строение, свойства, функции — урок. Биология, Общие биологические закономерности (9–11 класс).
Среди органических веществ клетки самыми разнообразными по свойствам и выполняемым функциям являются белки, или протеины. В белках, в отличии от углеводов и липидов, кроме углерода, кислорода и водорода содержится азот, а также могут присутствовать атомы серы, фосфора и железа.
Белки — это биополимеры, мономерами в которых служат аминокислоты. В образовании всего разнообразия белков участвует \(20\) α-аминокислот. Молекулы аминокислот имеют две функциональные группы: карбоксильную (кислотную) и аминогруппу (основную).
Рис. \(1\). Молекула аминокислоты
Аминогруппа и карбоксильная группа способны взаимодействовать между собой с отщеплением воды и образованием пептидной связи CO−NH. Пептидными связями молекулы аминокислот соединяются друг с другом в длинные цепи.
Число остатков аминокислот в цепи может составлять несколько сотен и даже тысяч. Такие большие молекулы называют
Структура белков
Порядок соединения аминокислот в макромолекуле белка называют первичной структурой. Для каждого типа белка эта структура уникальна. Она определяет структуры высших уровней, свойства белка и его функции.
Полипептидная цепь сворачивается в спираль за счёт образования водородных связей между группировками атомов −NH и −CO, расположенными на разных участках макромолекулы. Эту спираль называют вторичной структурой белка.
Третичная структура белка возникает при взаимодействии радикалов аминокислот, а также за счёт дисульфидных мостиков, водородных и ионных связей. Молекула белка принимает форму
У некоторых белков формируется четвертичная структура. Она представляет собой комплекс нескольких макромолекул, имеющих третичную структуру. Четвертичную структуру удерживают непрочные ионные и водородные связи, а также гидрофобные взаимодействия.
Рис. \(2\). Структуры белка
Белки могут соединяться с углеводами, жирами и нуклеиновыми кислотами с образованием комплексных соединений: гликопротеинов, липопротеинов, нуклеопротеинов.
Под действием внешних факторов: облучения, нагревания, некоторых химических веществ и др. — происходит нарушение пространственной структуры белковых молекул. Этот процесс называется денатурацией.
Сначала происходит разрушение четвертичной структуры, потом третичной и вторичной. Первичная структура при денатурации сохраняется, но белок утрачивает свои свойства и функции.
Денатурация в некоторых случаях обратима. Обратный процесс называется ренатурацией.
Рис. \(3\). Денатурация и ренатурация белка
Разрушение первичной структуры необратимо. Оно происходит при гидролизе белка — макромолекулы распадаются на отдельные аминокислоты. Такой процесс идёт в органах пищеварения животных и в лизосомах клеток под действием гидролитических ферментов.
Функции белков
1. Важнейшей функцией белков является каталитическая, или ферментативная. Белки-ферменты участвуют во всех биохимических реакциях, протекающих в клетке, и повышают скорость этих реакций во много раз. Для каждой реакции существует особый фермент.
2. Белки выполняют структурную (строительную) функцию. Они входят в состав плазматических мембран, образуют соединительные ткани (эластин и коллаген), волосы и ногти (кератин).
Рис. \(4\). Структурные белки в плазматической мембране
3. Сигнальную функцию также осуществляют белки, встроенные в мембрану. Под действием внешних факторов эти белки изменяют третичную структуру, что отражается на функционировании клетки.
4. Транспортная функция белков проявляется в переносе ионов через клеточные мембраны, транспорте гемоглобином крови кислорода и углекислого газа, альбуминами плазмы — жирных кислот и т. д.
5. Двигательную функцию обеспечивают белки актин и миозин, способные сокращаться и растягиваться. Они приводят в движение реснички и жгутики одноклеточных организмов, сокращают мышцы у животных.
Рис. \(5\). Сократительные белки
6. Защитная функция обеспечивается антителами иммунной системы организма, белками системы свёртывании крови (фибриногеном, протомбином и др.).
7. Регуляторную функцию выполняют белки-гормоны (инсулин, тиреотропин, соматотропин, глюкагон и др.).
8. Энергетическую функцию белки выполняют после израсходования запасов углеводов и жиров. При полном расщеплении \(1\) г белка до конечных продуктов выделяется \(17,6\) кДж энергии.
Источники:
Рис. 1. Молекула аминокислоты. Автор: X-romix — собственная работа, Общественное достояние, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=10280776. 09.09.2021.
Рис. 2. Структуры белка. https://image.shutterstock.com/image-vector/protein-structure-primary-secondary-tertiary-600w-1474657079
Рис. 3. Денатурация и ренатурация белка. © ЯКласс.
Рис. 4. Структурные белки в плазматической мембран. https://shutterstock.puzzlepix.hu/kep/376416385е
Рис. 5. Сократительные белки. © ЯКласс.
Биологи открыли белок, который защищает ядовитых лягушек от самоотравления — Наука
ТАСС, 5 августа. Молекулярные биологи выяснили, что ядовитых лягушек и птиц от собственных токсинов защищают особые белки, которые поглощают и нейтрализуют яды. Результаты исследований опубликовал Journal of General Physiology.
«Клетки этих лягушек и птиц вырабатывают белки, особенно активно соединяющиеся с молекулами токсинов, которые атакуют ионные каналы в нейронах. Это говорит, что подобные вещества защищают многих ядовитых животных от самоотравления», – рассказал один из авторов исследованяи, научный сотрудник Калифорнийского университета в Сан-Франциско Фаял Абдереман-Али.
Как правило, в яде змей, скорпионов, лягушек и других животных содержится множество белков и сигнальных молекул, которые выполняют две разных функции. Часть из них проникает в рецепторы или ионные каналы на поверхности нервных клеток и мешает им работать. Другие компоненты вызывают массовую гибель клеток, напрямую растворяя их или заставляя самоуничтожиться.
В последние годы ученые активно исследуют, как ядовитые животные защищаются от своих собственных ядов и токсинов других живых существ. Получение ответа на этот вопрос, например, позволит создать препараты, способные нейтрализовать яды сразу нескольких видов животных.
Калифорнийские биологи получили первые сведения такого рода для южноамериканских тропических лягушек-листолазов и новогвинейских дроздовых мухоловок. Представители обоих видов покрывают свои внешние покровы одним из самых опасных нервнопаралитических ядов – батрахотоксином.
Мелкие хищники умирают от одного прикосновения к коже листолазов или перьям мухоловок. Однако сами животные от него не погибают. Ранее генетики предположили, что неуязвимость мухоловок и листолазов к своему яду связана с точечной мутацией в натриевых каналах, которые атакуют молекулы батрахотоксина. На практике эту идею никто раньше не проверял.
Руководствуясь подобными соображениями, ученые выделили эти ионные каналы из клеток птиц и лягушек и проследили, как те будут взаимодействовать с молекулами батрахотоксина и других нервнопаралитических ядов. Неожиданно оказалось, что в белках ионных каналов листолазов и мухоловок не было мутаций, о которых писали генетики, и при этом они не были защищены от действия токсинов.
Когда эти мутации добавляли в ионные каналы, те не стали более стойкими к токсинам, просто стали хуже работать. Столкнувшись с этой загадкой, ученые проверили, могут ли взаимодействовать с батрахотоксином и другими ядами другие вещества из клеток лягушек и птиц.
Оказалось, что клетки некоторых видов лягушек вырабатывают большие количества белка, который биологи назвали саксифилином. Он способен соединяться с молекулами сакситоксина, нервнопаралитического яда, чьи молекулы вырабатываются клетками некоторых видов водорослей и содержатся в больших количествах в рыбе фугу.
Ученые предполагают, что подобные белки защищают листолазов и мухоловок от действия батрахотоксина, поглощая и нейтрализуя его молекулы до того, как они успеют проникнуть в нейроны и заблокировать работу ионных каналов. Их последующее изучение, как надеются Абдереман-Али и его коллеги, позволит создать эффективные противоядия от одного из сильнейших природных ядов.
Биолог из МГУ создал белок, который вылечит анемию, рак и переломы
Эритропоэтин — это белок, который вырабатывается в почках. Основная его функция — стимуляция образования красных кровяных клеток (эритроцитов) в организме человека, поэтому его используют в качестве лекарства и вводят человеку в виде инъекций для восстановления количества эритроцитов при различных формах анемии, связанных с почечной недостаточностью, раком и применением химиотерапии. Сейчас эритропоэтин получают из генетически модифицированных клеток яичников китайского хомячка, в которых он синтезируется в виде смеси с разным содержанием углеводов. На языке учёных это значит, что формы смеси по-разному гликозилированы.
Кроме того, эритропоэтин также обладает другой функцией — восстановлением (репарированием) костных тканей, поэтому учёные планируют использовать этот белок для местного введения в область поражённой костной ткани при переломах. Белок будет находиться в составе импланта из материала-носителя, который удержит эритропоэтин в месте введения.
Учёные получили высокоочищенный эритропоэтин методом синтеза в клетках бактерии кишечной палочки. Белок был рекомбинантным, то есть состоящим из новых комбинаций генов. При таком синтезе в клетках бактерий эритропоэтин получается негликозилированным, поэтому обладает меньшей молекулярной массой по сравнению с гликозилированными формами белка и быстрее выводится из кровотока.
«Основной проблемой при синтезе в бактериях рекомбинантного человеческого эритропоэтина, которую предстояло решить в работе, было получить его в виде белка с правильно сформированными химическими связями. Белок должен обладать биологической активностью и быть пригодным для использования в регенеративной медицине. С помощью синтеза в бактериальных клетках мы получили высокоочищенный негликозилированный рекомбинантный человеческий эритропоэтин, который обладает специфической биологической активностью», — рассказал один из авторов статьи Анна Карягина-Жулина, доктор биологических наук, старший научный сотрудник отдела математических методов в биологии Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ.
В ходе работы учёные использовали методы очистки белка с помощью колоночной хроматографии. Для повышения растворимости белка его синтезировали в составе гибридных конструкций с дополнительными белковыми доменами, которые обеспечивают лучшую растворимость всего белка. Учёные перебрали три варианта дополнительных доменов. Использование одного из них позволило авторам получить растворимую форму белка и очистить его. Для отщепления чистого эритропоэтина гибридный белок исследователи обрабатывали ферментом энтерокиназой. Биологическую активность полученного в бактериях эритропоэтина авторы показали на специальной линии клеток (клетки эритролейкемии), которые начинали усиленно делиться при добавлении эритропоэтина.
Авторы отмечают, что эта работа — часть большого проекта, посвящённого разработке новых имплантируемых материалов с эритропоэтином и человеческим костным морфогенетическим белком-2 (rhBMP-2) для реконструктивной хирургии.
«Предполагается, что введение в область костной травмы рекомбинантного эритропоэтина, полученного в опубликованной работе, позволит добиться ещё большего повышения эффективности разрабатываемых нами имплантируемых материалов. То, что оба рекомбинантных белка: и rhBMP-2, и эритропоэтин — мы получаем бактериальным синтезом, обеспечит существенное удешевление получаемых на их основе материалов по сравнению с зарубежными материалами. Таким образом, перспективой данной работы будет получение новых высокоэффективных имплантируемых материалов для реконструктивной хирургии и доступность имплантируемых материалов нового поколения населению России», — заключила Анна Карягина-Жулина.
Исследование проходило в рамках проекта, поддержанного Российским научным фондом. Работа проходила в сотрудничестве с учеными из Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии, Научного центра психического здоровья РАН, Первого московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова, Института геохимии и аналитической химии имени В.И. Вернадского РАН, Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и из Министерства здравоохранения РФ.
Лаборатория структурной биологии рецепторов, сопряжённых с G белком — МФТИ
Деятельность лаборатории структурной биологии рецепторов, сопряжённых с G белком, сфокусирована на структурно-функциональных исследованиях рецепторов, сопряжённых с G белком (GPCR). Мы применяем мультидисциплинарный структурно-биологический подход, в котором мы соединим компьютерные методы с арсеналом биофизических методов (кристаллография, флюоресценция одиночных молекул, электронная микроскопия, ЯМР, масс-спектрометрия итд) для того, чтобы найти ответ на вопросы, касающиеся механизмов распознавания лиганда и передачи сигнала в GPCR.
Для осуществления этой деятельности лаборатория работает в тесном сотрудничестве с передовыми научными центрами Европы, США и Китая.
Заместитель руководителя: Мишин Алексей Викторович
1. Egor Marin, Aleksandra Luginina, Anastasiia Gusach, Kirill Kovalev, Sergey Bukhdruker, Polina Khorn, Vitaly Polovinkin, Elizaveta Lyapina, Andrey Rogachev, Valentin Gordeliy, Alexey Mishin, Vadim Cherezov & Valentin Borshchevskiy. Small-wedge synchrotron and serial XFEL datasets for Cysteinyl leukotriene GPCRs. Scientific Data, 2020. DOI: 10.1038/s41597-020-00729-22. Bogorodskiy, A. O., Bolkhovitina, E. L., Gensch, T., Troyanova, N. I., Mishin, A. V., Okhrimenko, I. S., Braun, A., Spies, E., Gordeliy, V. I., Sapozhnikov, A. M., Borshchevskiy, V. I. & Shevchenko, M. A. Murine Intraepithelial Dendritic Cells Interact With Phagocytic Cells During Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Front. Immunol, 2020 doi: 10.3389/fimmu.2020.00298
3. Gusach, A., Maslov, I., Luginina, A., Borshchevskiy, V., Mishin, A., Cherezov, V. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology, 2020 doi: 10.1016/j.sbi.2020.03.004
4. Kuklin, A., Zabelskii, D. Gordeliy, I., Teixeira, J., Brûlet, A., Chupin, V., Cherezov, V., Gordeliy, V. On the Origin of the Anomalous Behavior of Lipid Membrane Properties in the Vicinity of the Chain-Melting Phase Transition. Scientific Reports, 2020 https://doi.org/10.1038/s41598-020-62577-9
5. Bukhdruker, S., Varaksa, T., Grabovec, I., Marin, E., Shabunya, P., Kadukova, M., Grudinin, S., Kavaleuski, A., Gusach, A., Gilep, A., Borshchevskiy, V. & Strushkevich, N. Hydroxylation of Antitubercular Drug Candidate, SQ109, by Mycobacterial Cytochrome P450. Int. J. Mol. Sci., 2020 https://doi.org/10.1101/2020.08.27.269936
6. Dmitry S. Karlov, Sergey Sosnin, Maxim V. Fedorov, and Petr Popov. graphDelta: MPNN Scoring Function for the Affinity Prediction of Protein–Ligand Complexes. ACS Omega, 2020 doi: 10.1021/acsomega.9b04162
7. Igor Kozlovskii, Petr Popov. Spatiotemporal identification of druggable binding sites using deep learning. Communications Biology, 2020 doi: 10.1038/s42003-020-01350-0
Публикации 2019
1. Alexey Mishin, Anastasiia Gusach, Aleksandra Luginina, Egor Marin, Valentin Borshchevskiy & Vadim Cherezov (2019) An outlook on using serial femtosecond crystallography in drug discovery, Expert Opinion on Drug Discovery, Expert Opinion on Drug Discovery, 2019 Sep;14(9):933-945.DOI: 10.1080/17460441.2019.16268222. A. Luginina, A. Gusach, E. Marin, A. Mishin, R. Brouillette, P. Popov, A. Shiriaeva, É. Besserer-Offroy, J.-M. Longpré, E. Lyapina, A. Ishchenko, N. Patel, V. Polovinkin, N. Safronova, A. Bogorodskiy, E. Edelweiss, H. Hu, U. Weierstall, W. Liu, A. Batyuk, V. Gordeliy, G. W. Han,P. Sarret, V. Katritch, V. Borshchevskiy, V. Cherezov, Structure-based mechanism of cysteinyl leukotriene receptor inhibition by antiasthmatic drugs. Sci. Adv. 5, eaax2518 (2019). DOI: 10.1126/sciadv.aax2518
3. Anastasiia Gusach, Aleksandra Luginina, Egor Marin, Rebecca L. Brouillette, Élie Besserer-Offroy, Jean-Michel Longpré, Andrii Ishchenko, Petr Popov, Nilkanth Patel, Taku Fujimoto, Toru Maruyama, Benjamin Stauch, Margarita Ergasheva, Daria Romanovskaia, Anastasiia Stepko, Kirill Kovalev, Mikhail Shevtsov, Valentin Gordeliy, Gye Won Han, Vsevolod Katritch, Valentin Borshchevskiy, Philippe Sarret, Alexey Mishin & Vadim Cherezov. Structural basis of ligand selectivity and disease mutations in cysteinyl leukotriene receptors. Nat Commun 10, 5573 (2019) doi:10.1038/s41467-019-13348-2
Адрес: 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, ул.Первомайская, дом 3, МФТИ, Корпус Прикладной Математики, КПМ 114 комната.
ИИ Google готов решить величайшую проблему в биологии за последние 50 лет — представить форму всех известных науке белков
Последовательности аминокислот при соединении друг с другом сворачиваются в сотни миллионов причудливых белковых форм, предсказать которые было невозможно — только изучить в лаборатории. Прогресс наметился с приходом в биологию технологий ИИ, а сейчас готовится прорыв — структура DeepMind компании Google обещает вскоре представить форму всех известных науке белков, что кратно ускорит поиск новых лекарств и приведёт к другим открытиям в биологии.
Источник изображения: DeepMind
Компания DeepMind пока не может уйти от Google, но обещает создать открытую базу по всем предсказанным белковым формам. Произойдёт это в течение нескольких месяцев и обещает стать самым грандиозным в истории биологии событием. Программы по предсказанию формы белка разрабатываются многими компаниями и научными коллективами, но пакет AlphaFold DeepMind показал самую высокую точность прогнозирования формы. Эти инструменты находятся в открытом доступе, а готовая база данных по белкам значительно облегчит работу биологов во всём мире — бери и пользуйся.
Пакет AlphaFold может предсказывать форму белков с точностью до атома. Но даже меньшая точность позволяет разрабатывать новые лекарства, предоставляя информацию о приблизительной пространственной конфигурации ранее структурно не изученных белков. Так, если за последние 10 лет биологи смогли изучить строение только 17 % белков человека, то AlphaFold за считанные недели удвоил базу белковых форм человека до 36 %. Эту информацию ещё предстоит проверить, но раньше алгоритм AlphaFold уже доказывал свою способность почти не ошибаться.
Кроме белков человека DeepMind обещает представить белковые формы 20 наиболее изученных организмов от дрожжей до мух дрозофил, мышей и других — до сотен миллионов белковых форм. Сегодня база DeepMind содержит информацию о 350 тыс. предсказанных формах белка, но через несколько месяцев будет расширена до более чем 100 млн форм, где будут почти все более или менее известные науке белки. Изучению пока не поддаются белки, которые принимают пространственную форму при соединении с другими белками, но это будет следующий орешек для ИИ.
Если вы заметили ошибку — выделите ее мышью и нажмите CTRL+ENTER.
Белок TNF помогает противостоять рассеянному склерозу
Ученые из Института молекулярной биологии РАН имени В. А. Энгельгардта, кафедры иммунологии биологического факультета МГУ, Фрайбургского университета, Гарвардской медицинской школы и Института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского определили роль белка TNF при воспалительных заболеваниях нервной системы, в частности, рассеянном склерозе. Исследования были поддержаны грантом Российского научного фонда (РНФ). Итоги работы подведены в статье, опубликованной в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences, кратко о них сообщает пресс-служба РНФ.
Белок TNF (фактор некроза опухоли, tumor necrosis factor) выделяется клетками иммунной системы – лейкоцитами и макрофагами – и служит для активации и регуляции воспалительного ответа. Название его может ввести в заблуждение. Дело в том, что Ллойд Олд, открывший этот белок в 1975 году, обнаружил его способность убивать клетки фибросаркомы у лабораторных мышей. Но деятельность TNF не ограничивается борьбой с опухолями. Он универсальный воспалительный агент, дающий сигнал другим клеткам иммунной системы. Если же активность этого белка повышена, это часто оказывается причиной аутоиммунных заболеваний. Поэтому современные медики подавляют белок TNF для лечения, например, аутоиммунного артрита, псориаза или болезни Крона. Но при лечении рассеянного склероза, который также относится к аутоиммунным заболеваниям, такой подход приводил к ухудшению симптомов болезни. Авторы исследования сумели объяснить, почему это происходит.
«Известно, что анти-TNF терапия помогает при некоторых аутоиммунных заболеваниях, но делает только хуже при рассеянном склерозе. Мы предположили, что это может быть связано с тем, что TNF в этом заболевании «подает» какой-то защитный сигнал, который нельзя блокировать», – говорит ведущий автор работы Сергей Недоспасов, доктор биологических наук и академик РАН, заведующий лабораторией Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, заведующий кафедрой иммунологии биологического факультета МГУ.
Камар-Сулу Атретханы, младший научный сотрудник Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, аспирант кафедры иммунологии биологического факультета МГУ. Фото: Пресс-служба РНФ
Фактор некроза опухоли связывается с двумя типами рецепторов: TNFR1 и TNFR2. «Недавно было обнаружено, что один из рецепторов – TNFR2 – широко представлен на Т-регуляторных клетках, особой популяции Т-клеток, участвующих в подавлении аутоиммунитета. Это дало основание предполагать, что именно TNFR2 на Т-регуляторных клетках может иметь тот самый защитный сигнал», – говорит автор работы Камар-Сулу Атретханы, младший научный сотрудник Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Ученые подтвердили это предположение экспериментально, использовав лабораторных мышей, которым при помощи технологий редактирования генома были переданы человеческие гены TNF и TNFR2. У мышей с неактивным рецептором TNFR2 на Т-регуляторных клетках эти клетки значительно слабее подавляли активность других типов иммунных клеток (Т-хелперов и Т-киллеров). Кроме того, такие мыши имели более выраженные клинические симптомы мышиной модели рассеянного склероза.
Результаты исследования важны не только тем, что они объясняют роль TNF в защите от рассеянного склероза. Рецептор TNFR2 широко представлен на Т-регуляторных клетках, поэтому его предлагают использовать, как потенциальную мишень для иммунотерапии рака. Нынешнее исследование указывает на возможные побочные эффекты такого подхода, заключающиеся в усилении аутоиммунитета и нейровоспаления. А созданная исследователями линия мышей с человеческими генами TNF и TNFR2 будет очень полезна для дальнейших исследований иммунитета.
Биологи нашли 69 соединений, уничтожающий вирусный белок SARS-CoV-2
Вспышка нового коронавируса SARS-CoV-2, возбудителя респираторного заболевания COVID-19, заставила ученых многих стран срочно искать решение проблемы. В настоящее время не существует ни противовирусных препаратов с доказанной эффективностью, ни вакцин для ее профилактики, сообщает журнал Biorxiv.
Шаг к пониманию механизма действия этого вируса сделала международная группа ученых, на молекулярном уровне изучившая, как этот коронавирус захватывает организм человека во время заражения. Они пришли к выводу, что существует большой потенциал для систематического изучения зависимостей хозяина от вируса SARS-CoV-2 и решили устранить пробел в знаниях путем систематического картирования ландшафта взаимодействия между белками SARS-CoV-2 и человеком.
Для этого был использован метод тандемной аффинной очистки с помощью шариков Магстрепа. Пептиды обессоливали и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Исследователи экспрессировали 26 из 29 вирусных белков в клетках человека и идентифицировали человеческие белки, физически связанные с каждым из них.
Всего было выявлено 332 высоконадежных взаимодействия вирусного белка SARS-CoV-2 с человеческими белками. Для каждого из вирусных белков был провели анализ, выявивший основные клеточные биологические процессы их взаимодействия иммунной системой человека. Если нарушить сеть взаимодействия вируса и белка человека, то это и подскажет способ лечения болезни.
«Среди этих связей мы идентифицировали 66 поддающихся медикаментозному лечению человеческих белков. Потенциально эффективными препаратами оказались 69 соединений, которые действуют на найденные мишени. Они находятся на этапах клинических и доклинических исследований», — говорит ведущий исследователь доктор Дэвид Гордон из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Сейчас ученые проводят серию тестов, чтобы оценить эффективность этих соединений.
Идентификация факторов зависимости от хозяина, влияющих на развитие вирусной инфекции, может дать ключ к пониманию механизма действия эффективных молекулярных мишеней для разработки противовирусных препаратов против SARS-CoV-2 и других смертоносных штаммов коронавируса.
Обзор анализа белок-белкового взаимодействия | Thermo Fisher Scientific
Белки контролируют все биологические системы в клетке, и хотя многие белки выполняют свои функции независимо, подавляющее большинство белков взаимодействуют с другими для обеспечения надлежащей биологической активности. Характеристика белок-белковых взаимодействий с помощью таких методов, как коиммунопреципитация (ко-IP), анализ методом «pull-down», перекрестное связывание, перенос метки и дальневестерн-блот-анализ имеет решающее значение для понимания функции белка и биологии клетки.
Посмотреть все продукты для анализа взаимодействия белков
Введение в белок-белковые взаимодействия
Белки — это рабочие лошадки, которые способствуют большинству биологических процессов в клетке, включая экспрессию генов, рост клеток, пролиферацию, поглощение питательных веществ, морфологию, подвижность, межклеточную коммуникацию и апоптоз. Но клетки реагируют на множество стимулов, и поэтому экспрессия белка — это динамический процесс; белки, которые используются для выполнения определенных задач, не всегда могут быть экспрессированы или активированы.Кроме того, не все клетки равны, и многие белки экспрессируются в зависимости от типа клетки. Эти основные характеристики белков предполагают сложность, которую может быть трудно исследовать, особенно при попытке понять функцию белка в надлежащем биологическом контексте.
Критические аспекты, необходимые для понимания функции белка, включают:
- Последовательность и структура белка — используются для обнаружения мотивов, которые предсказывают функцию белка
- История эволюции и консервативные последовательности — определяет ключевые регуляторные остатки
- Экспрессия профиль — выявляет специфичность клеточного типа и то, как регулируется экспрессия
- Посттрансляционные модификации — фосфорилирование, ацилирование, гликозилирование и убиквитинирование предполагают локализацию, активацию и / или функцию
- Взаимодействия с другими белками — функция может быть экстраполирована зная функцию партнеров по связыванию
- Внутриклеточная локализация — может указывать на функцию белка
До конца 1990-х годов анализ функции белков в основном фокусировался на отдельных белках.Однако, поскольку большинство белков взаимодействуют с другими белками для правильного функционирования, их следует изучать в контексте их взаимодействующих партнеров, чтобы полностью понять их функцию. С публикацией генома человека и развитием области протеомики понимание того, как белки взаимодействуют друг с другом и идентификация биологических сетей, стало жизненно важным для понимания того, как белки функционируют в клетке.
Справочник по приготовлению белков
Узнайте больше о том, как обессоливать, заменять буфер, концентрировать и / или удалять загрязняющие вещества из образцов белка, иммунопреципитации и других методах очистки и очистки белков с использованием различных инструментов биологии белка Thermo Scientific в этом 32-страничном справочнике.
- Иммунопреципитация (IP), co-IP и IP-хроматин колонки и планшеты для обессоливания
- Эффективное извлечение определенных загрязняющих веществ с помощью смол, оптимизированных для удаления детергентов или эндотоксинов
- Быстрое концентрирование разбавленных образцов белка с помощью концентраторов белка Pierce
Типы белок-белковых взаимодействий
Белковые взаимодействия в основном характеризуются как стабильные или временные, и оба типа взаимодействия могут быть сильными или слабыми.Стабильные взаимодействия связаны с белками, очищенными как мульти-субъединичные комплексы, и субъединицы этих комплексов могут быть идентичными или разными. Гемоглобин и ядерная РНК-полимераза являются примерами мульти-субъединичных взаимодействий, которые образуют стабильные комплексы.
Ожидается, что временные взаимодействия будут контролировать большинство клеточных процессов. Как следует из названия, временные взаимодействия носят временный характер и обычно требуют набора условий, которые способствуют взаимодействию, таких как фосфорилирование, конформационные изменения или локализация в дискретных областях клетки.Временные взаимодействия могут быть сильными или слабыми, быстрыми или медленными. Находясь в контакте со своими партнерами по связыванию, временно взаимодействующие белки участвуют в широком спектре клеточных процессов, включая модификацию белков, транспорт, фолдинг, передачу сигналов, апоптоз и клеточный цикл. Следующий пример представляет собой иллюстрацию белковых взаимодействий, которые регулируют апоптотические и антиапоптотические процессы.
Тяжелое белок-белковое взаимодействие BAD. Панель A: окрашенный кумасси гель SDS-PAGE рекомбинантного легкого и тяжелого BAD-GST-HA-6xHIS, очищенный из лизатов HeLa IVT (L) с использованием тандемного сродства глутатионовой смолы (E1) и кобальтовой смолы (E2).Указан расход (FT) из каждого столбца. Панель B: Схема фосфорилирования BAD и белковых взаимодействий во время выживания и гибели клеток (то есть апоптоза). Панель C: покрытие последовательности белка BAD, показывающее идентифицированные сайты консенсусного фосфорилирования Akt (красный прямоугольник). Панель D: МС-спектры меченного стабильным изотопом BAD пептида HSSYPAGTEDDEGmGEEPSPFr.
Белки связываются друг с другом посредством комбинации гидрофобных связей, сил Ван-дер-Ваальса и солевых мостиков в специфических доменах связывания каждого белка.Эти домены могут быть небольшими связывающими щелями или большими поверхностями и могут состоять всего из нескольких пептидов или состоять из сотен аминокислот. На силу связывания влияет размер связывающего домена. Одним из примеров общего поверхностного домена, который способствует стабильным межбелковым взаимодействиям, является лейциновая молния, которая состоит из α-спиралей на каждом белке, которые связываются друг с другом параллельным образом посредством гидрофобного связывания регулярно расположенных остатков лейцина на каждом α -спираль, которая выступает между соседними спиральными пептидными цепями.Из-за плотной молекулярной упаковки лейциновые молнии обеспечивают стабильное связывание для мультибелковых комплексов, хотя все лейциновые молнии не связываются одинаково из-за нелейциновых аминокислот в α-спирали, которые могут уменьшить молекулярную упаковку и, следовательно, силу взаимодействие.
Два домена гомологии Src (SH), Sh3 и Sh4, являются примерами общих временных связывающих доменов, которые связывают короткие пептидные последовательности и обычно обнаруживаются в сигнальных белках. Домен Sh3 распознает пептидные последовательности с фосфорилированными остатками тирозина, которые часто указывают на активацию белка.Домены Sh3 играют ключевую роль в передаче сигналов рецептора фактора роста, во время которой лиганд-опосредованное фосфорилирование рецептора по остаткам тирозина привлекает нижестоящие эффекторы, которые распознают эти остатки через их домены Sh3. Домен Sh4 обычно распознает богатые пролином пептидные последовательности и обычно используется киназами, фосфолипазами и GTPases для идентификации белков-мишеней. Хотя оба домена Sh3 и Sh4 обычно связываются с этими мотивами, специфичность для различных белковых взаимодействий диктуется соседними аминокислотными остатками в соответствующем мотиве.
Биологические эффекты белок-белковых взаимодействий
Результат двух или более белков, которые взаимодействуют с определенной функциональной целью, можно продемонстрировать несколькими различными способами. Измеримые эффекты белковых взаимодействий описаны следующим образом:
- Изменение кинетических свойств ферментов, что может быть результатом незначительных изменений в связывании субстрата или аллостерических эффектах
- Обеспечение канализации субстрата путем перемещения субстрата между доменами или субъединицами , что в конечном итоге приводит к намеченному конечному продукту
- Создать новый сайт связывания, обычно для малых эффекторных молекул
- Инактивировать или разрушить белок
- Изменить специфичность белка в отношении его субстрата посредством взаимодействия с различными партнерами связывания, например.g., продемонстрировать новую функцию, которую ни один из белков не может проявлять по отдельности.
- Выполняет регуляторную роль в предшествующем или последующем событии.
Общие методы анализа белок-белковых взаимодействий
Обычно для проверки, характеристики и подтверждения белковых взаимодействий необходимо сочетание методов. Ранее неизвестные белки могут быть обнаружены по их ассоциации с одним или несколькими известными белками. Анализ взаимодействия белков может также выявить уникальные, непредвиденные функциональные роли хорошо известных белков.Обнаружение или проверка взаимодействия — это первый шаг на пути к пониманию того, где, как и при каких условиях эти белки взаимодействуют in vivo и функциональные последствия этих взаимодействий.
Хотя различных методов и подходов к изучению межбелковых взаимодействий слишком много, чтобы описать их здесь, в таблице ниже и оставшейся части этого раздела основное внимание уделяется распространенным методам анализа межбелковых взаимодействий и типам взаимодействий, которые могут быть изучены с использованием каждый метод.Таким образом, стабильные белок-белковые взаимодействия проще всего выделить физическими методами, такими как коиммунопреципитация и анализ методом pull-down, поскольку белковый комплекс не распадается с течением времени. Слабые или временные взаимодействия могут быть идентифицированы с использованием этих методов, сначала ковалентно сшивая белки, чтобы заморозить взаимодействие во время co-IP или pull-down. В качестве альтернативы, перекрестное сшивание, наряду с переносом метки и анализом дальнего вестерн-блоттинга, можно проводить независимо от других методов для выявления межбелковых взаимодействий.
Общие методы анализа различных типов белковых взаимодействий
| Метод | Взаимодействия белок-белок |
| Коиммунопреципитация (co-IP) | Стабильный или сильный |
| сильный | илиPull-down анализ 9011 |
| Анализ взаимодействия сшивающихся белков | Временное или слабое |
| Анализ взаимодействия белков переноса метки | Временное или слабое |
| Дальневосточный блот-анализ | Умеренно стабильный |
Коиммунопреципитация (ко-IP)
Коиммунопреципитация (co-IP) — популярный метод обнаружения взаимодействия белков.Co-IP проводится практически так же, как иммунопреципитация (IP) одного белка, за исключением того, что целевой белок, осажденный антителом, также называемый «приманкой», используется для соосаждения комплекса связывающий партнер / белок. , или «добыча», из лизата. По существу, взаимодействующий белок связывается с антигеном-мишенью, который связывается антителом, иммобилизованным на носителе. Иммунопреципитированные белки и их партнеры по связыванию обычно обнаруживаются электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттингом.Предположение, которое обычно делается при соосаждении связанных белков, состоит в том, что эти белки связаны с функцией антигена-мишени на клеточном уровне. Однако это только предположение, которое подлежит дальнейшей проверке.
Совместная иммунопреципитация циклина B и Cdk1 . Магнитные гранулы Thermo Scientific Pierce Protein A / G связываются с антителом Cdk1 в комплексе с Cdk1. Циклин B связан с Cdk1 и захватывается вместе со своим партнером по связыванию.
Анализы Pull-down по методологии аналогичны коиммунопреципитации из-за использования подложки из шариков для очистки взаимодействующих белков. Однако разница между этими двумя подходами заключается в том, что в то время как co-IP использует антитела для захвата белковых комплексов, в методах «pull-down» используется белок «приманка» для очистки любых белков в лизате, которые связываются с приманкой. Нисходящие анализы идеальны для изучения сильных или стабильных взаимодействий или тех, для которых нет антител для коиммунопреципитации.
Общая схема анализа методом «выпадающего». Нисходящий анализ представляет собой мелкомасштабную методику аффинной очистки, аналогичную иммунопреципитации, за исключением того, что антитело заменяется какой-либо другой системой аффинности. В этом случае аффинная система состоит из глутатион-S-трансферазы (GST), белка или связывающего домена, меченного полигис- или стрептавидином, который захватывается глутатионом, хелатом металла (кобальт или никель) или покрытыми биотином агарозными шариками. , соответственно.Иммобилизованный белок, меченный слиянием, действует как «приманка» для захвата предполагаемого партнера по связыванию (т.е. «жертвы»). В типичном нисходящем анализе иммобилизованный белок-приманка инкубируется с клеточным лизатом, и после предписанных стадий промывки комплексы выборочно элюируются с использованием конкурирующих аналитов или буферов с низким pH или восстанавливающих буферов для анализа в геле или вестерн-блоттинга.
Анализ взаимодействия сшивающего белка
Большинство белок-белковых взаимодействий являются временными, лишь кратковременно происходящими как часть единственного каскада или другой метаболической функции внутри клетки.Сшивание взаимодействующих белков — это подход к стабилизации или постоянному соединению компонентов комплексов взаимодействия. Как только компоненты взаимодействия ковалентно сшиты, другие стадии (например, лизис клеток, аффинная очистка, электрофорез или масс-спектрометрия) могут быть использованы для анализа взаимодействия белок-белок при сохранении исходного взаимодействующего комплекса.
Гомобифункциональные аминореактивные сшивающие агенты могут быть добавлены к клеткам для сшивания потенциально взаимодействующих белков вместе, которые затем могут быть проанализированы после лизиса с помощью вестерн-блоттинга.Сшивающие агенты могут быть мембранопроницаемыми, такими как DSS, для сшивания внутриклеточных белков, или они могут быть непроницаемыми для мембраны, такими как BS3, для сшивания белков клеточной поверхности. Кроме того, некоторые сшивающие агенты могут быть расщеплены восстанавливающими агентами, такими как DSP или DTSSP, для обращения сшивок.
В качестве альтернативы, гетеробифункциональные сшивающие агенты, которые содержат фотоактивируемую группу, такие как продукт SDA или Sulfo-SDA, могут быть использованы для захвата переходных взаимодействий, которые могут происходить, например, после определенного стимула.Фотоактивация также может происходить после метаболического мечения фотоактивируемыми аминокислотами, такими как L-фото-лейцин или L-фото-метионин.
Сайты сшивания между белками могут быть картированы с высокой точностью с помощью масс-спектрометрии, особенно если используется расщепляемый МС сшивающий агент, такой как DSSO или DSBU.
Анализ взаимодействия белков переноса меток
Перенос метки включает сшивание взаимодействующих молекул (например, белков наживки и жертвы) с меченым сшивающим агентом, а затем расщепление связи между наживкой и добычей, так что метка остается прикрепленной к жертве.Этот метод особенно ценен из-за его способности идентифицировать белки, которые слабо или временно взаимодействуют с интересующим белком. Новые неизотопные реагенты и методы продолжают делать этот метод более доступным и простым в использовании для любого исследователя.
Экспериментальная стратегия переноса биотиновой метки Sulfo-SBED и анализа методом вестерн-блоттинга.
Дальневосточный блот-анализ
Подобно тому, как анализы «pull-down» отличаются от ко-IP в обнаружении белок-белковых взаимодействий с использованием меченых белков вместо антител, так и анализ дальнего вестерн-блоттинга отличается от анализа вестерн-блоттингом , поскольку выявляются белок-белковые взаимодействия. путем инкубации белков, подвергнутых электрофорезу, с очищенным, меченым белком-приманкой вместо антитела, специфичного к целевому белку, соответственно.Термин «далеко» был принят, чтобы подчеркнуть это различие.
Схема дальнего вестерн-блоттинга для анализа межбелковых взаимодействий. В этом примере меченый белок-приманка используется для зондирования переносящей мембраны или геля на предмет белка жертвы. После связывания антитело, конъюгированное с ферментом (пероксидаза хрена; HRP), которое нацелено на бирку-приманку, используется для обозначения взаимодействия, которое затем обнаруживается ферментативной хемилюминесценцией. Этот общий подход может быть скорректирован с помощью немаркированного белка приманки, который обнаруживается антителом, биотинилированного белка приманки, который обнаруживается конъюгированным с ферментом стрептавидина, или меченного радиоактивным изотопом белка приманки, который обнаруживается при воздействии на пленку.
- Golemis E (2002) Взаимодействие белков и белков: руководство по молекулярному клонированию. Колд-Спринг-Харбор (Нью-Йорк): Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор. p ix, 682.
- Phizicky EM, Fields S (1995) Белковые взаимодействия: методы обнаружения и анализа. Microbiol Rev 59: 94–123.
Границы | Изучение потенциала внеклеточного синтеза белка для расширения возможностей биологических систем
Введение
Синтетическая биология возникла и продолжает развиваться как развивающаяся научная область, сочетающая инженерные принципы с биологическими науками.Он определяется как «проектирование и конструирование синтетических биологических частей, устройств и систем, которые не существуют в природе, а также включает переработку природных систем для биотехнологических применений» (Endy, 2005; Khalil and Collins, 2010; Qi and Аркин, 2014; Сингх, 2014а). В последнее десятилетие был разработан и охарактеризован ряд синтетических промоторов, сайтов связывания рибосом, синтетических генов, каркасов и факторов транскрипции для широкого круга организмов и типов клеток (Lutz and Bujard, 1997; Alper et al., 2005; Пфлегер и др., 2006; Победа и Смолке, 2008; Salis et al., 2009). Аналогичным образом синтетические осцилляторы (Elowitz and Leibier, 2000; Stricker et al., 2008; Danino et al., 2010), тумблеры (Gardner et al., 2000; Atkinson et al., 2003), биологические ворота (Tamsir et al. ., 2011; Moon et al., 2012; Shis, Bennett, 2013; Singh, 2014b), риборегуляторы (Isaacs et al., 2004; Na et al., 2013) и рибопереключатели (Tucker, Breaker, 2005; Blount and Breaker, 2006; Patel et al., 2018) также были разработаны и охарактеризованы во многих организмах.
Синтетические системы используются в широком спектре биотехнологических приложений, включая обнаружение раковых клеток (Culler et al., 2010; Nissim and Bar-Ziv, 2010), тумблеры для управления метаболическим потоком (Soma et al., 2014 ), осцилляторы для периодической экспрессии генов (Sowa et al., 2014), контроллеры Т-клеток (Chen et al., 2010), искусственное оплодотворение (Kemmer et al., 2011) и многие другие. Синтетические хромосомы (Gibson et al., 2009, 2010; Kosuri et al., 2010; Kim et al., 2012; Hutchison et al., 2016) и мультиплексной автоматизированной инженерии генома (Wang et al., 2009, 2012; Isaacs et al., 2011; Lajoie et al., 2013; Rovner et al., 2015) также были разработаны с использованием наборы инструментов синтетической биологии.
Возможности синтетической биологической инженерии генома были значительными для широкого круга организмов, которые в настоящее время включают бактерии, вирусы, дрожжи, Drosophila , рыбок данио и клетки млекопитающих (Cong et al., 2013; DiCarlo et al., 2013; Hwang et al., 2013; Цзян и др., 2013; Мали и др., 2013; Порт и др., 2014; Ren et al., 2014; Hisano et al., 2015; Якочюнас и др., 2015; Чжу и др., 2015; Singh et al., 2017, 2018). С ростом глобальной осведомленности о проблемах здоровья, энергетики и окружающей среды приоритетное внимание исследованию и применению синтетической биологии стало неизбежным, учитывая потенциальные возможности, которые могут предложить эти новые науки. Последние достижения в области инструментов синтетической биологии расширили их использование в фундаментальных науках, биомедицинских науках, биотехнологиях и в промышленности.Это расширение и развитие стали особенно полезными для ускорения изобретений и инноваций в области синтетической биологии.
Пугающая сложность и барьер, создаваемый клеточной мембраной, вызывают многочисленные трудности, такие как сложность стандартизации эксперимента, проблемы несовместимости и вариабельность. Для решения этих проблем системы бесклеточного синтеза белка (CFPS), также известные как in vitro, синтез белка , стали ключевым инструментом, который может работать без использования живых клеток.Эти системы позволяют напрямую управлять транскрипцией, трансляцией и метаболизмом в режиме открытого исходного кода (Carlson et al., 2012; Lu, 2017; Moore et al., 2017; Jiang et al., 2018; Yue et al., 2019). ). CFPS представляет собой исторически важный компонент в области биохимии, должным образом признавая новаторские усилия, предпринятые нобелевским лауреатом Эдуардом Бюхнером (Нобелевская премия по химии 1907 г.) для открытия ферментации в экстрактах дрожжевых клеток (YCE) (Buchner, 1897). С тех пор он был перепрофилирован для понимания биологических процессов, в первую очередь способствуя открытию генетического кода благодаря использованию экстракта клеток Escherichia coli Ниренбергом и его коллегами (Nirenberg and Matthaei, 1961; Matthaei et al., 1962), что в конечном итоге привело их к получению и разделению Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1968 году вместе с Хар Гобинд Хораной и Робертом Холли.
С развитием синтетической биологии (Gibson et al., 2010) бесклеточные системы заняли научную нишу, помогая развивать понимание генных сетей и биосинтетических путей (Hodgman and Jewett, 2012; Koch et al., 2018). ). CFPS требует основного аппарата РНК-полимеразы, аппарата трансляции (рибосомы, тРНК-синтазы и факторы трансляции), энергогенерирующих молекул и их кофакторов, субстратов и ДНК или плазмидных матриц для получения желаемых продуктов.CFPS использовался для многочисленных экспериментов, включая производство белков, которые необходимо объединять с токсичными аминокислотами, такими как канаванин (Worst et al., 2015), включения ортогональных генетических кодов (Chemla et al., 2015; Des Soye et al. al., 2015), производство терапевтических средств (Zawada et al., 2011), тестирование сложных генных сетей (Shin and Noireaux, 2012; Takahashi et al., 2015a, b), сборка бактериофагов (Shin et al., 2012 ) и многое другое. В настоящем обзоре мы освещаем недавний прогресс и использование CFPS в биомедицинских, терапевтических, промышленных и биотехнологических приложениях.
Подготовка систем CFPS
Для производства интересующего белка системы CFPS используют компоненты из сырых клеточных лизатов микроорганизмов, растений или животных для получения энергии и синтеза белка. Обычно используются сырые экстракты E. coli , ретикулоцитов кролика, зародышей пшеницы (WGE), клеток насекомых (Kigawa et al., 2004; Liu et al., 2005; Schwarz et al., 2007) или системы очищенные рекомбинантные элементы (PURE) (Shimizu et al., 2001; Kuruma and Ueda, 2015), которые имеются в продаже.Приготовление системы CFPS представляет собой простой процесс, при котором представляющие интерес клетки выращивают в течение ночи, разбавляют и продолжают выращивать до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,8–1,0, после чего клетки собирают и обрабатывают ультразвуком для экстракции клеточного лизата. Буферная смесь, дополненная необходимыми кофакторами, источниками энергии, нуклеотидами, субстратами, аминокислотами и тРНК, добавляется к клеточному экстракту, чтобы превратить его в CFPS и систему внеклеточной транскрипции-трансляции (TX-TL) (Rustad et al. , 2017). Сравнение преимуществ систем CFPS над аналогами с живыми клетками приведено в таблице 1.Хотя цена систем CFPS остается относительно высокой, ее можно снизить за счет регенерации энергии и кофакторов (Kim and Swartz, 2001; Woodyer et al., 2006).
Таблица 1 . Сравнение обычных живых клеток и систем CFPS.
Общая схема системы CFPS показана на рисунке 1, демонстрируя эксперимент в одной пробирке с соответствующими буферами, содержащими необходимый клеточный лизат и ДНК (линейную или плазмидную), а также связанные с ними источники энергии, нуклеотиды, аминокислоты, соли и кофакторы. , которые в целом поддерживают реакцию для создания интересующего продукта.Продукты CFPS могут варьироваться в зависимости от множества химических или биологических компонентов, включая вирусы, терапевтические средства, антитела, химические вещества, биотопливо и белки. При производстве таких химикатов системы CFPS имеют непосредственные преимущества перед альтернативными системами in vivo , особенно с учетом относительной скорости, простоты и эффективности технологии. Как правило, системы in vivo занимают много времени и, как правило, имеют больше шагов, чем системы CFPS (показаны на рисунке 2).
Рисунок 1 . Схематическое изображение системы CFPS, выполненной в одной пробирке, которая требует клеточного лизата, источников энергии, нуклеотидов, аминокислот, солей, кофакторов, линейной или плазмидной ДНК и воды / буфера для поддержания реакции. Такая система может быть использована для синтеза вирусов, антител, терапевтических и высокопроизводительных белков.
Рисунок 2 . Сравнение обычной системы in vivo и системы CFPS. Система in vivo способна производить рекомбинантные белки или терапевтические соединения, такие как система CFPS, хотя для достижения эквивалентного результата требуется больше экспериментальных шагов и времени.
Несмотря на это, существует желание еще больше снизить стоимость и увеличить выход продукта CFPS, особенно с учетом периода полураспада реакции, и, соответственно, исследователи вложили свое время и усилия, чтобы найти альтернативы соединениям, которые можно использовать в качестве субстратов. для синтеза белка в системах CFPS (Zemella et al., 2015). Использование фосфоенолпирувата (PEP) в качестве источника энергии приводит к быстрому накоплению фосфатов из-за присутствия фосфатазы в клеточном лизате (Zemella et al., 2015), что, в свою очередь, приводит к снижению количества АТФ из среды CFPS (Calhoun and Swartz, 2005). Также известно, что накопление фосфата ингибирует синтез белка в бесклеточной среде из-за снижения концентрации свободного магния в реакционной системе (Kim and Swartz, 1999). Использование глюкозо-6-фосфата вместо PEP в качестве источника энергии приводит к более высокому выходу белка в бесклеточной среде (Calhoun and Swartz, 2005). Имитация физиологии цитоплазмы — еще один способ увеличить выход белка в бесклеточных системах.Джеветт и Шварц (2004) продемонстрировали, что имитация pH цитоплазмы и использование соответствующих буферов в реакционных системах увеличивает выход синтеза белка при использовании пирувата в качестве источника энергии. Аналогичная попытка была предпринята для получения высокого выхода белков при использовании более дешевого субстрата. В исследовании использовался фруктозо-1,6-бисфосфат в качестве источника энергии для синтеза белка и был получен титр 1,3 мг / мл белков с расчетной стоимостью производительности около 0,5 доллара США за миллиграмм белка (Kim et al., 2007).
Исследователи разработали протокол, которым могут легко пользоваться даже неспециалисты (Levine et al., 2019). Протокол основан на выращивании клеток E. coli в обогащенной среде с использованием колбы с перегородками и приготовлении его лизата с помощью обработки ультразвуком. С добавлением соответствующих реагентов и других субстратов протокол, разработанный Levine et al. (2019) удалось получить 0,9 мг / мл флуоресцентного белка суперпапкального зеленого (sfGFP) за 5 часов реакции по цене 21 доллар США за миллиграмм синтезированного белка.Также было проведено исследование, которое позволяет исследователям транскрибировать и транслировать интересующий белок способом in vitro с использованием лизата термофильного организма под названием Sulfolobus solfataricus (Lo Gullo et al., 2019). Протокол позволяет пользователю экспрессировать активный белок при высокой температуре. Оптимальная температура для проведения реакции оказалась 70 ° C без добавления экзогенных компонентов. Однако авторы пришли к выводу, что разработанный протокол еще не подходит для крупномасштабного производства рекомбинантного белка (Lo Gullo et al., 2019). Из-за высокой скорости синтеза белка, обнаруженной в Vibrio natriegens , его экстракт может выступать в качестве потенциального кандидата на высокий уровень CFPS. Благодаря этому была разработана универсальная платформа V. natriegens CFPS путем обработки ячеек ультразвуком, что устраняет необходимость в дорогостоящих инструментах. Титр sfGFP 1,6 ± 0,05 мг / мл был получен в периодическом режиме CFPS, что доказывает, что система CFPS на основе V. natriegens была почти так же хороша, как текущая CFPS, которая E.coli предложения. После лиофилизации активные экстракты сохранили свойства биосинтеза и способность продуцировать антимикробные пептиды (Des Soye et al., 2018). Точно так же был разработан протокол, в котором используются обычные лабораторные инструменты, и клеточный экстракт можно приготовить в течение 1-2 дней с помощью ультразвукового устройства. Более 0,26 мг / мл белка sfGFP было синтезировано в течение 3 часов после установки реакции с использованием разработанного протокола путем включения экстрактов V. natriegens (Wiegand et al., 2019).
Обычно исследования мембранных белков проводят путем получения стабильных выходов целевых белков в виде преципитатов без использования структур, имитирующих мембраны (Zemella et al., 2015). Это приводит к относительно трудоемким этапам очистки и повторной солюбилизации, которые, возможно, могут изменить характеристики целевого белка. Структуры, имитирующие мембраны, которые включают детергенты (такие как Triton X-100 и Digitonin), нанодиски и липосомы, были использованы для облегчения правильного сворачивания мембранных белков в бесклеточной среде (Zemella et al., 2015). Скученность, вызванная высокой концентрацией макромолекул, влияет на константы равновесия и кинетические скорости экспериментов, в том числе бесклеточных экспериментов на основе TX-TL (Minton, 2001). Учитывая это, Рустад и др. (2017) синтезировали бактериофаги MS2, ΦX174 и T7 в отдельных реакциях OnePot с использованием бесклеточной системы TX – TL на основе E. coli . Чтобы имитировать лучшую физиологию цитоплазмы, они исследовали влияние, изменяя концентрации магния и калия, а также увеличивая молекулярную скученность при добавлении PEG 8000 (до 4.5% мас. / Об.), Что продемонстрировало драматическое влияние на синтез фагов. Для дальнейшего изучения влияния макромолекулярной скученности в системе CFPS было предложено уравнение для описания биомимикрии in vitro скученной среды, присутствующей в E. coli в желаемом объеме реакционной смеси с использованием ее лизата (Khambhati et al. ., 2019а). Sun et al. (2013) разработали новый метод с использованием штамма E. coli BL21 Rosetta 2, способного получать доступ как к эндогенному, так и к экзогенному клеточному аппарату E.coli для синтеза белка. Они использовали измельчение гранул вместо гомогенизации и обработку ультразвуком для лизиса клеток, чтобы избежать нагрева образца, и использовали использование 3-фосфоглицериновой кислоты в качестве источника энергии, отметив более высокий выход, чем PEP и креатинфосфат. По сравнению с коммерчески доступными бесклеточными системами, это исследование продемонстрировало снижение затрат на 98% при материальных затратах 0,011 доллара США на микролитр клеточной реакции, что привело к 0,75 мг / мл GFP.
С развитием систем CFPS, исследователи также попытались использовать нерибосомные пути биосинтеза для производства циклического пептида in vitro .Геринг и др. (2016) использовали ПЭП в качестве источника энергии для синтеза D-Phe-L-Pro дикетопиперазина (DKP), циклического дипептида. DKP продуцировали внеклеточной совместной экспрессией плазмид, содержащих гены GrsA и GrsB1 . Кроме того, для приготовления клеточных лизатов использовали штамм E. coli BL21 Star [DE3]. Чтобы преобразовать GrsA и GrsB1 в их функциональные формы, Bodipy-CoA и Sfp были добавлены непосредственно в систему после инкубации плазмид в течение 17 часов.Система состояла из эксперимента с одним горшком, в котором титр DKP составлял 0,012 мг / мл. Включение неканонических аминокислот (ncAA) в полипептиды придает новые функциональные возможности и химические свойства целевому белку, но остается сложной задачей для выполнения in vivo из-за его токсичности (Worst et al., 2016). Чтобы решить эту проблему, Worst et al. (2016) создали бесклеточный протокол TX-TL, который позволяет успешно включать L-канаванин (вместо L-аргинина) и L-гидроксилизин (заменяющий L-лизин) в белки, тем самым расширяя потенциал для новых функциональные возможности, которые необходимо добавить к белкам, избегая риска клеточной токсичности.Эти исследования показывают, что бесклеточные системы могут быть ценным инструментом для производства сложных молекул. Была разработана экономичная система OnePot PURE, которая предлагает исследователям вырастить 36 клонов E. coli , продуцирующих необходимый белок, в одной колбе и очистить их с помощью одного метода очистки Ni-NTA. Было обнаружено, что нормализованное улучшение стоимости разработанного метода по сравнению с существующей системой PURE составляет 14 раз при стоимости 0,09 доллара США за микролитр реакции с титром 0.156 мг / мл белка (Lavickova, Maerkl, 2019).
Возможные применения систем CFPS
Производительность, стоимость, масштаб и сложность рекомбинантных белков быстро расширили использование и коммерциализацию систем CFPS (Swartz, 2006). В этом разделе мы освещаем успехи, достигнутые с системами CFPS в многочисленных проектах, направленных на увеличение и улучшение производства ценных продуктов, включая белки, ферменты и терапевтические препараты. Потенциальные области применения систем CFPS приведены на Рисунке 3.
Рисунок 3 . Многочисленные потенциальные применения систем CFPS для содействия высокопроизводительному производству белка, включая производство антител, белков с неприродными аминокислотами, терапевтических средств, вирусов и вирусоподобных частиц, а также генных цепей.
Белки с высокой пропускной способностью
В постгеномную эпоху высокопроизводительным платформам CFPS уделялось много внимания из-за их многочисленных преимуществ, которые включают (i) прямое использование шаблонов ПЦР, чтобы избежать исчерпывающих этапов клонирования, (ii) рентабельные реакции, (iii) потенциал для миниатюризации, а также автоматизации с помощью микрожидкостных микросхем, и (iv) отсутствие барьера клеточной стенки, который позволяет легко управлять реакциями.Использование систем CFPS могло бы быть лучшим выбором для мечения за счет включения неприродных аминокислот (UAA), что весьма полезно для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или рентгеноструктурного анализа (Sawasaki et al., 2002; Jin and Хонг, 2018). Соответственно, CFPS продемонстрировала эффективность для легкого включения меченых аминокислот и высокой экспрессии белка, что позволяет улучшить ЯМР-анализ (Sawasaki et al., 2002; Morita et al., 2003; Ozawa et al., 2004; Takai et al., 2008). ).
СистемыCFPS были использованы для крупномасштабного синтеза белковых библиотек для исследований функциональной геномики.Массивы белков in situ (PISA) были использованы для быстрого и эффективного создания систем CFPS для изучения взаимодействия белков на биочипах (He and Taussig, 2007; He et al., 2008). Системы CFPS на основе WGE использовались для синтеза 13 364 человеческих белков, создавая инфраструктуру для фабрики человеческих белков. Среди заметных результатов этого — обнаружение функциональности 58 из 75 синтезированных ферментов фосфатазы человека и их последующая печать на предметных стеклах для создания функционального белкового микроматрица (Goshima et al., 2008).
Клеточная линия яичников китайского хомячка (СНО) признана безопасной и наиболее важной для промышленного производства белка. Клеточный лизат СНО содержит микросомы и может также содержать белки, включая дисульфидизомеразу или связывающий белок иммуноглобина, которые необходимы для образования дисульфидных мостиков и правильного сворачивания белков с дисульфидными мостиками. Эти особенности могут быть использованы для синтеза белков, которые трудно экспрессировать, обеспечивая непрерывный поток бесклеточных систем лизата клеток СНО.Оптимизация условий реакции CFPS произвела до 0,98 мг / мл мембранного белка (Thoring et al., 2017). Помимо лизата клеток СНО, культивируемые клетки Spodoptera frugiperda 21 также использовали для получения преимуществ транслокационно активных микросом. Благодаря комбинации внутренних сайтов входа в рибосомы (IRES) и непрерывной обменной трансляции белков реакции CFPS продукция рецепторов эпидермального фактора роста достигает 0,285 мг / мл (Quast et al., 2016). Аналогичным образом 0,7 мг / мл белка оболочки вируса (gp67) также было получено из лизатов клеток насекомых (Merk et al., 2015). Системы CFPS могут быть дополнительно расширены для экспрессии и тестирования более высоких библиотек в 384-луночных форматах, что позволяет комплексным исследованиям и высокопроизводительным экспериментам работать достаточно быстрее, быстрее и с меньшими затратами.
Белковые продукты сегодня играют жизненно важную роль в области медицины. Значительную часть белков, которые используются в биофармацевтической и промышленной областях, сложно выразить, поскольку они часто слишком сложны и токсичны или принадлежат к мембранным белкам, которые трудно продуцировать с использованием живых клеток.Следовательно, основной целью системы CFPS является регулирование и оптимизация продукции белка in vitro . Высокие уровни токсичности белка могут привести к гибели живых клеток во время клонирования и экспрессии гена in vivo . Токсичные белки могут мешать метаболическим путям биосинтеза и иметь тенденцию ингибировать деление клеток. Следовательно, их трудно экспрессировать в больших количествах in vivo . Некоторые из высокотоксичных белков уже были экспрессированы и очищены из бесклеточных систем, включая эндонуклеазы рестрикции (Goodsell, 2002), токсин, растягивающий цитолеты (Ceelen et al., 2006) и человеческий белок, связывающий микротрубочки (Betton, 2003). Поскольку нет необходимости полагаться на рост и деление клеток, системы CFPS могут использоваться в качестве альтернативной и отличной платформы для производства токсинов. Мембранные белки продолжают привлекать научное внимание из-за их потенциала в качестве мишеней для лекарств, хотя in vivo сверхэкспрессия таких белков остается критическим узким местом в процессе исследований из-за их сложной структуры, потенциальной токсичности, утомительной подготовки и низкой эффективности.В ряде исследований было высказано предположение, что системы CFPS могут использоваться для сверхэкспрессии мембранных белков, причем успехи продемонстрированы для ряда мембранных белков, которые включают рецептор, связанный с G-белком (Orbán et al., 2015), вакцинные антигены (Welsh et al. ., 2012; Lu et al., 2014) и тетрациклиновый насос TetA (Wuu, Swartz, 2008). В этом отношении неприродная и высокотоксичная (в контексте живых клеток) аминокислота канаванин, аналог аргинина, который может служить в качестве возможного антиметаболитного и органического аллелохимического агента, был экспрессирован через систему CFPS (Worst et al. ., 2015).
СистемаCFPS даже использовалась для включения UAA с использованием ортогональной тРНК, производящей 0,9–1,7 мг / мл растворимых вариантов sfGFP, содержащих либо п-азидо-L-фенилаланин (pAzF), либо п-пропаргилокси-L-фенилаланин (pPaF). , которые накапливались в растворе CFPS (Albayrak, Swartz, 2013). Соответственно, CFPS использовался для включения нестандартных аминокислот (nsAA) для создания белков и ферментов с новыми свойствами, обновленными структурными элементами и выдающимися функциями (Hong et al., 2014). Для препаратов клеточного лизата использовали клеток E. coli , лишенных RF1 (фактор высвобождения 1), белка, который, как известно, останавливает механизм, поддерживающий трансляцию. Для включения сайт-специфичных nsAA был использован механизм подавления янтарного цвета, при котором 13 вхождений стоп-кодона желтого цвета (UAG) были переназначены синонимичному кодону охры (UAA) (rEc.E13.ΔprfA) (рис. 4). Было отмечено, что максимальная продукция составляет 0,19 ± 0,02 мг / мл растворимого sfGFP, который содержит либо один pPaF, либо п-ацетил-L-фенилаланин (pAcF) в своей последовательности (Hong et al., 2014). В другом исследовании сайт-специфическая интеграция UAA была использована для увеличения разнообразия белков и протеомного кода (Shrestha et al., 2014). Расходы на потребление снизились на 55% за счет использования альтернативных источников энергии (например, глюкозы). Шаблоны линейной экспрессии (LET) использовались для экспрессии и включения UAA, поскольку использование систем на основе LET снижает трудозатраты по сравнению с in vivo, или продуцированием CFPS на основе плазмиды. Затраты на рабочую силу снижаются с точки зрения количества шагов, необходимых для производства.Система на основе LETs требует только четырех этапов, то есть ПЦР, CFPS, очистки и анализа, тогда как in vivo и CFPS на основе плазмид требуют дополнительных этапов, которые включают синтез библиотеки плазмид, трансформацию в штамм экспрессии (для в vivo CFPS), очистку плазмиды (для CFPS на основе плазмид) и рост клеток вместе с его поддержанием ( in vivo ). С той же точки зрения UAA были включены в конкретных местах с использованием системы CFPS E.coli в сочетании с аминоацил-тРНК синтетазой и супрессорной тРНК произошла от Methanocaldococcus jannaschii , который обеспечивал высокий титр (до 1 мг / мл) белков, несущих включенные UAA в определенных сайтах (Ozawa and Loh, 2014). Впоследствии неочищенные клеточные экстракты геномно перекодированного штамма E. coli (MCJ.559), лишенного RF1 и отключенного для пяти негативных генов эффекторной нуклеазы ( rna, rnb, csdA, mazF и endA ), использовали для производят 0.55 ± 0,04 мг / мл sfGFP, содержащего pAcF, который был дополнительно увеличен до 1,3 мг / мл с использованием полунепрерывной системы (Hong et al., 2015).
Рисунок 4 . Для включения неприродных аминокислот используются тРНК, подавляющие янтарь. Штамм, имеющий RF1, будет создавать конкуренцию между тРНК, подавляющей янтарь, и RF1 за связывание с сайт-специфическим янтарным кодоном, который представлен на рисунке. Чтобы избежать этого конкурентного связывания, клеточный экстракт готовят с использованием штамма, лишенного RF1.Рисунок воспроизведен с разрешения Schoborg and Jewett (2018) © John Wiley and Sons, Inc.
Другой подход — разработка тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы для расширения генетического кода за счет включения nsAA (Martin et al., 2018). Была разработана платформа CFPS, использующая MAGE в E. coli посредством делеции RF1 (Martin et al., 2018). На этой оптимизированной платформе первоначально был получен титр до 1,78 мг / мл sfGFP, который при увеличении за счет включения 40 идентичных остатков pAcF в эластиноподобный полипептид продуцировал 0.096 мг / мл желаемого полипептида с точностью 98% (Martin et al., 2018). Эта система может быть полезна для включения других UAA для понимания новых аспектов разнообразия и функциональности белков. Кроме того, был разработан эффективный и действенный протокол для строго регулируемого добавления UAA в конкретный участок белка (Gao et al., 2019). Компоненты системы ортогональной трансляции добавлялись отдельно, а ортогональные тРНК добавлялись косвенно (Gao et al., 2019).
Выход мембранного белка за счет внеклеточной экспрессии намного меньше по сравнению с немембранными белками (Krishnan et al., 2019). Таким образом, были предприняты усилия по увеличению выхода мембранных белков за счет внеклеточной экспрессии путем разработки протокола с использованием детергентов и липидных нанодисков (рис. 5). Результаты показали, что детергенты, такие как Brij-35 и Brij-78, подходят для солюбилизации мембранного белка субъединицы S фотосистемы II (PSBS) (Krishnan et al., 2019). Одной из причин этого может быть длинная цепь полиоксиэтиленалкилэфиров, присутствующих в детергентах Brij-35 и Brij-78, вместе с их гидрофильной головкой, которая способствует солюбилизации белка PSBS.Кроме того, разработанный бесклеточный протокол способствует экспрессии белка PSBS с использованием системы непрерывного обмена при температуре 30 ° C с титром 500 нг / мкл реакционной системы. Очистку и повторную укладку белка PSBS способствовало использование детергента н-додецил-β-D-мальтозида (Krishnan et al., 2019).
Рисунок 5 . Для производства мембранных белков с помощью платформ CFPS используются несколько структур, имитирующих мембраны. (A) липидный бислой, (B) липосома, (C) мицелла, (D) бицелла, (E) нанодиск и (F) привязанная двухслойная липидная мембрана.Рисунок воспроизведен с разрешения (Schoborg and Jewett, 2018) © John Wiley and Sons, Inc.
Терапия
Многочисленные исследования подчеркивали значительную функциональную эффективность рекомбинантных белков, полученных из систем CFPS. CFPS был аккредитован как жизнеспособный вариант для производства терапевтических белков (Tran et al., 2018). Сложные белки, такие как протеаза урокиназы и вариант активатора плазминогена тканевого типа человека, содержащие шесть и девять дисульфидных связей, соответственно, были получены с помощью бесклеточных систем с использованием E.coli (Kim, Swartz, 2004; Yin, Swartz, 2004). Терапевтическое значение протеазы урокиназы связано с ее активностью как тромболитического агента, который помогает лечить тромбозависимые заболевания. Ключевая роль протеазы урокиназы — преобразование плазминогена в плазмин, шаг, который помогает растворять сгустки крови (Craik et al., 2011). Точно так же варианты тканевого активатора плазминогена могут быть использованы в качестве лекарств для лечения острого ишемического инсульта (Zivin, 2009).Однако снижающая активность дисульфида в клеточном лизате затрудняет образование дисульфидных связей в белках. Эта проблема может быть решена путем разработки адаптированного метода, в котором клеточные экстракты при обработке йодацетамидом перед инициированием реакций синтеза белка отменяют восстанавливающую активность дисульфида, присутствующего в клеточном лизате (Kim and Swartz, 2004; Yin and Swartz, 2004). Кроме того, использование очищенной дисульфидизомеразы DsbC и окислительно-восстановительного буфера глутатиона в реакционной системе позволяет образовывать активную протеазу урокиназы (0.04 мг / мл), который содержит шесть дисульфидных связей в своей окончательно выраженной структуре. Помимо этого, белок-активатор плазминогена тканевого типа человека с повышенной растворимостью и титром (до 0,06 мг / мл) был получен с помощью Skp (периплазматический шаперон E. coli ) и органических химикатов спермидина и путресцина в реакционной системе. в который было добавлено несколько других органических химикатов для поддержания более естественной окружающей среды (Yin and Swartz, 2004). Сводка терапевтических белков, которые были продуцированы системами CFPS, приведена в таблице 2.
Таблица 2 . Список терапевтических белков, производимых с помощью CFPS.
Слитые белки гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) представляют собой эффективные иммунотерапевтические вакцины против В-клеточной лимфомы (Yang et al., 2005). Для демонстрации правильной биологической активности этих белков как GM-CSF, так и scFv идиотипа В-клеточной лимфомы должны образовывать две разные дисульфидные связи, а конъюгация должна происходить на аминоконце GM-CSF для получения биологически функционального продукта на конец (Ян и др., 2005). В сконструированной системе CFPS для получения активных конъюгатов использовали экстракт клеток E. coli , предварительно обработанный йодацетамидом (IAM), содержащий сульфгидрильный окислительно-восстановительный буфер, и был достигнут титр 0,043 мг / мл конъюгатов scFv 38C13 B-лимфоцитов Id ( Ян и др., 2005).
Терапевтическое значение инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) для лечения некоторых заболеваний центральной нервной системы, включая предменструальный синдром (ПМС) и синдром Ретта у детей, огромно (Costales and Kolevzon, 2016). Лизаты клеток E. coli использовали в системе CFPS для производства до 0,4 мг / мл IGF-I (Swartz, 2006). Колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов человека (rhGM-CSF) также может действовать как терапевтический белок. Он был произведен Sutro Biopharma Inc. с использованием системы CFPS, размещенной в объеме 100 литров, которая является одной из крупнейших систем CFPS, используемых на сегодняшний день. Это знаменательный пример, который продемонстрировал неотъемлемый потенциал CFPS для производства терапевтических белков, и в их системе CFPS они могут производить до 0.7 мг / мл rhGM-CSF в течение 10 часов инкубации (Zawada et al., 2011). Возможные применения rhGM-CSF включают помощь в иммунотерапии рака и заживление хронических ран (Vanitha et al., 2017; Brem et al., 2018).
CFPS — важная платформа, которая может быстро и экономически эффективно синтезировать важные с медицинской точки зрения молекулы; однако тип CFPS может повлиять на конечный результат. В этом контексте были созданы две платформы E. coli CFPS, одна из которых была основана на клеточном экстракте, а другая была универсальной бесклеточной платформой.Общая платформа показала более высокую экспрессию терапевтических белков, фрагментов антител и вакцин, получив титры 0,71, 0,23 и 0,3 мг / мл соответственно (Goerke and Swartz, 2008). Позже были произведены противораковые агенты hGM-CSF, hG-CSF и человеческий интерферон альфа 2b (hIFNα2b) до 0,823 ± 0,060, 0,619 ± 0,068 и 0,692 ± 0,046 мг / мл соответственно (Goerke and Swartz, 2008). . Также была проанализирована способность производить ряд потенциальных вакцин с продуцированием на основе CFPS мышиного scFv (Mvlvh) и человеческого scFv (Hvlvh), а также слитых белков белка бактериального иммунитета (im9) Im9-hvlvh, mGM-Im9- mvlvh и mGM-Im9-hvlvh, где титр 0.Было зарегистрировано 519 ± 0,038, 0,455 ± 0,007, 0,441 ± 0,021, 0,628 ± 0,056 и 0,591 ± 0,048 мг / мл соответственно (Goerke and Swartz, 2008). Кроме того, до 0,4 мг / мл консенсусного интерферона cIFN-α также было достигнуто с помощью системы CFPS клеточного лизата E. coli (El-Baky et al., 2011). Потенциальные возможности применения этого соединения проистекают из его способности в качестве противоракового препарата, так как в ходе исследований in vitro оно проявляло противораковые эффекты (El-Baky et al., 2011).
Ранее для производства онконазы, препарата для лечения злокачественной мезотелиомы, живые клетки E. coli обычно подвергали лизису, после чего белок очищали от телец включения, обнаруженных в осадках клеток (Salehi et al., 2016 ). Проблема была решена с помощью нового метода, который имеет дополнительное преимущество, заключающееся в прямой и немедленной характеристике онконазы без необходимости в трудоемких этапах очистки. Метод может использоваться для получения до 0.03 мг / мл онконазы в активной форме, около 80% массы которой составляет растворимая онконаза (Salehi et al., 2016).
Стрептокиназа, важный фермент в тромболитической терапии, была продуцирована до 0,5 мг / мл в течение 2,5 часов инкубации посредством CFPS с использованием лизатов клеток HeLa и CHO таким образом, чтобы полученный белок не был гликозилирован и не имел дисульфидных связей. После первоначальной характеристики было доказано, что он функционально эффективен с точки зрения активности и результата.Кроме того, использование инертной технологии очистки белков дает лучший выход по сравнению со стандартными технологиями аффинной хроматографии (Tran et al., 2018). 0,013 мг / мл вариабельного фрагмента одноцепочечного антитела (scFv) против О-антигена Salmonella получали с помощью CFPS с WGE (Kawasaki et al., 2003). Полученный продукт может иметь диагностическое и иммунотерапевтическое применение благодаря более короткому времени выведения из ткани и пониженной иммуногенности (Anand et al., 1991).
WGE использовался для сверхэкспрессии 124 генов из генома Plasmodium falciparum для помощи в разработке вакцины против малярии (Tsuboi et al., 2008, 2010). Из 124 генов 93 гена (74%) экспрессировались в растворимой форме. Интересно, что было обнаружено, что использование нативных кодонов в генах приводит к более высокому результату по сравнению с использованием генов, оптимизированных для кодонов. Аналогичным образом, системы CFPS использовались для экспрессии ботулотоксинов с получением титра до 1 мг / мл (Zichel et al., 2010). Использование систем CFPS для производства ботулинической вакцины может устранить проблему смещения кодонов, с которой сталкивается во время продукции in vivo рекомбинантной Hc цепи ботулинического токсина при использовании E. coli и дрожжей Pichia pastoris в качестве хозяина. организмы. Кроме того, была разработана новая система CFPS на основе Saccharomyces cerevisiae для производства белка и терапевтических средств. При тестировании системе удалось получить титр до 0.007 мг / мл люциферазы светлячков в периодических реакциях. В этой системе были исключены такие факторы, как дорогие реагенты и посторонние этапы обработки (Hodgman and Jewett, 2013).
Любой терапевтический белок, полученный из E. coli , требует обширных и дорогостоящих стадий очистки, чтобы производитель мог избежать накопления эндотоксина E. coli в конечном продукте. Наличие эндотоксина в продукте может потенциально привести к септическому шоку у пациента (Wilding et al., 2019). Система CFPS, созданная из лизата клеток ClearColi ® , может действовать как раствор для производства бесклеточных опосредованных терапевтических белков, свободных от эндотоксинов. Клетки ClearColi ® лишены эндотоксина, который обычно обнаруживается в других клетках E. coli ; однако протокол приготовления экстракта немного отличается от протокола другого штамма E. coli из-за его пониженной скорости роста и чувствительности к осмолярности (Wilding et al., 2019). Исследование продемонстрировало продукцию крисантаспазы из лизата клеток ClearColi ® , содержащего восстановленные E.coli , что устраняет дорогостоящие и обширные этапы очистки его эндотоксина. Полученный титр крисантаспазы был сопоставим с титром, продуцируемым экстрактом штамма E. coli BL21, то есть около 1 мг / мл. Крисантаспаза — это терапевтический белок, одобренный FDA для лечения рака (Wilding et al., 2019).
Гликопротеиныобладают огромным терапевтическим потенциалом, хотя для этого требуются обширные и дорогостоящие этапы очистки, что затрудняет их получение (Daniel et al., 2019). Эти белки производятся в клеточном отделении, называемом аппаратом Гольджи, где белок подвергается серии реакций гликозилирования. Немногие из причин низкого выхода синтеза белка через бесклеточную систему — это конкурирующие реакции и образование нежелательных побочных продуктов (Daniel et al., 2019). Однако клетка не сталкивается с упомянутыми проблемами, поскольку она локализует конкретную реакцию в определенном месте посредством компартментализации. На основе опыта клеток была разработана методика Golgi-on-chip для достижения компартментализации в бесклеточной системе для специфического синтеза гликопротеинов (Daniel et al., 2019).
Вирус и вирусоподобные частицы
Вирусы — это небольшие инфекционные агенты, которые неспособны к самовоспроизведению и используют механизм хозяина для своего размножения. Вирусы могут физически и метаболически переделывать хозяйскую клетку, чтобы создать оптимальную среду для их репликации (Chukkapalli et al., 2012). Вирусы, способные инфицировать самые разные типы клеток, генетически модифицированные вирусы, транспортирующие чужеродную ДНК, внесли большой вклад в развитие экспериментальных методов генной терапии.По сравнению с исследованиями in vivo , системы CFPS на основе ДНК предоставляют инструмент для исследования сложных биологических систем с большей степенью контроля и свободы, чем другие методы (Shin et al., 2012). Чтобы поддержать изучение сложных биологических систем, Shin et al. (2012) продемонстрировали репликацию, синтез и самосборку бактериофагов T7 и ΦX174 in vitro , чтобы установить тот факт, что большие программы ДНК могут эффективно экспрессироваться вне клетки (в их случае, в пробирке) через бесклеточную Системы TX – TL.Им удалось собрать от 0,1 до 1 миллиарда функциональных фагов с использованием 1 нМ генома (целевой ДНК). Первая партия фагов начала синтезироваться через 1 ч инкубации, и их накопление продолжалось в течение 5 ч. Также сообщалось, что добавление дНТФ увеличивало продукцию фага почти в 200 раз, а дальнейшие исследования показали, что после четвертого часа инкубации геномная ДНК начала деградировать, что способствовало наблюдаемому останову синтеза. Несмотря на то, что недостаток тиоредоксина в цитозоле имеет тенденцию нарушать репликацию ДНК in vivo , было подчеркнуто, что отсутствие тиоредоксина в этих бесклеточных системах TX-TL не препятствует продукции фага (Shin et al., 2012).
VLP представляют собой мультибелковые структуры размером в среднем 25–100 нм, способные к самосборке и могут систематически имитировать конформацию белков, обнаруженных в нативном вирусе (Roldão et al., 2010; Carlson et al., 2012) . Эти био-наноматериалы лишены генетической информации и, как таковые, не могут самовоспроизводиться, но из-за их способности отображать вирусные поверхностные белки высокой плотности они могут успешно проникать в живую клетку. Эти частицы образуются во время гетерологичной экспрессии вирусных белков одного или разных вирусов в системе или спонтанно во время жизненного цикла вируса внутри клетки (Chroboczek et al., 2014). Эти пустые оболочки (без вирусного генома) потенциально могут использоваться в качестве безопасных вакцин из-за их способности вызывать иммунный ответ и отсутствия саморепликации. Стимуляция врожденного иммунитета с помощью VLP облегчается за счет распознавания паттернов рецепторов и толл-подобных рецепторов и индукции сильного гуморального ответа. Это дополнительно усиливается за счет лучшего захвата, обработки и презентации антигенпрезентирующими клетками благодаря высокоспецифичным структурам и мультимерным антигенам VLP (Shirbaghaee and Bolhassani, 2016).Помимо вакцинации, VLP проявляют интерес к областям генной терапии, доставки лекарств, нанотехнологий и диагностики (Shirbaghaee and Bolhassani, 2016).
При получении VLP на основе обычных клеток они продуцировались in vivo , и их сборка была отделена от большого пула белков ex vivo . В традиционной клеточной системе встречаются многочисленные трудности, такие как низкие выходы, низкая растворимость белков бактериофагов, отсутствие посттранскрипционных модификаций, сложности при экспрессии вирусных белков млекопитающих, меньшая стабильность VLP, образование дорогостоящих продуктов и трудности разделения. морфологически схожих загрязняющих белков в разных системах хозяина (Pattenden et al., 2005). Соответственно, в ряде исследований были предприняты попытки решить эти проблемы. В исследовании Bundy et al. (2008) построили систему CFPS на основе E. coli для формирования VLP. Было перечислено несколько преимуществ по сравнению с используемыми в настоящее время системами на основе клеток, включая перенаправление метаболических ресурсов в сторону транскрипции и трансляции in vitro, , одноэтапную очистку, а также восстановление и устранение трудоемких процедур трансформации клеток. Для повышения стабильности VLPs Bundy and Swartz (2011) контролировали окислительно-восстановительный потенциал реакционной системы, позволяя им контролировать образование дисульфидных связей между мономерами капсида, тем самым изменяя стабильность VLP.В другом исследовании Patel and Swartz (2011) продуцировали VLP бактериофагов Qβ и MS2, которые обладали способностью связываться с азидными и алкинсодержащими множественными белками, которые включали фрагмент антитела scFv и фактор, стимулирующий колонию макрофагов гранулоцитов (GM-CSF). ) вместе, нуклеиновые кислоты и цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ). В своем эксперименте они произвели азидные и алкиновые аналоги метионина на поверхности VLP. Белки, нуклеиновые кислоты и ПЭГ были конъюгированы на поверхности VLP посредством реакции, катализируемой Cu (I).Их система производила 0,3 мг / мл VLP, которые включали до 85% аналогов метионина. Однако было обнаружено, что биологическая активность GM-CSF снижается в 3-5 раз после объединения с VLP. Patel и Swartz (2011) пришли к выводу, что молекулярное скопление белка scFv на поверхности VLP и кривизна VLP препятствуют доступу GM-CSF к рецепторам GM-CSF, что приводит к снижению биоактивности конъюгированного GM-CSF.
В целом, системы CFPS продемонстрировали большой потенциал для преодоления проблем, с которыми в настоящее время сталкиваются для производства вируса in vivo и VLP.Дальнейшие исследования и лучшая оптимизация протоколов CFPS необходимы для повышения надежности и эффективности этого метода при рассмотрении создания вирусов и VLP. В ближайшем будущем системы CFPS вполне могут заменить используемые в настоящее время методы на основе ячеек в промышленном масштабе, учитывая преимущества, которые системы CFPS имеют по сравнению с общепринятыми методами.
Биосдерживание, управляемое CFPS
Биосдерживание — это аспект биобезопасности в отношении организмов и видов, которые могут представлять риск для здоровья и экологии человека, и, в частности, охватывает их физическое сдерживание в безопасных зонах с целью запрета их выпуска в более широкое сообщество.Несмотря на широкое применение и большие успехи, многие современные стратегии биосдерживания могут оказаться недостаточно эффективными для решения современных проблем, особенно когда речь идет о высвобождении и распространении новых трансгенов и / или трансгенных организмов (Lee et al., 2018). Соответственно, существует острая необходимость в разработке новых технологий для борьбы с рисками биологического сдерживания, которые угрожают биобезопасности и биозащите, и эти технологии в конечном итоге послужили бы для резкого снижения потенциальной серьезности и опасности, представляемой генетически модифицированными организмами.Среди множества новых стратегий, которые были предложены на сегодняшний день, было предложено несколько из них, которые включают бесклеточные системы (Lee et al., 2018). Преимущество получения белков с помощью систем CFPS таким образом проистекает из их способности оставаться абиотическими, не имея большинства нормальных биотических процессов в клетках, но при этом задействуя гены и ДНК, которые будут делиться, дублироваться и мутировать. Ряд применений этих систем уже добились успеха, включая биосинтез терапевтических средств и инкапсуляцию механизмов транскрипции / трансляции в везикулы.Во всех случаях использование систем CFPS означало, что экспериментальный процесс демонстрировал более низкий риск биобезопасности, чем с живыми системами, что часто может быть недооцененным аспектом бесклеточных систем в целом.
Кроме того, изоляция систем CFPS, основанных на ксенобиологическом происхождении, может ограничить распространение заражения, которое может возникнуть в результате поглощения / распространения трансгенных материалов, и, следовательно, обеспечить еще одну степень безопасности в уровне их биологического сдерживания. Системы CFPS были использованы для содействия включению ncAA посредством переназначения кодонов (Hong et al., 2014), что еще больше повышает биобезопасность за счет использования модифицированных организмов, которые переназначили использование кодонов, которые достаточно чужды естественным организмам, чтобы сформировать прочный барьер против генетического загрязнения (Lee et al., 2018). Этот вид ксенобиологического барьера биобезопасности является преднамеренно выбранной целью для области ксенобиологии или ксенонуклеиновых кислот, и получение выгод от использования бесклеточных систем подчеркивает явный и сильный потенциал этих технологий для расширения стратегий биосдерживания в будущем.
Заключение и замечания на будущее
Синтетическая биология — это современная и инновационная научная дисциплина, целью которой является улучшение существующих производственных практик, решение проблем низкой урожайности и плохого соотношения затрат на продукт, а также проблем существующих практик, которые неизбежно наносят ущерб нашим экосистемам из-за актов загрязнения. . В любом из этих случаев было бы разумно рассмотреть альтернативы, и именно в синтетической биологии были обнаружены новые и альтернативные пути производства многих продуктов с добавленной стоимостью с убедительным количеством достижений и постоянно плодородной основой для выращивать будущие продукты и отрасли.В этом контексте мы рассмотрели и обсудили CFPS, охватывая его многочисленные успехи, достигнутые на сегодняшний день, и широкий потенциал его развития, а также некоторые необходимые шаги.
СистемыCFPS предлагают ярко выраженное научное влияние, которое может стимулировать развитие во многих областях высокопроизводительного производства за счет нацеливания технологии на создание ценных продуктов, которые включают белки, терапевтические препараты и вирусы / VLP. Для улучшения методов производства белка системы CFPS показали высокую эффективность для получения высоких уровней экспрессии, чистоты и выхода, в дополнение к упрощению включения меченых аминокислот, факторов, которые позволяют лучше анализировать структуры белка ЯМР (Morita et al. ., 2003; Одзава и др., 2004; Takai et al., 2008).
Относительная простота работы с системами CFPS означает, что трудоемкие и трудоемкие процессы клонирования можно свести к минимуму, а это означает, что создание крупномасштабных библиотек функциональных белков стало проще, чем раньше (Sawasaki et al., 2002; Liu et al. ., 2019; Rolf et al., 2019), способствуя их функциональному изучению и использованию в биочипах (He and Taussig, 2007; He et al., 2008), микрочипах (Goshima et al., 2008) и технологиях непрерывного потока ( Широков и др., 2002). Эти результаты показывают, что системы CFPS могут быть легко расширены и использованы для экспрессии, а также для тестирования библиотек высших белков, разработанных для многолуночных форматов и экспериментов, что позволяет очень сложным исследованиям и высокопроизводительным экспериментам, которым помогает эта технология, работать в значительной степени. быстрее и с меньшими затратами по сравнению с существующими практиками. Соответственно, областью дальнейших исследований будет тестирование всего потенциала систем CFPS и их применимости для помощи другим типам сложных и высокопроизводительных экспериментов.
Несмотря на большой прогресс в области биологических наук, многие белки по-прежнему трудно экспрессировать in vivo , что вызывает проблемы с их сложностью или токсичностью, а также с проблемами солюбилизации / очистки, особенно для мембранных белков. Мы обсудили ряд сложных белков, которые уже были получены с помощью систем CFPS, в том числе несколько эндонуклеаз рестрикции (Goodsell, 2002), белок, связывающий микротрубочки человека (Betton, 2003), и токсин, расширяющий цитолеталь (Ceelen et al., 2006), а также некоторые мембранные белки, включая тетрациклиновую помпу TetA (Wuu and Swartz, 2008), вакцинные антигены (Welsh et al., 2012; Lu et al., 2014) и рецептор, связанный с G-белком (Orbán и др., 2015). Экспрессия этого диапазона сложных белков очень вдохновляет, поскольку может быть переведена на другие сложные белки. Важность, которую белковые и ферментные продукты играют в современной медицине и биологических исследованиях, нельзя недооценивать, и, соответственно, из этого следует, что одним из компонентов развития этой технологии может быть просто ее строгое применение к белкам, которые остаются слишком сложными для изучения. .CFPS может привести к новым открытиям в различных областях, которые могут произвести революцию во многих медицинских методах лечения, а также в биомедицинских исследованиях рака, вирусных инфекций (через человеческие рецепторы) и устойчивости к антибиотикам, среди многих других.
Используемые в настоящее время клеточные лизаты получены из E. coli , зародышей пшеницы, ретикулоцитов кролика и клеток насекомых (Kigawa et al., 2004; Liu et al., 2005; Schwarz et al., 2007), с производственными системами PURE также используется (Shimizu et al., 2001; Курума и Уэда, 2015). Было бы очень интересно использовать другие источники бесклеточных материалов и субстратов, особенно для решения одной из проблем в системах CFPS, которая касается посттрансляционных модификаций продуктов. Эти модификации включают гликозилирование, дисульфидное связывание и правильную укладку белка. Дальнейшие разработки систем CFPS, соответственно, будут включать тестирование и анализ новых клеточных лизатов с целью определения лучших из них для всех возможных желаемых модификаций, проект, который в конечном итоге может развиться в форму in silico , как и в случае синтеза многих других белков и вспомогательные платформы проектирования.
В настоящее время бесклеточные системы используются для экономичного обнаружения штаммов вирусов Эбола, Зика и денге (Pardee et al., 2014, 2016; Gootenberg et al., 2017; Khambhati et al., 2019b), болезней которые часто затрагивают более бедные районы мира со сложными проблемами доступности. Изобретение более дешевых и портативных тестов, в которых используются бесклеточные системы, может революционизировать способ обнаружения и лечения этих смертельных заболеваний, уменьшая их бремя для здоровья человека.Мы считаем, что в будущем CFPS сможет более серьезно бороться с этими заболеваниями, поскольку ущерб, который они наносят людям и сообществам, слишком велик. Осознав эти мощные методы обнаружения этих заболеваний, мы ценим потенциал того, как их можно адаптировать против новых вирусных вспышек в будущем, чтобы помочь в более эффективном управлении заболеваниями, чем раньше. Это также должно быть распространено на другие болезни мира, которые по-прежнему трудно диагностировать и лечить, где это когда-либо возможно.
В других областях системы CFPS использовались в широком диапазоне экспериментов, включая производство белков, содержащих токсичные аминокислоты, такие как канаванин (Worst et al., 2015), интеграцию ортогональных генетических кодов (Chemla et al., 2015; Des Soye et al., 2015), производство терапевтических лекарств (Zawada et al., 2011) и сборка бактериофагов (Shin et al., 2012) и многие другие. Многие из этих экспериментов дают четкие указания на будущую работу, которую необходимо выполнить для систем CFPS.С одной стороны, бесклеточные системы TX-TL позволили включить L-канаванин и L-гидроксилизин в белки, открыв дверь для будущих исследований этих и других аминокислотных замен. Преимущество здесь в том, что с расширением базового языка белков они теперь способны обладать новыми функциональными возможностями, которые в остальном токсичны для живых клеток, открывая совершенно новый мир для модифицированных функциональных возможностей белков и ферментов, которые ранее не рассматривались. Получение бесклеточного cIFN-α с хорошими урожаями — еще один захватывающий результат, который также требует дальнейшего развития, чтобы подтвердить его потенциал в качестве нового противоракового лечения, выходящего за рамки его нынешнего уровня in vitro (El-Baky et al. al., 2011).
Существует потребность в новых и лучших лекарствах против бесчисленного множества форм рака, и этот результат демонстрирует, что системы CFPS могут быть хорошо адаптированы для их синтеза или для улучшения существующих методов. Связанный результат, который следует изучить дальше, — это бесклеточный синтез вирусов / VLP. Вирусы и VLP могут использоваться для разработки экспериментальных методов генной терапии, доставки лекарств, диагностических инструментов и приложений нанотехнологий (Shirbaghaee and Bolhassani, 2016).Системы CFPS продемонстрировали исключительную способность генерировать вирусы / VLP, превышающие методов in vivo , и важность и потенциал этих видов таковы, что вполне вероятно, что бесклеточные системы могут заменить методы на основе клеток с будущей целью. месторождения, чтобы распространить этот прогресс на промышленные масштабы производства (Bundy et al., 2008; Patel and Swartz, 2011).
Во всех этих аспектах использование систем CFPS позволило биологам продвинуться в каждой из этих отдельных областей, открывая новые результаты и открытия.В целом, мы считаем, что этот диапазон исследований, в которых использовались системы внеклеточной экспрессии, дает очень многообещающую уверенность в том, что эти системы могут быть повторно использованы во многих других научных исследованиях, предлагая преимущества, которые позволяют проводить бесчисленное множество других интересных и убедительных экспериментов. , быстрее и дешевле, аналогично тем, которые мы обсуждали. Даже в самых незначительных случаях, если использование этих систем может сэкономить деньги и время, оно вполне может открыть дверь для снижения барьеров, позволяющих войти многим ученым и их проектам, предлагая большее разнообразие идей и экспериментов.Наконец, мы считаем, что системы CFPS, которые мы обсуждали, уже достигли многочисленных успехов, и с учетом текущих темпов роста современной науки и синтетической биологии становится ясно, что за ними должны последовать новые разработки и инновации. Мы должны экстраполировать эти успехи на решение многих существующих мировых проблем новыми, более безопасными, более эффективными и экологически чистыми способами, чтобы принести пользу здоровью планеты и, в конечном итоге, избавиться от нашей зависимости от невозобновляемых и загрязняющих источников ценных продуктов и энергии.
Авторские взносы
KK, GB, NG, DB и VS разработали и написали рукопись. ВК и БД прошли корректуру и дали комментарии и предложения. VS контролировал и доработал рукопись.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
GB и NG выражают признательность Фонду Пури по образованию в Индии за предоставление стипендии для младших исследователей для выполнения этой работы.
Сокращения
АТФ, аденозинтрифосфат; CFPS, Бесклеточный синтез белка; СНО, яичник китайского хомячка; GM-CSF, колониестимулирующий фактор гранулоцитарных макрофагов; IRES, сайты входа во внутренние рибосомы; LETs, шаблон линейного выражения; MAGE, Мультиплексная автоматизированная инженерия генома; ncAA, неканонические аминокислоты; ЯМР, ядерный магнитный резонанс; nsAA, нестандартные аминокислоты; pAcF, п-ацетил-L-фенилаланин; ПЭГ, полиэтиленгликоль; PEP, фосфоенолпируват; PISA, Protein in situ array; pPaF, п-пропаргилокси-L-фенилаланин; PSBS, субъединица S фотосистемы II; PURE, очищенные рекомбинантные элементы; RF1, фактор выпуска 1; scFv, вариабельный фрагмент одноцепочечного антитела; sfGFP, флуоресцентный белок Super Folder Green; TX – TL, Транскрипция – перевод; UAA, неприродные аминокислоты; USD, доллар США; VLPs, вирусоподобные частицы; WGE, экстракт зародышей пшеницы; YCE, экстракты дрожжевых клеток; IGF-I, инсулиноподобный фактор роста-I.
Список литературы
Албайрак К. и Шварц Дж. Р. (2013). Бесклеточное совместное производство ортогональной транспортной РНК активирует эффективное сайт-специфическое включение неприродных аминокислот. Nucleic Acids Res. 41, 5949–5963. DOI: 10.1093 / nar / gkt226
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Альпер Х., Фишер К., Невойгт Э. и Стефанопулос Г. (2005). Настройка генетического контроля с помощью промоторной инженерии. Proc. Natl.Акад. Sci. США 102, 12678–12683. DOI: 10.1073 / pnas.0504604102
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ананд, Н. Н., Мандал, С., МакКензи, К. Р., Садовска, Дж., Сигурскьолд, Б., Янг, Н. М. и др. (1991). Бактериальная экспрессия и секреция различных одноцепочечных генов Fv , кодирующих белки, специфичные для антигена серотипа BO Salmonella . J. Biol. Chem. 266, 21874–21879.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Аткинсон, М.Р., Саважо, М.А., Майерс, Дж. Т., и Нинфа, А. Дж. (2003). Разработка генетической схемы, демонстрирующей тумблер или колебательное поведение в Escherichia coli . Ячейка 113, 597–607. DOI: 10.1016 / S0092-8674 (03) 00346-5
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Brem, H., Howell, R., Criscitelli, T., Senderowicz, A., Siegart, N., Gorenstein, S., et al. (2018). Практическое применение гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) у больных с ранами. Surg. Technol. Int. 32, 61–66. Получено с: http://surgicaltechnology.com/32-Wound-Healing.htm#977
.PubMed Аннотация | Google Scholar
Бюхнер, Э. (1897). Alkoholische gährung ohne hefezellen. Ber. Dt. Chemi. Ges. 30, 117–124. DOI: 10.1002 / cber.18970300121
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Банди, Б. К., Францишкович, М. Дж., И Шварц, Дж. Р. (2008). Escherichia coli — бесклеточный синтез вирусоподобных частиц. Biotechnol. Bioeng. 100, 28–37. DOI: 10.1002 / bit.21716
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Карлсон, Э. Д., Ган, Р., Ходжман, К. Э. и Джуэтт, М. С. (2012). Бесклеточный синтез белка: приложения достигли совершеннолетия. Biotechnol. Adv. 30, 1185–1194. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2011.09.016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Селен, Л. М., Декостер, А., Дюкатель, Р., и Хезебрук, Ф.(2006). Цитолетальный растягивающий токсин вызывает гибель клеток, создавая узкое место в клеточном цикле. Microbiol. Res. 161, 109–120. DOI: 10.1016 / j.micres.2005.04.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., and Alfonta, L. (2015). Генетически расширенный внеклеточный синтез белка с использованием эндогенной системы ортогональной трансляции пирролизила. Biotechnol. Bioeng. 112, 1663–1672. DOI: 10.1002 / бит. 25587
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чен, Ю. Ю., Дженсен, М. К., и Смолке, К. Д. (2010). Генетический контроль пролиферации Т-клеток млекопитающих с помощью синтетических регуляторных систем РНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 8531–8536. DOI: 10.1073 / pnas.1001721107
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. (2013). Мультиплексная геномная инженерия с использованием систем CRISPR / Cas. Наука 339, 819–823. DOI: 10.1126 / science.1231143
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Косталес Дж., Колевзон А. (2016). Терапевтический потенциал инсулиноподобного фактора роста-1 при расстройствах центральной нервной системы. Neurosci. Biobehav. Ред. 63, 207–222. DOI: 10.1016 / j.neubiorev.2016.01.001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Каллер, С. Дж., Хофф, К. Г., и Смолке, К.Д. (2010). Перепрограммирование клеточного поведения с помощью контроллеров РНК, реагирующих на эндогенные белки. Science 330, 1251–1255. DOI: 10.1126 / science.1192128
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Даниэль, С., Акино, А., ДеЛиза, М., Яроентомеечай, Т., Лю, Х. Ю., Манзер, З., и др. (2019). Гольджи-на-чипе для бесклеточного био-нанопроизводства белковых терапевтических средств. Biophys. J. 116: 1а. DOI: 10.1016 / j.bpj.2018.11.025
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дес Сой, Б.Дж. Д., Дэвидсон, С. Р., Вайншток, М. Т., Гибсон, Д. Г. и Джуэтт, М. С. (2018). Создание высокоурожайной платформы для бесклеточного синтеза белка, полученного из Vibrio natriegens . ACS Synth. Биол. 7, 2245–2255. DOI: 10.1021 / acssynbio.8b00252
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дес Сой, Б. Дж. Д., Патель, Дж. Р., Айзекс, Ф. Дж., И Джуэтт, М. К. (2015). Переделка аппарата перевода для синтетической биологии. Curr.Opin. Chem. Биол. 28, 83–90. DOI: 10.1016 / j.cbpa.2015.06.008
CrossRef Полный текст | Google Scholar
ДиКарло, Дж. Э., Норвилл, Дж. Э., Мали, П., Риос, X., Аах, Дж., И Черч, Г. М. (2013). Геномная инженерия Saccharomyces cerevisiae с использованием систем CRISPR-Cas. Nucleic Acids Res. 41, 4336–4343. DOI: 10.1093 / nar / gkt135
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эль-Баки, Н.А., Омар, С.Х., и Редван, Э.М. (2011). Противораковая активность человеческого консенсусного интерферона-альфа, синтезируемого в бесклеточной системе. Protein Expr. Purif. 80, 61–67. DOI: 10.1016 / j.pep.2011.07.003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гибсон, Д. Г., Гласс, Дж. И., Лартиг, К., Носков, В. Н., Чуанг, Р. Ю., Алгире, М. А., и др. (2010). Создание бактериальной клетки под контролем химически синтезированного генома. Наука 329, 52–56. DOI: 10.1126 / наука.11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гибсон, Д. Г., Янг, Л., Чуанг, Р. Ю., Вентер, Дж. К., Хатчисон, К. А., и Смит, Х. О. (2009). Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз. Nat. Методы 6, 343–345. DOI: 10.1038 / nmeth.1318
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Геринг, А. В., Ли, Дж., МакКлюр, Р. А., Томсон, Р. Дж., Джуэтт, М. К., и Келлехер, Н. Л. (2016). In vitro реконструкция биосинтеза нерибосомных пептидов непосредственно из ДНК с использованием внеклеточного синтеза белка. ACS Synth. Биол. 6, 39–44. DOI: 10.1021 / acssynbio.6b00160
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гёрке А. Р. и Шварц Дж. Р. (2008). Разработка платформ для бесклеточного синтеза белков с дисульфидной связью. Biotechnol. Bioeng. 99, 351–367. DOI: 10.1002 / bit.21567
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гутенберг, Дж.S., Abudayyeh, O.O., Lee, J. W., Essletzbichler, P., Dy, A.J., Joung, J., et al. (2017). Обнаружение нуклеиновых кислот с помощью CRISPR-Cas13a / C2c2. Наука 356, 438–442. DOI: 10.1126 / science.aam9321
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Госима Н., Кавамура Ю., Фукумото А., Миура А., Хонма Р., Сато Р. и др. (2008). Фабрика белков человека для преобразования транскриптома в -экспрессируемый in vitro протеом . Nat. Методы 5, 1011–1017.DOI: 10.1038 / nmeth.1273
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хисано Ю., Сакума Т., Накаде С., Охга Р., Ота С., Окамото Х. и др. (2015). Точная интеграция внутренней части экзогенной ДНК, опосредованная системой CRISPR / Cas9 у рыбок данио. Sci. Отчет 5: 8841. DOI: 10.1038 / srep08841
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ходжман, К. Э., и Джуэтт, М. С. (2013). Оптимизированные методы приготовления экстракта и условия реакции для улучшения бесклеточного синтеза белка дрожжей. Biotechnol. Bioeng. 110, 2643–2654. DOI: 10.1002 / бит 24942
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хонг, С. Х., Квон, Ю. К., Мартин, Р. В., Дес Сой, Б. Дж., Де Пас, А. М., Свонгер, К. Н. и др. (2015). Улучшение внеклеточного синтеза белка посредством геномной инженерии Escherichia coli без фактора высвобождения 1. Chembiochem 16, 844–853. DOI: 10.1002 / cbic.201402708
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Hong, S.Х., Нтай И., Хаймович А. Д., Келлехер Н. Л., Айзекс Ф. Дж. И Джуэтт М. К. (2014). Бесклеточный синтез белка из с дефицитом фактора высвобождения 1 Escherichia coli активирует эффективное и множественное сайт-специфичное включение нестандартных аминокислот. ACS Synth. Биол. 3, 398–409. DOI: 10.1021 / sb400140t
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хатчисон, К. А., Чуанг, Р. Ю., Носков, В. Н., Асад-Гарсия, Н., Диринк, Э., Ллисман, М.H., et al. (2016). Дизайн и синтез минимального бактериального генома. Наука 351: aad6253. DOI: 10.1126 / science.aad6253
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Hwang, W. Y., Fu, Y., Reyon, D., Maeder, M. L., Tsai, S. Q., Sander, J. D., et al. (2013). Эффективное редактирование генома рыбок данио с помощью системы CRISPR-Cas. Nat. Biotechnol. 31, 227–229. DOI: 10.1038 / NBT.2501
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Айзекс, Ф.J., Carr, P.A., Wang, H.H., Lajoie, M.J., Sterling, B., Kraal, L., et al. (2011). Точная манипуляция с хромосомами in vivo позволяет заменять кодоны по всему геному. Наука 333, 348–353. DOI: 10.1126 / science.1205822
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Айзекс, Ф. Дж., Дуайер, Д. Дж., Динг, К., Первушин, Д. Д., Кантор, К. Р. и Коллинз, Дж. Дж. (2004). Сконструированные риборегуляторы обеспечивают посттранскрипционный контроль экспрессии генов. Nat. Biotechnol. 22, 841–847. DOI: 10.1038 / nbt986
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Jakočiunas, T., Bonde, I., Herrgård, M., Harrison, S.J., Kristensen, M., Pedersen, L.E., et al. (2015). Мультиплексная инженерия метаболических путей с использованием CRISPR / Cas9 в Saccharomyces cerevisiae . Metab. Англ. 28, 213–222. DOI: 10.1016 / j.ymben.2015.01.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джуэтт, М.С., и Шварц, Дж. Р. (2004). Имитация цитоплазматической среды Escherichia coli активирует долгоживущий и эффективный бесклеточный синтез белка. Biotechnol. Bioeng. 86, 19–26. DOI: 10.1002 / bit.20026
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цзян, Л., Чжао, Дж., Лянь, Дж. И Сюй, З. (2018). Бесклеточный синтез белка позволил быстро создать прототип для метаболической инженерии и синтетической биологии. Synth. Syst. Biotechnol. 3, 90–96. DOI: 10.1016 / j.synbio.2018.02.003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф. и Марраффини Л. А. (2013). РНК-управляемое редактирование бактериальных геномов с использованием систем CRISPR-Cas. Nat. Biotechnol. 31, 233–239. DOI: 10.1038 / NBT.2508
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Jin, X., и Hong, S.H. (2018). Бесклеточный синтез белка для производства белков, «трудно экспрессируемых». Biochem. Англ. J. 138, 156–164. DOI: 10.1016 / j.bej.2018.07.013
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кавасаки Т., Гауда М. Д., Савасаки Т., Такай К. и Эндо Ю. (2003). Эффективный синтез дисульфидсодержащего протеина в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Eur. J. Biochem. 270, 4780–4786. DOI: 10.1046 / j.1432-1033.2003.03880.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кеммер, К., Флури, Д. А., Витчи, У., Пассерауб, А., Гуцвиллер, А., Фуссенеггер, М. (2011). Сеть дизайнеров, координирующая искусственное осеменение крупного рогатого скота путем высвобождения имплантированных сперматозоидов в результате овуляции. J. Control Release 150, 23–29. DOI: 10.1016 / j.jconrel.2010.11.016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Khambhati, K., Gohil, N., Bhattacharjee, G., Panchasara, H., and Singh, V. (2019a). Уравнение для биосимуляции макромолекулярного краудинга с использованием штамма Escherichia coli MG1655. Biophys. Chem. 254, 106244. doi: 10.1016 / j.bpc.2019.106244
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кигава Т., Ябуки Т., Мацуда Н., Мацуда Т., Накадзима Р., Танака А. и др. (2004). Приготовление экстракта клеток Escherichia coli для высокопродуктивной бесклеточной экспрессии белка. J. Struct. Функц. Геномика 5, 63–68. DOI: 10.1023 / B: JSFG.0000029204.57846.7d
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ким, Д.М., и Шварц, Дж. Р. (1999). Продление внеклеточного синтеза белка с помощью новой системы регенерации АТФ. Biotechnol. Bioeng. 66, 180–188.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Ким, Д. М., и Шварц, Дж. Р. (2001). Регенерация аденозинтрифосфата из промежуточных продуктов гликолита для внеклеточного синтеза белка. Biotechnol. Bioeng. 74, 309–316. DOI: 10.1002 / бит.1121
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ким, Д.М., и Шварц, Дж. Р. (2004). Эффективное производство биоактивного белка с множественными дисульфидными связями с использованием модифицированных экстрактов Escherichia coli . Biotechnol. Bioeng. 85, 122–129. DOI: 10.1002 / бит. 10865
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Kim, H., Han, H., Ahn, J., Lee, J., Cho, N., Jang, H., et al. (2012). Синтез ДНК дробовика для высокопроизводительного конструирования больших молекул ДНК. Nucleic Acids Res .40: e140. DOI: 10.1093 / nar / gks546
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ким, Т. В., Кеум, Дж. У., О, И. С., Чой, К. Ю., Ким, Х. С., и Ким, Д. М. (2007). Экономичная и высокопроизводительная система бесклеточного синтеза белка, использующая фруктозо-1,6-бисфосфат в качестве источника энергии. J. Biotechnol. 130, 389–393. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2007.05.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кох, М., Фаулон, Дж. Л., Борковски, О. (2018). Модели для бесклеточной синтетической биологии: сделать прототипирование проще, лучше и быстрее. Фронт. Bioeng. Biotechnol. 6: 182. DOI: 10.3389 / fbioe.2018.00182
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Косури, С., Ерошенко, Н., Лепруст, Э. М., Супер, М., Уэй, Дж., Ли, Дж. Б. и др. (2010). Масштабируемый синтез генов путем селективной амплификации пулов ДНК с микрочипов высокой точности. Nat. Biotechnol. 28, 1295–1299.DOI: 10.1038 / NBT.1716
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кришнан М., де Лиу, Т. Дж. Дж. Ф. и Пандит А. (2019). Внеклеточная растворимая экспрессия мембранного белка PsbS. Protein Expression Purif. 159, 17–20. DOI: 10.1016 / j.pep.2019.02.010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ладжуа, М. Дж., Ровнер, А. Дж., Гудман, Д. Б., Аэрни, Х. Р., Хаймович, А. Д., Кузнецов, Г. и др. (2013).Геномно перекодированные организмы расширяют биологические функции. Наука 342, 357–360. DOI: 10.1126 / science.1241459
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ли, Дж. У., Чан, К. Т. Ю., Сломович, С., и Коллинз, Дж. Дж. (2018). Системы биологического сдерживания нового поколения для искусственно созданных организмов. Nat. Chem. Биол. 14, 530–537. DOI: 10.1038 / s41589-018-0056-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Левин, М.З., Грегорио, Н. Е., Джеветт, М. К., Уоттс, К. Р., и Оза, Дж. П. (2019). Escherichia coli Внеклеточный синтез белка на основе : протоколы для надежной, гибкой и доступной платформенной технологии. J. Vis. Exp. 144: 58882. DOI: 10.3791 / 58882
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лю Д. В., Завада Дж. Ф. и Шварц Дж. Р. (2005). Оптимизация экстракта Escherichia coli S30 для экономичного бесклеточного синтеза белка. Biotechnol.Прог. 21, 460–465. DOI: 10.1021 / bp049789y
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лю В.К., Чжан Л., Чен М. и Ли Дж. (2019). Бесклеточный синтез белка: последние достижения в области источников бактериального экстракта и расширенного применения. Biochem. Англ. J. 141, 182–189. DOI: 10.1016 / j.bej.2018.10.023
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ло Гулло, Г., Маттоссович, Р., Перуджино, Г., Ла Теана, А., Лондей, П., и Бенелли, Д. (2019). Оптимизация системы транскрипции / трансляции in vitro на основе лизата клеток sulfolobussolfataricus. Архей 2019: 9848253. DOI: 10.1155 / 2019/9848253
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лу, Ю., Уэлш, Дж. П., и Шварц, Дж. Р. (2014). Производство и стабилизация тримерного стволового домена гемагглютинина гриппа для потенциально широко защищающих противогриппозных вакцин. Proc. Natl. Акад.Sci. США 111, 125–130. DOI: 10.1073 / pnas.1308701110
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лутц Р. и Бухард Х. (1997). Независимая и жесткая регуляция транскрипционных единиц в Escherichia coli через регуляторные элементы LacR / O, TetR / O и AraC / I1-I2. Nucleic Acids Res. 25, 1203–1210. DOI: 10.1093 / nar / 25.6.1203
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мали, П., Янг, Л., Эсвелт, К. М., Аах, Дж., Гуэль, М., ДиКарло, Дж. Э. и др. (2013). РНК-управляемая инженерия генома человека с помощью Cas9. Наука 339, 823–826. DOI: 10.1126 / science.1232033
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мартин, Р. В., Дес Сой, Б. Дж., Квон, Ю. К., Кей, Дж., Дэвис, Р. Г., Томас, П. М. и др. (2018). Бесклеточный синтез белка из геномно перекодированных бактерий позволяет включать в несколько участков неканонические аминокислоты. Nat.Commun. 9: 1203. DOI: 10.1038 / s41467-018-03469-5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Маттеи, Дж. Х., Джонс, О. У., Мартин, Р. Г., и Ниренберг, М. У. (1962). Характеристики и состав кодирующих единиц РНК. Proc. Natl. Акад. Sci. США 48, 666–677. DOI: 10.1073 / pnas.48.4.666
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Merk, H., Rues, R. B., Gless, C., Beyer, K., Dong, F., Dötsch, V., и другие. (2015). Биосинтез мембран-зависимых белков в лизатах клеток насекомых: определение лимитирующих параметров для сворачивания и обработки. Biol. Chem. 396, 1097–1107. DOI: 10.1515 / hsz-2015-0105
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Минтон, А. П. (2001). Влияние макромолекулярного скопления и макромолекулярного удержания на биохимические реакции в физиологических средах. J. Biol. Chem. 276, 10577–10580. DOI: 10.1074 / JBC.R100005200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мун, Т. С., Лу, К., Тамсир, А., Стэнтон, Б. К., и Войт, К. А. (2012). Генетические программы, построенные из многоуровневых логических вентилей в отдельных ячейках. Природа 491, 249–253. DOI: 10.1038 / природа11516
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мур, С. Дж., Макдональд, Дж. Т., и Фримонт, П. С. (2017). Бесклеточная синтетическая биология для in vitro Разработка прототипа . Biochem. Soc. Пер. 45, 785–791. DOI: 10.1042 / BST20170011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Морита, Э. Х., Савасаки, Т., Танака, Р., Эндо, Ю., и Коно, Т. (2003). Бесклеточная система зародышей пшеницы — это новый способ проверки сворачивания и функционирования белков. Protein Sci. 12, 1216–1221. DOI: 10.1110 / пс.0241203
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
На, Д., Ю, С. М., Чанг, Х., Пак, Х., Парк, Дж. Х., и Ли, С. Ю. (2013). Метаболическая инженерия Escherichia coli с использованием синтетических малых регуляторных РНК. Nat. Biotechnol. 31, 170–174. DOI: 10.1038 / NBT.2461
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ниренберг, М. В., и Маттеи, Дж. Х. (1961). Зависимость внеклеточного синтеза белка в E. coli от природных или синтетических полирибонуклеотидов . Proc. Natl. Акад. Sci. США 47, 1588–1602.DOI: 10.1073 / pnas.47.10.1588
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Орбан, Э., Провербио, Д., Хабербок, С., Дёч, В., и Бернхард, Ф. (2015). Бесклеточная экспрессия рецепторов, связанных с G-белком. Methods Mol. Биол. 2015, 171–195. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-2230-7_10
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Одзава К., Хедлам М. Дж., Шеффер П. М., Хендерсон Б. Р., Диксон Н. Э. и Оттинг Г. (2004). Оптимизация системы Escherichia coli для бесклеточного синтеза селективно меченных 15N белков для быстрого анализа с помощью ЯМР-спектроскопии. Eur. J. Biochem. 271, 4084–4093. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.2004.04346.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Одзава, К., и Ло, К. Т. (2014). Сайт-специфическое включение неприродных аминокислот в белки путем внеклеточного синтеза белка. Methods Mol. Биол. 1118, 189–203. DOI: 10.1007 / 978-1-62703-782-2_12
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Парди, К., Грин, А. А., Ферранте, Т., Камерон, Д.E., DaleyKeyser, A., Yin, P., et al. (2014). Бумажные синтетические генные сети. Ячейка 159, 940–954. DOI: 10.1016 / j.cell.2014.10.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Парди К., Грин А. А., Такахаши М. К., Брафф Д., Ламберт Г., Ли, Дж. У. и др. (2016). Быстрое и недорогое обнаружение вируса Зика с использованием программируемых биомолекулярных компонентов. Cell 165, 1255–1266. DOI: 10.1016 / j.cell.2016.04.059
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Патель, К.Г., и Шварц, Дж. Р. (2011). Функционализация поверхности вирусоподобных частиц путем прямого конъюгации с использованием химии азид-алкиновых щелчков. Биоконъюг. Chem. 22, 376–387. DOI: 10.1021 / bc100367u
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Патель С., Панчасара Х., Брэддик Д., Гохил Н. и Сингх В. (2018). Синтетические малые РНК: текущее состояние, проблемы и возможности. J. Cell. Biochem. 119, 9619–9639. DOI: 10.1002 / jcb.27252
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Паттенден, Л.К., Мидделберг, А. П., Ниберт, М., Липин, Д. И. (2005). На пути к препаративному и крупномасштабному прецизионному производству вирусоподобных частиц. Trends Biotechnol. 23, 523–529. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2005.07.011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пфлегер Б. Ф., Питера Д. Дж., Смолке К. Д. и Кислинг Дж. Д. (2006). Комбинаторная инженерия межгенных областей в оперонах настраивает экспрессию нескольких генов. Nat. Biotechnol. 24, 1027–1032. DOI: 10.1038 / nbt1226
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Порт, Ф., Чен, Х. М., Ли, Т., и Баллок, С. Л. (2014). Оптимизированные инструменты CRISPR / Cas для эффективной инженерии зародышевой линии и соматического генома в Drosophila . Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, E2967 – E2976. DOI: 10.1073 / pnas.1405500111
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Quast, R. B., Sonnabend, A., Стеч М., Вюстенхаген Д. А. и Кубик С. (2016). Высокопроизводительный бесклеточный синтез человеческого EGFR посредством IRES-опосредованной трансляции белка в формате бесклеточной реакции с непрерывным обменом. Sci. Отчет 6: 30399. DOI: 10.1038 / srep30399
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ren, X., Yang, Z., Xu, J., Sun, J., Mao, D., Hu, Y., et al. (2014). Повышенная специфичность и эффективность системы CRISPR / Cas9 с оптимизированными параметрами sgRNA у Drosophila . Cell Rep. 9, 1151–1162. DOI: 10.1016 / j.celrep.2014.09.044
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рольдао, А., Мелладо, М. К. М., Кастильо, Л. Р., Каррондо, М. Дж., И Алвес, П. М. (2010). Вирусоподобные частицы при разработке вакцины. Expert Rev. Vaccines 9, 1149–1176. DOI: 10.1586 / erv.10.115
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рольф Дж., Розенталь К. и Лютц С. (2019). Применение внеклеточного синтеза белка для ускорения разработки биокатализаторов. Катализаторы 9: 190. DOI: 10.3390 / catal90
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ровнер А.Дж., Хаймович А.Д., Кац С.Р., Ли З., Гроум М.В., Гассавей Б.М. и др. (2015). Перекодированные организмы, сконструированные так, чтобы зависеть от синтетических аминокислот. Nature 518, 89–93. DOI: 10.1038 / nature14095
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рустад, М., Истлунд, А., Маршалл, Р., Жардин, П., и Нуаро, В.(2017). Синтез инфекционных бактериофагов в системе бесклеточной экспрессии на основе E. coli . J. Vis. Опыт . 17: 126. DOI: 10.3791 / 56144
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Салехи, А.С., Смит, М.Т., Беннет, А.М., Уильямс, Дж. Б., Питт, В. Г., и Банди, Б. К. (2016). Бесклеточный синтез белка цитотоксического терапевтического средства против рака: производство онконазы и бесклеточная система с добавлением воды. Biotechnol. J. 11, 274–281. DOI: 10.1002 / биот.201500237
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Салис, Х. М., Мирский, Э. А., Фойгт, К. А. (2009). Автоматизированный дизайн сайтов связывания синтетических рибосом для контроля экспрессии белка. Nat. Biotechnol. 27, 946–950. DOI: 10.1038 / NBT.1568
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Савасаки Т., Огасавара Т., Моришита Р. и Эндо Ю. (2002). Система бесклеточного синтеза белка для высокопроизводительной протеомики. Proc. Natl. Акад. Sci. США 99, 14652–14657. DOI: 10.1073 / pnas.232580399
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Schoborg, J. A., and Jewett, M. C. (2018). «Бесклеточный синтез белка: новая технология для понимания, использования и расширения возможностей биологических систем», в Synthetic Biology: Parts, Devices and Applications , eds C. Smolke, S.Y. Ли, Дж. Нильсен и Г. Стефанопулос (Weinheim: John Wiley and Sons, Inc.), 309–330. DOI: 10.1002 / 9783527688104.ch25
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Schwarz, D., Junge, F., Durst, F., Frölich, N., Schneider, B., Reckel, S., et al. (2007). Препаративная масштабная экспрессия мембранных белков в бесклеточных системах с непрерывным обменом на основе Escherichia coli . Nat. Protoc. 2, 2945–2957. DOI: 10.1038 / nprot.2007.426
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Симидзу, Ю., Иноуэ, А., Томари, Ю., Судзуки, Т., Йокогава, Т., Нисикава, К., и др. (2001). Бесклеточная трансляция, восстановленная очищенными компонентами. Nat. Biotechnol. 19, 751–755. DOI: 10.1038 /
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шин Дж., Жардин П. и Нуаро В. (2012). Репликация генома, синтез и сборка бактериофага Т7 в одной бесклеточной реакции. ACS Synth. Биол. 1, 408–413. DOI: 10.1021 / sb300049p
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шин, Дж., и Нуаро, В. (2012). Набор инструментов для внеклеточной экспрессии E. coli : применение в синтетических генных цепях и искусственных клетках. ACS Synth. Биол . 1, 29–41. DOI: 10.1021 / sb200016s
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ширбагаи, З., и Болхассани, А. (2016). Различные применения вирусоподобных частиц в биологии и медицине: вакцинация и системы доставки. Биополимеры 105, 113–132. DOI: 10.1002 / bip.22759
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Широков, В.А., Симоненко П. Н., Бирюков С. В., Спирин А. С. (2002). «Бесклеточные системы трансляции и реакторы с непрерывным потоком и непрерывным обменом», в Cell-Free Translation Systems , ed A. S. Spirin (Берлин: Springer Nature), 91–107. DOI: 10.1007 / 978-3-642-59379-6_8
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шис, Д. Л., и Беннет, М. Р. (2013). Библиотека синтетических транскрипционных логических элементов И, построенных с использованием мутантов расщепленной РНК-полимеразы Т7. Proc. Natl. Акад.Sci. США 110, 5028–5033. DOI: 10.1073 / pnas.1220157110
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шреста П., Смит М. Т. и Банди Б. К. (2014). Бесклеточное включение неприродных аминокислот с альтернативными энергетическими системами и линейными матрицами экспрессии. N. Biotechnol. 31, 28–34. DOI: 10.1016 / j.nbt.2013.09.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сингх В., Гохил Н., Рамирес Гарсия Р., Брэддик Д. и Фофье К. К. (2018). Последние достижения в технологии редактирования генома CRISPR-Cas9 для биологических и биомедицинских исследований. J. Cell. Biochem. 119, 81–94. DOI: 10.1002 / jcb.26165
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сома, Ю., Цуруно, К., Вада, М., Йокота, А., и Ханаи, Т. (2014). Перенаправление метаболического потока с центрального метаболического пути на синтетический с помощью переключателя метаболизма. Metab. Англ. 23, 175–184. DOI: 10.1016 / j.ymben.2014.02.008
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сова, С. В., Балдеа, М., Контрерас, Л. М. (2014). Оптимизация производства метаболитов с помощью периодических колебаний. PLoS Comput. Биол. 10: e1003658. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1003658
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Стрикер, Дж., Куксон, С., Беннет, М. Р., Мазер, У. Х., Цимринг, Л. С., и Хэсти, Дж.(2008). Быстрый, надежный и настраиваемый генератор синтетических генов. Природа 456, 516–519. DOI: 10.1038 / nature07389
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сан, З. З., Хейс, К. А., Шин, Дж., Кашера, Ф., Мюррей, Р. М., Нуаро, В. (2013). Протоколы для реализации системы бесклеточной экспрессии TX – TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии. J. Vis. Exp. 79: e50762. DOI: 10.3791 / 50762
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Такахаши, М.К., Чаппелл, Дж., Хейс, К. А., Сан, З. З., Ким, Дж., Сингхал, В. и др. (2015a). Быстрая характеристика быстрой динамики генетической схемы РНК с бесклеточными системами транскрипции-трансляции (TX-TL). ACS Synth. Биол. 4, 503–515. DOI: 10.1021 / sb400206c
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Такахаши, М. К., Хейс, К. А., Чаппелл, Дж., Сан, З. З., Мюррей, Р. М., Нуаро, В. и др. (2015b). Характеристика и прототипирование генетических сетей с бесклеточными реакциями транскрипции-трансляции. Методы 86, 60–72. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2015.05.020
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Такай К., Савасаки Т. и Эндо Ю. (2008). Разработка ключевых технологий высокопроизводительного бесклеточного производства белка из экстракта зародышей пшеницы. Adv. Protein Chem. Struct. Биол. 75, 53–84. DOI: 10.1016 / S0065-3233 (07) 75002-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тамсир, А., Табор, Дж. Дж., И Фойгт, К. А. (2011). Надежные многоклеточные вычисления с использованием генетически закодированных вентилей NOR и химических «проводов». Природа 469, 212–215. DOI: 10.1038 / nature09565
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Торинг, Л., Дондапати, С. К., Стеч, М., Вюстенхаген, Д. А., и Кубик, С. (2017). Высокопроизводительное производство «трудноэкспрессируемых» белков в бесклеточной системе с непрерывным обменом на основе лизатов клеток СНО. Sci. Rep. 7: 11710. DOI: 10.1038 / s41598-017-12188-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тран К., Гуррамконда К., Купер М. А., Пилли М., Тарис Дж. Э., Селок Н. и др. (2018). Бесклеточное производство терапевтического белка: экспрессия, очистка и характеристика рекомбинантной стрептокиназы с использованием лизата CHO. Biotechnol. Bioeng. 115, 92–102. DOI: 10.1002 / бит.26439
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цубои, Т., Такео, С., Арумугам, Т. У., Оцуки, Х., и Тории, М. (2010). Система бесклеточного синтеза белка зародышей пшеницы: ключевой инструмент для открытия новых кандидатов на вакцины против малярии. Acta Trop. 114, 171–176. DOI: 10.1016 / j.actatropica.2009.10.024
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цубои Т., Такео С., Ирико Х., Джин Л., Цучимочи М., Мацуда С. и др. (2008). Бесклеточное производство малярийных белков на основе системы зародышей пшеницы для открытия новых вакцин-кандидатов. Заражение. Иммун. 76, 1702–1708. DOI: 10.1128 / IAI.01539-07
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ванита С., Чаубей Н., Гош С. С. и Санпуи П. (2017). Рекомбинантный фактор, стимулирующий колонии макрофагов гранулоцитов человека (hGM-CSF): возможность доставки, опосредованной наночастицами, в иммунотерапии рака. Биоинженерия 8, 120–123. DOI: 10.1080 / 21655979.2016.1212136
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван, Х.Х., Хуанг, П. Ю., Сюй, Г., Хаас, В., Марблстоун, А., Ли, Дж. И др. (2012). Мультиплексный in vivo His-мечение ферментных путей для in vitro мультиферментного катализа в одном горшке. ACS Synth. Биол. 1, 43–52. DOI: 10.1021 / sb3000029
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван, Х. Х., Исаакс, Ф. Дж., Карр, П. А., Сан, З. З., Сюй, Г., Форест, К. Р. и др. (2009). Программирование клеток с помощью мультиплексной геномной инженерии и ускоренной эволюции. Природа 460, 894–898. DOI: 10.1038 / nature08187
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Валлийский, Дж. П., Лу, Й., Хе, X. С., Гринберг, Х. Б., и Шварц, Дж. Р. (2012). Бесклеточное производство тримерных белков головного домена гемагглютинина гриппа в качестве вакцинных антигенов. Biotechnol. Bioeng. 109, 2962–2969. DOI: 10.1002 / бит.24581
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Виганд, Д. Дж., Ли, Х.Х., Остров Н. и Черч Г. М. (2019). Внеклеточная экспрессия белка с использованием быстрорастущей бактерии Vibrio natriegens . J. Vis. Exp. 145, e59495. DOI: 10.3791 / 59495
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уилдинг, К. М., Хант, Дж. П., Вилкерсон, Дж. У., Функ, П. Дж., Свенсен, Р. Л., Карвер, В. К. и др. (2019). Бесклеточный синтез белка на основе E. coli без эндотоксина: Подходы к удалению эндотоксина до экспрессии для производства терапевтических средств против рака по требованию. Biotechnol. J . 14: e1800271. DOI: 10.1002 / biot.201800271
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ворст, Э. Г., Экснер, М. П., Де Симон, А., Шенкельбергер, М., Нуаро, В., Будиса, Н., и др. (2015). Внеклеточная экспрессия с токсичной аминокислотой канаванин. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25, 3658–3660. DOI: 10.1016 / j.bmcl.2015.06.045
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Худший, E.Г., Экснер, М. П., Де Симон, А., Шенкельбергер, М., Нуаро, В., Будиса, Н. и др. (2016). Специфичное для остатков включение неканонических аминокислот в модельные белки с использованием бесклеточной системы транскрипции-трансляции Escherichia coli . J. Vis. Exp. 114: e54273. DOI: 10.3791 / 54273
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ву, Дж. Дж., И Шварц, Дж. Р. (2008). Высокопроизводительное бесклеточное производство интегральных мембранных белков без рефолдинга и детергентов. Biochim. Биофиз. Acta 1778, 1237–1250. DOI: 10.1016 / j.bbamem.2008.01.023
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Янг Дж., Кантер Г., Волошин А., Мишель-Рейделле Н., Велкин Х., Леви Р. и др. (2005). Быстрая экспрессия вакцинных белков для В-клеточной лимфомы в бесклеточной системе. Biotechnol. Bioeng. 89, 503–511. DOI: 10.1002 / bit.20283
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Завада, Дж. Ф., Инь, Г., Штайнер, А. Р., Янг, Дж., Нареш, А., Рой, С. М. и др. (2011). Микромасштаб для увеличения производства бесклеточных цитокинов — новый подход к сокращению сроков разработки продукции белка. Biotechnol. Bioeng. 108, 1570–1578. DOI: 10.1002 / бит.23103
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Земелла А., Торинг Л., Хоффмайстер К. и Кубик С. (2015). Бесклеточный синтез белка: плюсы и минусы прокариотических и эукариотических систем. Chembiochem 16, 2420–2431. DOI: 10.1002 / cbic.201500340
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhu, W., Lei, R., Le Duff, Y., Li, J., Guo, F., Wainberg, M.A., et al. (2015). Система CRISPR / Cas9 инактивирует латентную провирусную ДНК ВИЧ-1. Ретровирология 12, 22. doi: 10.1186 / s12977-015-0150-z
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Зихель, Р., Мимран, А., Керен, А., Барни, А., Стейнбергер-Леви, И., Маркус Д. и др. (2010). Эффективность потенциальной трехвалентной вакцины на основе фрагментов Hc ботулинических токсинов A, B и E, продуцируемых в бесклеточной системе экспрессии. Clin. Вакцина Иммунол. 17, 784–792. DOI: 10.1128 / CVI.00496-09
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Зивин, Дж. А. (2009). Терапия острого инсульта тканевым активатором плазминогена (tPA), одобренная Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). Ann. Neurol. 66, 6–10.DOI: 10.1002 / ana.21750
CrossRef Полный текст | Google Scholar
AlphaFold: решение грандиозной проблемы биологии 50-летней давности
Мы также увидели признаки того, что прогнозирование структуры белка может быть полезным в будущих усилиях по реагированию на пандемию, как один из многих инструментов, разработанных научным сообществом. Ранее в этом году мы предсказали несколько белковых структур вируса SARS-CoV-2, включая ORF3a, структура которого ранее была неизвестна. В CASP14 мы предсказали структуру другого белка коронавируса, ORF8.Впечатляюще быстрая работа экспериментаторов подтвердила структуры как ORF3a, так и ORF8. Несмотря на их сложный характер и наличие очень небольшого количества связанных последовательностей, мы достигли высокой степени точности обоих наших прогнозов по сравнению с их экспериментально определенными структурами.
Мы не только ускоряем понимание известных болезней, но и рады возможности этих методов исследовать сотни миллионов белков, для которых у нас в настоящее время нет моделей, — обширную территорию с неизвестной биологией.Поскольку ДНК определяет аминокислотные последовательности, которые составляют структуры белков, революция в геномике сделала возможным считывание последовательностей белков из естественного мира в массовом масштабе — с 180 миллионами последовательностей белков и подсчетом в базе данных Universal Protein (UniProt). Напротив, учитывая экспериментальную работу, необходимую для перехода от последовательности к структуре, только около 170 000 белковых структур находятся в банке данных о белках (PDB). Среди неопределенных белков могут быть некоторые с новыми интересными функциями, и — так же, как телескоп помогает нам заглянуть глубже в неизвестную вселенную — такие методы, как AlphaFold, могут помочь нам найти их.
Открывая новые возможности
AlphaFold — одно из наших самых значительных достижений на сегодняшний день, но, как и во всех других научных исследованиях, есть еще много вопросов, на которые нужно ответить. Не всякая структура, которую мы прогнозируем, будет идеальной. Еще многое предстоит узнать, в том числе о том, как несколько белков образуют комплексы, как они взаимодействуют с ДНК, РНК или небольшими молекулами, и как мы можем определить точное местоположение всех боковых цепей аминокислот. В сотрудничестве с другими можно многое узнать о том, как лучше всего использовать эти научные открытия при разработке новых лекарств, о способах управления окружающей средой и многом другом.
Для всех нас, работающих над вычислительными методами и методами машинного обучения в науке, такие системы, как AlphaFold, демонстрируют потрясающий потенциал ИИ как инструмента, способствующего фундаментальным открытиям. Подобно тому, как 50 лет назад Анфинсен поставил задачу, выходящую за пределы возможностей науки в то время, многие аспекты нашей Вселенной остаются неизвестными. Объявленный сегодня прогресс вселяет в нас уверенность в том, что ИИ станет одним из самых полезных инструментов человечества в расширении границ научных знаний, и мы с нетерпением ждем впереди многих лет упорной работы и открытий!
Пока мы не опубликуем статью об этой работе, пожалуйста, цитируйте:
Высокоточное прогнозирование структуры белка с использованием глубокого обучения
Джон Джампер, Ричард Эванс, Александр Прицель, Тим Грин, Майкл Фигурнов, Кэтрин Туньясувунакул, Олаф Роннебергер, Расс Бейтс, Огюстин Жидек, Алекс Бриджленд, Клеменс Мейер, Саймон А.А. Коль, Анна Потапенко, Эндрю Дж. Баллард, Эндрю Ромера, Бернардино -Паредес, Станислав Николов, Ришуб Джейн, Йонас Адлер, Тревор Бэк, Стиг Петерсен, Дэвид Рейман, Мартин Штайнеггер, Михалина Пачольска, Дэвид Сильвер, Ориол Виньялс, Эндрю У. Старший, Корай Кавукчуоглу, Пушмит Кохли, Демис Хассабис.
В «Четырнадцатой критической оценке методов прогнозирования структуры белка» (тезисы), 30 ноября — 4 декабря 2020 г. Получено отсюда.
Мы находимся в самом начале изучения того, как лучше всего дать возможность другим группам использовать наши предсказания структуры, наряду с подготовкой рецензируемой статьи для публикации. Хотя наша команда не сможет ответить на все запросы, если AlphaFold может иметь отношение к вашей работе, отправьте несколько строк об этом по адресу alphafold @ deepmind.com. Мы свяжемся с вами, если появятся возможности для дальнейшего изучения.
Новая общедоступная база данных структур белков, предсказанных искусственным интеллектом, может изменить биологию | Наука
На прошлой неделе две группы представили кульминацию многолетней работы компьютерных ученых, биологов и физиков: передовые программы моделирования, которые могут предсказывать точные трехмерные атомные структуры белков и некоторых молекулярных комплексов. И вот теперь пришла самая большая отдача от этой работы. Одна из этих команд сообщает, что сегодня она использовала свои недавно созданные программы искусственного интеллекта (ИИ) для расшифровки структур 350 000 белков человека и 20 модельных организмов, таких как бактерии Escherichia coli, бактерии, дрожжи и плодовые мухи, все основные составляющие биологии. исследовать.В ближайшие месяцы группа заявляет, что планирует расширить свой список смоделированных белков, чтобы охватить все каталогизированные белки, около 100 миллионов молекул.
«Это ошеломляет», — говорит Джон Моулт, эксперт по фолдингу белков из Университета Мэриленда в Шейди-Гроув, проводящий раз в два года конкурс под названием «Критическая оценка предсказания структуры белка» (CASP). Моулт говорит, что структурные биологи десятилетиями мечтали о том, что точные компьютерные модели однажды увеличат чрезвычайно точные формы белков, полученные с помощью экспериментальных методов, таких как рентгеновская кристаллография.«Я никогда не думал, что мечта осуществится», — говорит Моулт.
Компьютерная модель под названием AlphaFold — это работа исследователей DeepMind, британской компании по искусственному интеллекту, принадлежащей Alphabet, материнской компании Google. Осенью 2020 года AlphaFold опередила конкурентов CASP, получив средний балл точности 92,4 из 100, что значительно опережает следующего ближайшего конкурента. Но поскольку исследователи DeepMind не раскрыли деталей теоретического картирования форм белков, в частности, лежащего в основе компьютерного кода AlphaFold, другие команды остались разочарованными и не смогли развить прогресс.Это начало меняться на прошлой неделе. 15 июля исследователи под руководством Минкьюнга Бэка и Дэвида Бейкера из Вашингтонского университета в Сиэтле сообщили в Интернете в Science , что они создали программу высокоточного прогнозирования структуры белка под названием RoseTTAFold, которую они опубликовали. В тот же день компания Nature сообщила подробности AlphaFold в статье исследователей DeepMind во главе с Демисом Хассабисом и Джоном Джампером.
Обе программы используют ИИ для выявления закономерностей сворачивания в огромных базах данных решенных белковых структур.Программы вычисляют наиболее вероятную структуру неизвестных белков, также учитывая основные физические и биологические правила, регулирующие взаимодействие соседних аминокислот в белке. В своей статье Бэк и Бейкер использовали RoseTTAFold для создания структурной базы данных сотен рецепторов, связанных с G-белком, класса обычных мишеней для лекарств.
Теперь исследователи DeepMind сообщают в Nature о создании 350 000 предсказанных структур — более чем в два раза больше, чем было решено ранее экспериментальными методами.Исследователи говорят, что AlphaFold произвела структуры почти для 44% всех белков человека, покрывая почти 60% всех аминокислот, кодируемых геномом человека. AlphaFold определила, что многие другие человеческие белки «неупорядочены», то есть их форма не принимает единую структуру. Такие неупорядоченные белки могут в конечном итоге принять структуру, когда они связываются с белком-партнером, говорит Бейкер. Они также могут естественным образом принимать множественные конформации, говорит Дэвид Агард, структурный биолог из Калифорнийского университета в Сан-Франциско.
База данных новых предсказаний DeepMind в отношении белков, собранная совместно с сотрудниками Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL), находится в свободном доступе в Интернете. «Замечательно, что они сделали это доступным», — говорит Бейкер. «Это действительно увеличит темпы исследований».
Поскольку трехмерная структура белка в значительной степени определяет его функцию, библиотека DeepMind может помочь биологам разобраться, как тысячи неизвестных белков выполняют свою работу. «Мы в EMBL считаем, что это изменит понимание того, как устроена жизнь», — говорит генеральный директор лаборатории Эдит Херд.
СотрудникиDeepMind говорят, что AlphaFold2 уже стимулировал разработку новых ферментов, которые расщепляют пластик в окружающей среде быстрее, чем те, что были обнаружены ранее, и открыли новые возможности для лекарств для лечения забытых болезней. «Это будет один из самых важных наборов данных с момента картирования генома человека», — говорит Эван Бирни, директор Европейского института биоинформатики EMBL.
Скорее всего, удары на этом не прекратятся. Прогнозы помогут экспериментаторам, решающим конструкции, говорит Бэк.Данные экспериментов по рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии могут быть трудными для интерпретации, говорят Бэк и другие, и наличие модели может помочь. «В краткосрочной перспективе это увеличит усилия по определению структуры», — прогнозирует она. «И со временем он также будет постепенно заменять [экспериментальные] усилия по определению структуры».
Если это произойдет, структурные биологи не останутся без работы. Бейкер отмечает, что как экспериментаторы, так и ученые-вычислители уже начинают направлять свои усилия на решение более сложной задачи — понять, какие именно белки взаимодействуют друг с другом и какие молекулярные изменения происходят во время этих взаимодействий.«Это приведет к перезагрузке поля», — говорит Бейкер. «Это очень захватывающее время».
Биология белков
Белки — незаменимые реагенты, которые используются в самых разных областях, включая диагностические инструменты, вакцины, терапевтические средства и ферменты. Знание свойств и функций белков имеет решающее значение для нашего понимания химических и биологических процессов. В этом контексте очищенные белки являются отправной точкой для биофизической и биохимической характеристики белков, поскольку они могут помочь в функциональном выяснении.Проблемы в производстве и очистке белка привели к разработке разнообразных систем экспрессии, технологий и инструментов, облегчающих работу. GenScript предлагает множество услуг и продуктов, которые упростят экспрессию и описание белков, улучшат наше понимание белков и будут способствовать открытию новых границ в биологии белков.
| Синтез генов Совершенные белки происходят из совершенных генов. Получите гены с точной последовательностью на 100% с помощью служб синтеза генов GenScript. | Оптимизация кодонов Увеличьте вероятность экспрессии растворимого белка с помощью нашего усовершенствованного, запатентованного и полностью бесплатного алгоритма оптимизации кодонов. | |
| ORF Белковые гены, готовые к экспрессии. Избавьтесь от хлопот традиционного клонирования. | Экспрессия бактериального белка Платформа высокого уровня экспрессии для белков или белковых субъединиц (антигенов), которые не требуют посттрансляционной модификации. | |
| Экспрессия белка млекопитающих Службы временной и стабильной экспрессии для млекопитающих доставляют высококачественные белки и рекомбинантные антитела (rAbs) от микрограммов до граммов. | Насекомое выражение Универсальная система экспрессии эукариотического белка для производства высококачественного белка. Особенно подходит для больших белков и киназ. | |
| Дрожжевой экспрессии Экономичный подход к производству высококачественного эукариотического белка. | Характеристика белков Комплексные услуги по характеризации белков гарантируют качество и целостность каждой партии белка, выходящей из GenScript. | |
| Белковые продукты GenScript предлагает широкий спектр предварительно созданных рекомбинантных белков и белковых продуктов, включая векторы экспрессии белков, смолы для выделения и очистки белков, магнитные шарики, гели, белковые маркеры и многое другое. |
Ресурсы по биоинформатике для белковой биологии
Знаете ли вы о широком спектре ресурсов данных о белках, к которым можно легко получить доступ и изучить для улучшения ваших исследований? Хотите узнать больше о последовательности вашего белка и его функциях? Интересно, существует ли структура вашего белка и как ее исследовать? Хотите узнать больше о потенциальных комплексах и путях реакций, в которых участвует ваш интересующий белок, что даст вам лучшее представление о его биологическом контексте? Этот короткий виртуальный курс познакомит вас с ресурсами данных и инструментами, разработанными EMBL-EBI, которые могут помочь вам в изучении белков.
Этот курс будет проходить с понедельника 21 по среду 23 февраля и в среду 2 марта. В течение первых трех дней вы узнаете, как теоретически просматривать, извлекать и использовать данные о белках EMBL-EBI. Те, кто хочет узнать больше о программном доступе к ресурсам белка EMBL-EBI, могут посетить дополнительный раздел по этой теме во вторник днем. Чтобы получить представление о концепции веб-сервисов и о том, как вы можете использовать их для доступа к инструментам и данным, доступным на EMBL-EBI, просмотрите наш вебинар.
Затем вам будут предоставлены упражнения для каждого ресурса, над которым вы будете работать самостоятельно на следующей неделе, с возможностью удаленной поддержки тренера, если это необходимо. Мы еще раз встретимся в среду, 2 марта, чтобы более подробно обсудить проблемы, возникшие при проработке материала.
Всех участников попросят предварительно записать короткую презентацию (три минуты) о своей исследовательской работе в рамках курса. Это даст возможность поделиться своим исследованием с другими участниками и предоставит форум для обсуждения.Более подробная информация будет предоставлена участникам после закрытия регистрации.
Мероприятие будет виртуальным и будет проводиться через Zoom, с дополнительным текстовым сообщением через Slack. Чтобы получить максимальную отдачу от курса, вы должны убедиться, что на протяжении всего курса у вас есть стабильное подключение к Интернету.
Для кого этот курс?
Этот курс предназначен для всех, кто хочет больше узнать о биологии белков.Предварительный опыт в биоинформатике не требуется, но участники должны иметь представление о биологии на уровне бакалавриата.
Тем, кто желает посетить занятия по программному доступу, будут полезны предварительные знания кодирования / программирования. Чтобы получить представление о концепции веб-сервисов и о том, как вы можете использовать их для доступа к инструментам и данным, доступным на EMBL-EBI, просмотрите наш вебинар.
Что я узнаю?
Результаты обучения
После этого курса вы должны уметь:
- Получите доступ к ряду подходящих белковых ресурсов и изучите их
- Используйте эти ресурсы для получения релевантной информации о белках
- Примените информацию, которую вы обнаружили в своем исследовании
Содержание курса
В ходе этого курса вы узнаете о:
- UniProtKB, InterPro, HMMER, Pfam
- PDBe, AlphaFold DB, EMDB и EMPIAR
- IntAct, Комплексный портал, Reactome
- Программный доступ к EMBL-EBI
Кроссовки
Александра Холински
EMBL-EBI
Россана Зару
EMBL-EBI
Хема Бай-А-Джи
EMBL-EBI
Дэвид Армстронг0
Дэвид Армстронг
EMBL
Nandana Madhusoodanan
EMBL-EBI
Typhaine Paysan-Lafosse
EMBL-EBI
Sara Rocio Chuguransky
EMBL703 EBI
Часовой пояс GMT
| Время | Субъект | Тренажер |
| День 1 — понедельник 21 февраля 2022 года | ||
| 10.00-10.30 | Добро пожаловать | Александра Холински |
| 10.30-11.30 | Ледокол | Александра Холински |
| 11.30-12.30 | UniProt | Россана Зару, Хема Бай-А-Джи |
| 12.30-13.30 | Перерыв | |
| 13.30-15.00 | Классификация последовательностей (Pfam, InterPro) | Typhaine Paysan-Lafosse, Сара Чугуранская |
| День 2 Вторник 22 февраля 2022 года | ||
| 9,45-10,00 | Начало учебного дня — мероприятие | Александра Холински |
| 10.00-11.30 | PDBe | Дэвид Армстронг |
| 11.30-11.45 | Перерыв | |
| 11,45-12,15 | AlphaFold DB | TBC |
| 12,15-13,15 | EMDB и EMPIAR | Осман Салих |
| 13,15-14,00 | Перерыв | |
| Следующая деталь не является обязательной. В следующей части мы представим введение в программный доступ к выбранным белковым ресурсам EMBL-EBI | ||
| 14.00-14.30 | Общее введение в программный доступ | Нандана Мадхусуданан |
| 14.30-15.00 | UniProt | Россана Зару, Хема Бай-А-Джи |
| 15.00-15.30 | Перерыв | |
| 15.30-16.00 | ИнтерПро | Typhaine Paysan-Lafosse, Сара Чугуранская |
| 16.00-16.30 | PDBe | Дэвид Армстронг |
| День 3 — среда, 23 февраля 2022 г. | ||
| 9,45-10,00 | Начало учебного дня — мероприятие | |
| 10.00-11.00 | Молекулярные взаимодействия | Калпана Паннеерселвам |
| 11.00-11.15 | Перерыв | |
| 11,15-12,00 | Продолжение молекулярных взаимодействий | Калпана Паннеерселвам |
| 12.00-13.00 | Перерыв | |
| 13.00-14.30 | Reactome | Элиот Рагено |
| 14.30-15.00 | Заключение и отзывы | Александра Холински |
| Вопросы, ответы и размышления — среда, 2 марта | ||
| 10,00-10,15 | Добро пожаловать | Александра Холински |
| 10.15-10.45 | Вопросы и ответы — UniProt | Россана Зару, Хема Бай-А-Джи |
| 10,45-11,00 | Перерыв | |
| 11.00-11.30 | Вопросы и ответы — Классификация последовательностей | Typhaine Paysan-Lafosse, Сара Чугуранская |
| 11.30-12.30 | Вопросы и ответы — Белковые структуры | Дэвид Армстронг, Осман Салих |
| 12.30-13.30 | Перерыв | |
| 13.30-14.00 | Вопросы и ответы — Молекулярные взаимодействия | Калпана Паннеерселвам |
| 14.00-14.30 | Вопросы и ответы — Reactome | Элиот Рагенау |
| 14.30-14.45 | Подведение итогов и отзывы | Александра Холински |
| 14.45-15.00 | Перерыв | |
| 15.00-16.00 | Дополнительный круглый стол — присоединяйтесь к любому преподавателю, чтобы задать дополнительные вопросы | Все |
Посещаемость этого курса распределяется в порядке очереди. Пожалуйста, заполните онлайн-форму заявки для регистрации.
Вы должны указать, желаете ли вы присутствовать на дополнительных занятиях во вторник, 22 февраля, во второй половине дня.
Регистрация завершится в пятницу 7 января, поэтому, пожалуйста, зарегистрируйтесь как можно скорее. После того, как вы зарегистрируетесь, вы сможете обновить свою регистрацию с помощью записи flash-разговора и слайдов до пятницы, 4 февраля.
Биология белков делает гигантский скачок в будущее
Геном содержит инструкции по созданию и поддержанию организма, но большинство физиологических функций связаны с тем, в какие гены транслируются — белки.Каждая клетка содержит белки, которые придают ей идентичность и позволяют ей выполнять свою работу, и все эти тысячи белков должны работать вместе в тщательно скоординированном взаимодействии. Когда возникают проблемы с белками, это приводит к заболеванию, поэтому важно понимать структуру и функцию белков, чтобы понять и лечить болезнь.
Последовательность гена транскрибируется в РНК, затем модифицируется перед трансляцией клеточным механизмом в последовательность аминокислот.Эти аминокислотные цепочки затем обрабатываются клеточными органеллами и тщательно складываются в трехмерную структуру. Следовательно, структура белка не сразу очевидна из его последовательности, и раньше требовалась длительная и кропотливая работа, чтобы ее расшифровать.
Новая работа продвинула исследования белков вперед с созданием инструмента, который может точно предсказать структуру белка, используя только его последовательность. Сотни исследователей работали вместе над созданием программы искусственного интеллекта (ИИ) под названием AlphaFold.Об этой работе было объявлено на 14-м общественном эксперименте по критической оценке методов прогнозирования структуры белка (CASP14).
«Белки — это чрезвычайно сложные молекулы, и их точная трехмерная структура является ключом ко многим функциям, которые они выполняют, например к инсулину, который регулирует уровень сахара в нашей крови, и антителам, которые помогают нам бороться с инфекциями. Даже крошечные перестройки этих жизненно важных «молекулы могут иметь катастрофические последствия для нашего здоровья, поэтому один из наиболее эффективных способов понять болезнь и найти новые методы лечения — это изучить вовлеченные белки», — сказал председатель CASP14 д-р.Джон Моулт из Университета Мэриленда.
«Существуют десятки тысяч белков человека и многие миллиарды белков других видов, включая бактерии и вирусы, но определение формы только одного требует дорогостоящего оборудования и может занять годы», — добавил Молт.
В этой работе исследователи основывались на CASP13, созданном в 2018 году. Лаборатория искусственного интеллекта DeepMind обучила систему нейронной сети, которая интерпретирует пространственный граф, представляющий белок. Эти пространственные графики помогают определить взаимодействия между различными частями одного белка.Программа была обучена с использованием общедоступных данных о примерно 170 000 белковых структур, что позволило AlphaFold делать прогнозы относительно новых белковых структур.
«То, чего удалось достичь команде DeepMind, является фантастическим и изменит будущее структурной биологии и исследований белков. После десятилетий изучения белков, молекул, которые обеспечивают структуру и функции всех живых существ, я проснулся сегодня утром, чувствуя этот прогресс «, — сказала профессор Дам Джанет Торнтон, почетный директор и старший научный сотрудник EMBL-EBI.
«Поразительно точные модели AlphaFold позволили нам решить структуру белка, на которой мы застряли почти десять лет, возобновив наши усилия по пониманию того, как сигналы передаются через клеточные мембраны», — сказал профессор Андрей Лупас, директор Института Макса Планка. Биология развития.
«Я чуть не упал со стула, когда увидел эти результаты. Я знаю, насколько строгим является CASP — он в основном гарантирует, что компьютерное моделирование должно выполнять сложную задачу сворачивания белков ab-initio.Было унизительно видеть, что эти модели могут делать это так точно.
