге приведет к непригодности питьевой воды не только в Мясникянской общине, но и в ряде других общин.

Изменение климата меняет качество поверхностных вод и количество воды, используемой для питья. Оценка этих изменений дана на примерах рек из общин Геги, Мегри и Мармарик.

Изучены характеристики изменения количества и количества водоподачи из рек Геги, Мегри, Мармарик. По ее словам, ежегодно из реки Геги забирается около 19,3 миллиона кубометров воды, чтобы обеспечить 80% водоснабжения из реки Геги в город Капан Сюникской области, но потери воды в системе составляют 75-78%.

«Фактически, средний объем водоснабжения составляет всего 4,5 миллиона кубометров. Водоснабжением пользуются около 40 283 жителей.Количество воды на душу населения в день составляет 54,4 литра, что примерно в 3,7 раза меньше необходимого по норме, установленной в Республике Армения (200-250 литров в день). Согласно прогнозам глобального потепления, естественный сток у истока реки Гехи в 2040, 2070 и 2100 годах уменьшится на 5-8%, 10-15% и 18-25% соответственно. Поэтому в условиях этих потерь воды риск водоснабжения Капана очень высок, необходимо принять меры адаптации », — сказал Маргарян.

Аналогичные изменения наблюдаются и с водоснабжением в Мегри. «Около 3,5 миллионов кубометров воды ежегодно перекачивается из реки Мегри для питья и хозяйственных нужд 90% населения Мегри, но из-за потерь воды 73-82%, только около 0,79 миллиона кубометров воды подается на 4700 человек. жителей. Количество воды на душу населения составляет 460 литров в сутки, что примерно в 2,3 раза больше необходимого. По прогнозам, в условиях глобального потепления уменьшение естественного стока в истоке реки Мегри в 2040, 2070 и 2100 годах будет составляют 8-9%, 16% и 26-27% соответственно.

Даже при наихудшем сценарии, если количество воды уменьшится на 26-27% в 2100 году, доли воды будет достаточно для удовлетворения питьевых и хозяйственных нужд. Однако это не означает, что мы можем использовать его с большой интенсивностью и иметь такие большие потери воды.

Ежегодно из реки Мармарик забирается около 3,6 млн. Кубометров воды для питьевого и хозяйственно-бытового назначения в рекреационных зонах сел Анкаван, Агавнадзор, Меградзор (в Анкаване и Цахкадзоре), но потери воды составляют 80%, всего около 0.В Цахкадзор поставляется 72 миллиона кубометров, из которых 0,19 миллиона кубометров доходит до города: 6306 жителей получают воду. Количество воды на душу населения составляет 313 л / сутки, что примерно в 1,5 раза больше нормы, установленной в Республике Армения (200-250 л / сутки). Для естественного стока в источнике Мармарик прогнозируется снижение на 2-4% в 2040 году и на 4-5% и 6-12% в 2070 и 2100 годах соответственно », — сказала она.

Лиана Маргарян отметила, что качество воды этих поверхностных источников в 2007-2018 годах также изучалось и сравнивалось с качеством воды в 1980-1990 годах.Речная экосистема меняет свои свойства, а свойство самоочищения снижается. В результате органическое загрязнение водоемов начинает увеличиваться. «Уровень кальция во всех источниках воды увеличивается на 4-12,5%, что может вызвать серьезные проблемы, от изменения вкуса воды до проблем со здоровьем», — сказала она.

Проблемы озера Севан

По данным ГНКО «ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИЯ И МОНИТОРИНГ» Министерства окружающей среды РА, в 2010-2018 годах содержание фосфора в озере Севан продолжает расти, качество воды ухудшается.«Около 270 тонн фосфора и около 1396 тонн азота ежегодно попадают в озеро Севан через бытовые сточные воды, что создает благоприятные условия для роста водорослей. С другой стороны, добавляется эффект повышения температуры воздуха. Между ними существует прямая взаимосвязь. биомасса фитопланктона и температура воздуха в озере. С повышением температуры наблюдается рост фитопланктона. Уровень воды повышается, но качественных изменений в озере и улучшения экосистемы мы не наблюдаем.Следует иметь в виду, что чем выше уровень, тем больше становится водная поверхность озера, тем быстрее вода в озере может нагреваться, а повышение температуры воздуха способствует этому процессу. С одной стороны, мы больше нагреваем воду, разливаем, увеличиваем площадь, с другой — повышаем содержание азота и фосфора в озере. Таким образом, создаются идеальные условия для роста водорослей.

Инга Зарафян, президент ИНО «ЭкоЛур» поинтересовалась, возможно ли восстановить водные ресурсы.В ответ Лиана Маргарян привела в пример озеро Севан. «Интенсивность цветения — это естественный процесс, который показывает защитную реакцию экосистемы. Озеро цветет, водоросли поглощают азот и фосфор, выносят его из озера. Это реакция самообороны, делается попытка восстановить систему. Я не хочу сказать, что мы не можем вернуться в прежнее состояние. Но опыт показывает, что когда воздействие на экосистему уменьшится, она может восстановиться. Если мы сможем провести целевые меры на озере Севан, мы сможем восстановить его.

Воздействие горнодобывающей промышленности и изменения климата на водные ресурсы

«Из-за воздействия горнодобывающей промышленности водные ресурсы загрязнены большим количеством тяжелых металлов. В рамках 4-го Национального отчета об изменении климата для обсерватории Вохчи-Капан было предсказано, как в этом случае изменится качество воды. непрерывного загрязнения, принимая медь и цинк в качестве индикаторов добычи, нитраты и аммоний в качестве бытовых сточных вод.Оценка проводилась по двум сценариям.

Если при наихудшем сценарии не будет предпринято никаких действий и загрязнение продолжится, загрязнение нитратами и аммонием продолжит увеличиваться, превышая 1,7-2 раза, как в случае с медью и цинком. Однако в случае принятия природоохранных мер мы увидим снижение аммиака в 40 раз, меди в два раза, цинка в реке Вохчи за пять лет до 10 раз », — сказала Лиана Маргарян.

«Если предотвратить попадание загрязняющих веществ в водную экосистему, система восстановится, а вода будет очищена благодаря способности водной экосистемы к самовосстановлению.В случае тяжелых металлов это явление представляет собой довольно длительный процесс, но они могут превращаться в модифицированные, безвредные, ассимилированные формы для водного биоразнообразия из-за биохимических процессов, оставаясь на дне речной воды ».

19 апреля 2021, 10:03